『壹』 檢測基因表達水平差異的方法有哪些
基因的表達是dna-rna-蛋白,期間有轉錄水平調控、轉錄後調控、翻譯後調控等多種調控機制影響該基因的表達.
所以蛋白水平高低的原因就可能是多方面的.蛋白表達多,可能是mrna多,也可能mrna變化不大,而是翻譯多了；蛋白表達少,原因亦然.
從2個水平檢測一個基因的表達,可以更全面地了解該基因在該組織某個時期或某種條件下的變化受到什麼水平的調控.
所謂基因表達,就是從dna到mrna再到蛋白的一個過程,基因表達水平一般是通過該基因轉錄的mrna的多少來衡量的.
每個基因轉錄產生的mrna的量,是受到時空等多種因素調控的,個體在不同的生長發育階段,或者不同的組織水平,基因轉錄出mrna的量都是不一樣的.
例如,當某種植物長期生長在高鹽的環境里,該植物體內與抗鹽相關的基因的表達量就會增加,以適應這種高鹽環境,是植物能夠生存下來,這時植物抗鹽相關的基因表達水平就相對高
檢測基因表達的方法：
轉錄水平檢測：rt-pcr，real-time pcr，northern blot
翻譯水平檢測：western blot
還有直接檢測，如報告基因、融合熒光蛋白等。
rt-pcr是反轉錄pcr，是半定量方式。real-time pcr可以精確定量。 二者不同。後者為了區別於rt-pcr，一般不縮寫。
各位觀眾老爺們大家好!我是吆五，打算從今以後不定期分享一些生物類的專業知識。
一方面供自己學習積累，另一方面也希望對大家有所幫助。
生物是很枯燥的呢
『貳』 怎麼判斷差異表達的基因
判斷差異表達的基因常用的分析方法有三類，第一類稱之為倍數分析，計算每一個基因在兩個條件下的 Ratio 值，若大於給定閾值，則為表達差異顯著的基因;第二類方法採用統計分析中的 t 檢驗和方差分析，計算表達差異的置信度，來分析差異是否具有統計顯著性;第三類是建模的方法，通過確定兩個條件下的模型參數是否相同來判斷表達差異的顯著性，例如貝葉斯方法。
『叄』 怎麼判斷差異表達的基因
真核生物中，從個體的生長、發育、衰老、死亡，到組織的得化、調亡以及細胞對各種生物、理化因子的應答，本質上都涉及基因的選擇性表達。高等生物大約有30000個不同的基因，但在生物體內任意8細胞中只有10%的基因的以表達，而這些基因的表達按特定的時間和空間順序有序地進行著，這種表達的方式即為基因的差異表達。其包括新出現的基因的表達與表達量有差異的基因的表達。生物體表現出的各種特性，主要是由於基因的差異表達引起的。
由於基因的差異表達的變化是調控細胞生命活動過程的核心機制，通過比較同一類細胞在不同生理條件下或在不同生長發育階段的基因表達差異，可為分析生命活動過程提供重要信息。研究基因差異表達的主要技術有差別雜交（differential hybridization）、扣除（消減）雜交（subtractive hybridization of cDNA，SHD）、mRNA差異顯示（mRNA differential display， DD）、抑制消減雜交法（suppression subtractive hybridization，SSH）、代表性差異分析（represential display analysis，RDA）、交互扣除RNA差別顯示技術（reciprocal subtraction differential RNA display）、基因表達系列分析（serial analysis of gene expression，SAGE）、電子消減（electronic subtraction）和DNA微列陣分析（DNA microarray）等。
一、差別雜交與扣除雜交
差別雜交（differential hybridization）又叫差別篩選（differential screening），適用於分離經特殊處理而被誘發表達的mRNA的cDNA克隆。為了增加這種方法的有效性，後來又發展出了扣除雜交（subtractive hybridization）或扣除cDNA克隆（subtractive cDNA cloning），它是通過構建扣除文庫（subtractive library）得以實現的。
（一）差別雜交
從本質上講，差別雜交也是屬於核酸雜交的范疇。它特別適用於分離在特定組織中表達的基因、在細胞周期特定階段表達的基因、受生長因子調節的基因、以及在特定發育階段表達的或是參與發育調節的基因，同時亦可有效地用來分離經特殊處理而被誘發表達的基因。目前，差別雜交篩選法在克隆基因的分離工作中有著相當廣泛的用途。
差別雜交的技術基礎十分簡單，它不需要任何有關的目的基因的核苷酸序列信息，而重要的是耍擁有兩種不同的細胞群體：在一個細胞群體中目的基因正常表達，在另一個細胞群體中目的基因不表達。在這種情況下便可制備到兩種不同的mRNA提取物。其一是含有一定比例的目的基因mRNA類型的總mRNA群體，其二是不含有目的基因mRNA類型的總mRNA群體。因此，可以通過這兩種總mRNA（或是它們的cDNA拷貝）為探針的平行雜交，對由表達目的基因的細胞總mRNA構建的克隆庫進行篩選。當使用存在目的基因的mRNA探針時，所有包含著重組體的菌落都呈陽性反應，在X光底片上呈現黑色斑點，而使用不存在目的基因的mRNA探針時，除了含有目的基因的菌落外，其餘的所有菌落都呈陽性反應，在X光底片上呈現黑色斑點。比較這兩種底片並對照原平板，便可以挑選出含目的基因的菌落，供作進一步研究使用。
差別雜交篩選技術已被成功地用於分析爪蟾和粘菌的發育問題。這兩個應用例子表明，處於不同發育狀態或階段的豐度相差5倍的特異的mRNA種是能夠被檢測出來的。生長因子調節基因（growth factor-regulated gene）的克隆，是差別雜交成功應用的一個典型例子。我們知道，血清中含有生長因子，因此用血清處理處於靜止期的細胞時，便會迅速誘發生長因子調節基因進行表達。所以，分別從靜止期細胞培養物和經血清激活3小時的細胞培養物中提取的poly(A)mRNA制劑，在mRNA種類上是有差別的，至少後者比前者多出了一種生長因子調節基因的mRNA類型。用從激活細胞中分離的poly(A)mRNA反轉錄合成的cDNA與λ噬菌體載體重組，構成cDNA文庫，並同時復制兩份硝酸纖維素濾膜。A組濾膜同血清激活細胞制備的cDNA探針雜交，B組濾膜同靜止期細胞制備的cDNA探針雜交。將所得的放射自顯影圖片進行仔細的比較，從中鑒定出只同激活細胞探針雜交而不能同靜止期細胞探針雜交的噬菌斑位置。這些克隆便有可能是帶有受血清誘發表達的生長因子調節基因的DNA編碼序列。
（二）扣除雜交
差別雜交可有效地對於因特殊處理而被誘發產生的mRNA的cDNA克隆的分離，或是在細胞中具高表達效率的mRNA之cDNA克隆的分離，但對於低豐度的mRNA的cDNA克隆的分離則有相當的困難。為了進一步提高差別雜交的篩選效率，一種切實可行的辦法是應用扣除雜交篩選法構建富含目的基因序列的cDNA文庫。
扣除雜交法的本質是除去那些普遍共同存在的、或是非誘發產生的cDNA序列，從而使待分離的目的基因的序列得到有效的富集，提高了分離的敏感性。下面以T細胞受體（T-cell receptor，TCR有時亦稱之為T細胞抗原受體）編碼基因的分離為例子，說明扣除雜交篩選法的基本原理與簡要過程。T細胞和B細胞來自共同的前體細胞，兩者都能夠識別特異的抗原。但與B細胞不同，T細胞不能識別游離的抗原，而只能識別在其它細胞表面的抗原。T細胞的這種抗原識別特異性是由TCR基因決定的。TCR基因只能在T細胞中表達，而不能在B細胞中表達。那麼從T細胞mRNA制備來的單鏈cDNA，同大大超量的B細胞的mRNA在有利於發生DNA-RNA雜交的條件下保溫，其結果會是所有的能夠在T和B兩類細胞中同時表達的T細胞基因的cDNA分子（約佔98％），都能與B細胞的mRNA退火形成DNA-RNA雜交分子，而不能在B細胞中表達的、T細胞特有的cDNA（約佔2％），由於B細胞中沒有相應的mRNA，故不能形成DNA-RNA雜交分子，仍然處於單鏈的狀態。將此種雜交混合物通過羥基磷灰石柱（hydroxylapatite column），於是DNA-RNA雜交分子便結合在柱上，而游離的單鏈cDNA則過柱流出。回收到的T細胞特異的cDNA被轉變為雙鏈cDNA之後，與適當的λ噬菌體載體重組並轉染給大腸桿菌寄主細胞，這樣便得到了T細胞特異cDNA高度富集的扣除文庫。然後再按照同樣方法制備扣除的cDNA探針，即被B細胞mRNA雜交扣除了的T細胞特異的cDNA探針，篩選文庫，可成功地分離到了T細的TCR基因。
扣除雜交法同樣也可以用來分離缺失突變基因。從野生型植株制備的染色體總DNA，用一種適當的核酸內切限制酶（比如Sau3A）切割成小片段。同時從缺失突變體植株制備的染色體總DNA，經隨機切割之後，用生物素（biotin）進行標記，作為非同位素標記探針使用。取大大超量的此種探針，同Sau3A酶切的野生型染色體總DNA片段混合，經變性、退火處理，溶液中的無生物素標記的野生型的DNA分子便同生物素標記的突變型的DNA探針雜交。將雜交反應混合物通過生物素結合蛋白質柱（avidin column）。這種柱是用包裹著生物素結合蛋白質的專用的細小磁珠裝填的。大部分野生型植株的DNA分子都同突變型植株的生物素標記的DNA探針雜交，便被結合到柱上。而野生型植株的DNA片段由於在突變型DNA中缺失了相應的片段，故沒有相應的生物素標記的探針與之雜交，經洗脫便過柱流出。隨後將洗脫收集的DNA同超量的生物素標記探針再雜交，再過柱。如此經過多次重復富集之後，用PCR法擴增DNA片段，並予以克隆。最後用Southern雜交法進一步鑒定出，只同野生型DNA雜交而不能同突變型DNA雜交的含有突變基因的陽性克隆。
『肆』 RNA-seq中的基因表達量計算和表達差異分析
原文鏈接： RNA-seq中的基因表達量計算和表達差異分析-生物知識學習 (biotechknowledgestudy.com)
差異分析的步驟：
1）比對；
2） read count計算；
3） read count的歸一化；
4）差異表達分析；
背景知識：
1）比對：
普通比對： BWA，SOAP
開大GAP比對：Tophat（Bowtie2）；
2） Read count(多重比對的問題）：
丟棄
平均分配
利用Unique region估計並重新分配
表達量計算的本質
目標基因表達量相對參照系表達量的數值。
參照的本質：
（ 1）假設樣本間參照的信號值應該是相同的；
（ 2）將樣本間參照的觀測值校正到同一水平；
（ 3）從參照的數值，校正並推算出其他觀測量的值。
例如：Qpcr:目標基因表達量（循環數）相對看家基因表達量（循環數）；RNA-seq:目標基因的表達量（測序reads數），相對樣本RNA總表達量（總測序量的reads數），這是最常用的標准。
歸一化的原因及處理原則：
1）基因長度
2）測序量
3）樣本特異性（例如，細胞mRNA總量，污染等）前兩者使用普通的RPKM演算法就可以良好解決，關鍵是第三個問題，涉及到不同的演算法處理。
RNA-Seq歸一化演算法的意義：
基因表達量歸一化：在高通量測序過程中，樣品間在數據總量、基因長度、基因數目、高表達基因分布甚至同一個基因的不同轉錄本分布上存在差別。因此不能直接比較表達量，必須將數據進行歸一化處理。
RNA-seq差異表達分析的一般原則
1）不同樣品的基因總表達量相似
2）上調差異表達與下調差異表達整體數量相似（上下調差異平衡）
3）在兩組樣品中不受處理效應影響的基因， 表達量應該是相近的（差異不顯著）。
4）看家基因可作為表達量評價依據（ 待定）
不同的演算法比較：
以什麼數值來衡量表達量：RPKM、FPKM、TPM
以什麼作為參照標准：TMM（edgeR軟體）、De seq矯正
RPKM：是Reads Per Kilobase per Million mapped reads的縮寫，代表每百萬reads中來自於某基因每千鹼基長度的reads數。
本質：1）以reads數為計算單位；
2）對基因長度（基因間的比較）和總數據量（樣本間的比較）做矯正；
1）由於可變剪切，同一基因有效轉錄區域長度未必相同（這個一般情況下可以不考慮，了解一下：Cufflinks軟體考慮了這個問題）優化策略：外顯子或轉錄本水平的表達量分析。
2） 使用reads數計算基因表達量有輕微誤差（這里暫不展開，主要了解一下定義）優化策略：FPKM或 TPM
3） mRNA的總量未必相等。
RPKM的優化：FPKm
F = Fragment，即測序片段數量。這些片段都是從完整的cDNA打碎而來的；
本質：以文庫中的片段數量為計算單位在Paired-end測序中，一個fragment就是兩條PE reads構成的片段。由於是PE比對，理論上比SE比對更可靠。
T = Transcripts
本質：以轉錄本的條數為計算單位。使用轉錄本的條數（或者說：轉錄本的測序深度），代替reads數，在一定條件下定量更准，尤其樣本間表達基因總數差異很大的時候（例如，對照樣本有1萬個基因表達，另外處理組僅有4000個基因表達）。
mRNA總量未必相等
mRNA總量不等——細胞本身不同
例如：活躍組織vs休眠的組織；癌細胞vs正常細胞
mRNA總量不等——污染
例如：核糖體污染外源RNA污染
解決方法——不同演算法比較
其中歸一化演算法介紹：
1）Total Count（TC）：總reads數矯正
2）Upper Quartile（UQ）：上四分之一分位數（總reads）
矯正
3）Median（Med）；中位數（總reads數）矯正
4）Quantile (Q)：基因晶元軟體limma中的校正演算法；
5）RPKM：總reads數，但引入了基因長度
6）幾何平均數：Deseq軟體中的演算法；
7）TMM：edgeR軟體中的演算法；
8）RPKM
邏輯1：不同位置數值的穩定性不同
四分位數quartile:將數據按從小到大排列，並分成四等分，這樣得到3個分割點，第一個分割點叫做lowerquartile，第二個叫Media，第三個叫Upper quartile
很顯然，極大值具有極大不穩定性，而且可能會顯著影
響總體之和（假設，我們之中有個馬雲，我們的總收入
有什麼變化？）
所以，Upper quartile和Median的數值，比總表達量之
和更加穩定，更適合作為參照。
邏輯2：表達量居中的基因的表達量值，其數值應該是相似的。
DESeq與edgeR，默認情況下都使用這一的邏輯校正。（DESeq and edgeR Bioconctor packages）
Deseq：異常高表達的基因，會顯著影響細胞中的總mRNA的數量。類似的，如果樣本中受到不同程度的外源RNA，如病毒、真菌等的污染，也會顯著影響樣本總mRNA數，導致RPMK值的誤差。對於這樣的問題，Deseq嘗試對數據進行矯正（矯正因子），使表達量處於中間位置的基因表達量應該是基本相同的（即使用表達量處於中間的基因表達量值作為參照，而減少高表達基因的作用）。
Deseq： 校正因子=樣本表達中位數/所有樣本表達量中位數：回答了一個關鍵的問題：Deseq不同差異比較組間，計算得到的表達量值不同。因
為樣本在變化，「所有樣本表達量的中位數」也在變動。RPKM：總表達量為參照
Deseq：中位數為參照
TMM（edgeR）：與Deseq類似，在去除高表達基因和差異最大的基因後，TMM也是要找到一個加權系數，使剩餘的基因在被矯正後差異倍數可能小。TMM的加權系數是基於兩兩樣本比較後推算獲得的（也就是兩組樣本的比較，將產生與這次比較相關的加權系數）。然後將所有基因除以這個加權系數，從而保證大部分表達量居中的基因表達量最相似。
不同RNA-seq表達量歸一化演算法的區別
Deseq類的校正演算法：理論上更加穩定；但不同批次的比較會得到不同的表達量值，不利於進行多處理組/批次數據的統一分析（例如，趨勢分析、共表達分析）校正會掩蓋一些問題（例如：樣本污染）
RPKM類的演算法： 容易受異常高表達基因、外源污染等的干擾；但也更容易從結果的異常中，發現潛在問題；得到的表達量值是恆定的，多處理組/批次的數據可以合並分析。折中的方法：使用RPKM類的演算法，但需要人工檢查數據是否
異常。備註： Deseq軟體也可以關閉校正的功能。
實際經驗總結
總之：從多方面考慮，RPKM類演算法，如果合理使用，依然是最優的。具體問題具體分析：在遇到問題的時候，找到問題的來源，從而給出解決方案（沒有完美的流程，只有最佳解決方案）
『伍』 如何利用SAM找差異性表達基因
今天就先來聊聊如何看差異表達基因數據，火山圖，聚類圖又怎麼看。1差異基因篩選方法那差異基因是如何篩選出來的呢？差異基因的篩選方法有很多，包括倍數法、T檢驗、F檢驗及SAM等。下面簡單介紹一下GCBI平台上用的倍數法和SAM法。倍數法適用於沒有生物學重復的樣本，其計算基因在兩個條件下表達水平的比值，確定比值的閾值，將絕對值大於此閾值的基因判斷為差異基因。SAM演算法適用於有生物學重復的樣本，通過對分母增加一個常量T檢驗過程減小了假陽性發生的概率。文獻中報道，相較於其他演算法，SAM演算法更為穩定，篩選出的結果也更為准確。2差異基因數據解讀經過合適的差異基因方法篩選出的差異基因，結果一般分為兩部分，數據+圖形。數據結果展示如下圖所示（兩分組）眾多參數中，重點看三個。p-value或q-value沒有做生物學重復請跳過這一步。p-value或q-value是統計學檢驗變數，代表差異顯著性，一般p-value或q-value小於0.05代表具有顯著性差異，但可根據具體情況適當調整。因為p-value或q-value衡量地是某個基因假陽性的概率，如果p-value或q-value越低，那麼挑選該基因出現假陽性的概率就越低，可驗證性就越高。兩者具體的計算方法具體如下：那p-value、q-value同時存在時看哪個呢？SAM法只有q-value。當兩者同時存在時，可根據具體情況具體分析。差異篩選是一個典型的多重假設檢驗過程，對於多重假設檢驗，單次檢驗中差異顯著基因的假陽性率(p-value較小)可能會較大，而q-value和FDR值較常見的BH校正方法得到的FDR值而言，改進了其對假陽性估計的保守性。即q-value相比於p-value更加嚴格，當差異基因結果較少時，可以退而求其次看p-value。FoldChangeFoldChange表示實驗組比上對照組的差異表達倍數，一般表達相差2倍以上是有意義的，放寬要求1.5倍或者1.2倍也可以接受。看錶達倍數的同時還需結合基因表達豐度，信號值太低的基因會在後續的驗證實驗中檢測不到。3差異基因圖表解讀在差異結果的圖形展示結果中，主要是火山圖和聚類圖。火山圖火山圖只針對兩分組且有生物學重復的情況。如何看火山圖呢？火山圖可反映總體基因的表達情況，橫坐標代表log2（FoldChange）,縱坐標表示-log10（P值），每個點代表一個基因，顏色用以區分基因是否差異表達，圖中橙色的點代表差異表達基因，藍色的點代表沒有差異表達的基因。聚類圖聚類圖可以衡量樣本或基因之間表達的相似性。如上圖所示的聚類圖中，橫坐標代表樣本聚類，一列代表一個樣本，聚類基於樣本間基因表達的相似性，樣本間基因表達越接近，靠的越近，以此類推。縱坐標代表基因聚類，一行代表一個基因，聚類基於基因在樣本中表達的相似性，基因在樣本中表達越接近，靠的越近，以此類推。色階代表基因表達豐度，越紅代表上調得越明顯，越綠代表下調得越明顯。如何做聚類圖請戳往期推送做個聚類圖只需1分鍾差異基因有了，如何挑選潛在基因進行實驗驗證呢？關鍵還在於感興趣點在哪了。粗略的看，可以先看KEGG或者GO功能分類，看差異基因具體富集在哪些通路或功能。比如關注的是細胞內脂肪酸合成關鍵酶，可以重點看脂肪酸合成和碳流相關通路。具體如何看KEGG或者GO功能分類，請聽下回分解。
『陸』 差異表達基因分析：差異倍數(fold change), 差異的顯著性(P-value)
Differential gene expression analysis：差異表達基因分析
Differentially expressed gene (DEG)：差異表達基因
差異表達分析是目前比較常用的識別疾病相關miRNA以及基因的方法，目前也有很多差異表達分析的方法，但比較簡單也比較常用的是Fold change方法。
它的優點是計算簡單直觀，缺點是沒有考慮到差異表達的統計顯著性；通常以2倍差異為閾值，判斷基因是否差異表達。Fold change的計算公式如下：
即用疾病樣本的表達均值除以正常樣本的表達均值。
差異表達分析的目的： 識別兩個條件下表達差異顯著的基因，即一個基因在兩個條件中的表達水平，在排除各種偏差後，其差異具有統計學意義。我們利用一種比較常見的T檢驗（T-test）方法來尋找差異表達的miRNA。T檢驗的主要原理為：對每一個miRNA計算一個T統計量來衡量疾病與正常情況下miRNA表達的差異，然後根據t分布計算顯著性p值來衡量這種差異的顯著性，T統計量計算公式如下：
差異倍數(fold change)
fold change翻譯過來就是倍數變化，假設A基因表達值為1，B表達值為3，那麼B的表達就是A的3倍。一般我們都用count、TPM或FPKM來衡量基因表達水平，所以基因表達值肯定是非負數，那麼fold change的取值就是(0, +∞).
為什麼我們經常看到差異基因里負數代表下調、正數代表上調？因為我們用了log2 fold change。
當expr(A) < expr(B)時，B對A的fold change就大於1，log2 fold change就大於0（見下圖），B相對A就是上調；
當expr(A) > expr(B)時，B對A的fold change就小於1，log2 fold change就小於0。
通常為了防止取log2時產生NA，我們會給表達值加1（或者一個極小的數），也就是log2(B+1) - log2(A+1). 【需要一點對數函數的基礎知識】
為什麼不直接用表達之差，差值接有正負啊？
假設A表達為1，B表達為8，C表達為64；直接用差值，B相對A就上調了7，C就相對B上調了56；用log2 fold change，B相對A就上調了3，C相對B也只上調了3.
通過測序觀察我們發現，不同基因在細胞里的表達差異非常巨大，所以直接用差顯然不合適， 用log2 fold change更能表示相對的變化趨勢。
雖然大家都在用log2 fold change，但顯然也是有缺點的：
一、到底是5到10的變化大，還是100到120的變化大？
二、5到10可能是由於技術誤差導致的。所以當基因總的表達值很低時，log2 fold change的可信度就低了，尤其是在接近0的時候。
A disadvantage and serious risk of using fold change in this setting is that it is biased[7] and may misclassify differentially expressed genes with large differences (B − A) but small ratios (B/A), leading to poor identification of changes at high expression levels. Furthermore, when the denominator is close to zero, the ratio is not stable, and the fold change value can be disproportionately affected by measurement noise.
差異的顯著性(P-value)
這就是統計學的范疇了，顯著性就是根據假設檢驗算出來的。
假設檢驗首先必須要有假設，我們假設A和B的表達沒有差異（H0，零假設），然後基於此假設，通過t test（以RT-PCR為例）算出我們觀測到的A和B出現的概率，就得到了P-value， 如果P-value<0.05，那麼說明小概率事件出現了，我們應該拒絕零假設，即A和B的表達不一樣，即有顯著差異。
顯著性只能說明我們的數據之間具有統計學上的顯著性，要看上調下調必須回去看差異倍數。
對於得到的顯著性p值，我們需要進行多重檢驗校正（FDR），比較常用的是BH方法（Benjamini and Hochberg, 1995）。
這里只說了最基本的原理，真正的DESeq2等工具裡面的演算法肯定要復雜得多。
這張圖對q-value（校正了的p-value）取了負log，相當於越顯著，負log就越大，所以在火山圖里，越外層的岩漿就越顯著，差異也就越大。
只需要看懂DEG結果的可以就此止步，想深入了解的可以繼續。
下面可以繼續討論的問題有：
1、RNA-seq基本分析流程/2、
2、DEG分析的常用演算法/3、
3、常見DEG工具的方法介紹和相互比較
前言
做生物生理生化生信數據分析時，最常聽到的肯定是「差異(表達)基因分析」了，從最開始的RT-PCR，到基因晶元microarray，再到RNA-seq，最後到現在的single cell RNA-seq，統統都在圍繞著差異表達基因做文章。
（開個腦洞：再下一步應該會測細胞內特定空間內特定基因的動態表達水平了）
表達量 ：我們假設基因轉錄表達形成的mRNA的數量反映了基因的活性，也會影響下游蛋白和代謝物的變化。我們關注的是 基因的表達 ，不是結構，也是不是isoform。
為什麼差異基因分析這么流行？
一是中心法則得到了確立，基因表達是核心的一個環節，決定了下游的蛋白組和代謝組；
二是建庫測序的普及，獲取基因的表達水平變得容易。
在生物體內，基因的表達時刻都在動態變化，不一定服從均勻分布，在不同時間、發育程度、組織和環境刺激下，基因的表達肯定會發生變化。
差異基因分析主要應用在：
發育過程中關鍵基因的表達變化 - 發育研究
突變材料里什麼核心基因的表達發生了變化 - 調控研究
細胞在受到葯物處理後哪些基因的表達發生了變化 - 葯物研發
目前我們對基因和轉錄組的了解到什麼程度了？
基本的建庫方法？建庫直接決定了我們能測到什麼序列，也決定了我們能做什麼分析！
基因表達的normalization方法有哪些？
第一類錯誤、第二類錯誤是什麼？
多重檢驗的校正？FDR？
10x流程解釋
The mean UMI counts per cell of this gene in cluster i
The log2 fold-change of this gene's expression in cluster i relative to other clusters
The p-value denoting significance of this gene's expression in cluster i relative to other clusters, adjusted to account for the number of hypotheses (i.e. genes) being tested.
The differential expression analysis seeks to find, for each cluster, genes that are more highly expressed in that cluster relative to the rest of the sample. Here a differential expression test was performed between each cluster and the rest of the sample for each gene.
The Log2 fold-change (L2FC) is an estimate of the log2 ratio of expression in a cluster to that in all other cells. A value of 1.0 indicates 2-fold greater expression in the cluster of interest.
The p-value is a measure of the statistical significance of the expression difference and is based on a negative binomial test. The p-value reported here has been adjusted for multiple testing via the Benjamini-Hochberg procere.
In this table you can click on a column to sort by that value. Also, in this table genes were filtered by (Mean UMI counts > 1.0) and the top N genes by L2FC for each cluster were retained. Genes with L2FC < 0 or adjusted p-value >= 0.10 were grayed out. The number of top genes shown per cluster, N, is set to limit the number of table entries shown to 10000; N=10000/K^2 where K is the number of clusters. N can range from 1 to 50. For the full table, please refer to the "differential_expression.csv" files proced by the pipeline.
不同單細胞DEG鑒定工具的比較
Comparative analysis of differential gene expression analysis tools for single-cell RNA sequencing data
For data with a high level of multimodality, methods that consider the behavior of each indivial gene, such as DESeq2, EMDomics, Monocle2, DEsingle, and SigEMD, show better TPRs. 這些工具敏感性高，就是說不會漏掉很多真的DEG，但是會包含很多假的DEG。
If the level of multimodality is low, however, SCDE, MAST, and edgeR can provide higher precision. 這些工具精準性很高，意味著得到的DEG里假的很少，所以會漏掉很多真的DEG，不會引入假的DEG。
time-course DEG analysis
Comparative analysis of differential gene expression tools for RNA sequencing time course data
參考：
Question: How to calculate "fold changes" in gene expression?
Exact Negative Binomial Test with edgeR
Differential gene expression analysis
『柒』 從mRNA和蛋白水平來分析基因表達差異的方法有哪些
從mRNA和蛋白水平來分析基因表達差異的方法有哪些
基因的表達是DNA-RNA-蛋白,期間有轉錄水平調控、轉錄後調控、翻譯後調控等多種調控機制影響該基因的表達.所以蛋白水平高低的原因就可能是多方面的.蛋白表達多,可能是mRNA多,也可能mRNA變化不大,而是翻譯多了；蛋白表達少,原因亦然.從2個水平檢測一個基因的表達,可以更全面地了解該基因在該組織某個時期或某種條件下的變化受到什麼水平的調控.
所謂基因表達,就是從DNA到mRNA再到蛋白的一個過程,基因表達水平一般是通過該基因轉錄的mRNA的多少來衡量的.每個基因轉錄產生的mRNA的量,是受到時空等多種因素調控的,個體在不同的生長發育階段,或者不同的組織水平,基因轉錄出mRNA的量都是不一樣的.例如,當某種植物長期生長在高鹽的環境里,該植物體內與抗鹽相關的基因的表達量就會增加,以適應這種高鹽環境,是植物能夠生存下來,這時植物抗鹽相關的基因表達水平就相對高,希望我的回答能夠幫你弄清這個問題,
『捌』 從mRNA和蛋白水平來分析基因表達差異的方法有哪些
mrna方面，可以做表達譜晶元，如果已經落實在某幾個基因上，則用rtPCR最好，當然現在也有原位做表達的一種新技術，不需要PCR過程。
蛋白水平方面，免疫印跡分析是最常用的，前提是抗體好使，其次現在也有蛋白晶元，原位的可以做免疫組化。
『玖』 基因分析的方法
高等真核生物的基因組一般具有80 000～100 000個基因，而每一個細胞大約只表達其中的15%〔1〕。基因在不同細胞間及不同生長階段的選擇性表達決定了生命活動的多樣性，如發育與分化、衰老與死亡、內環境穩定、細胞周期調控等。比較細胞間基因表達的差異為我們揭示生命活動的規律提供了依據。
由於真核細胞 mRNA 3′端一般含有 poly（ a）尾，因此現有的方法基本上都是利用共同引物將不同的 mRNA反轉錄成 cDNA，以 cDNA為對象研究基因表達的差異。1992年 Liang等〔2〕建立了一種差異顯示反轉錄 pCR法（ differential display reverse transcription PCR， dDRT-PCR），為檢測成批基因表達的差異開辟了新天地。迄今為止已出現了大量應用該技術的研究報道〔3，4〕。然而，盡管應用 dDRT-PCR方法已經取得了不少成果，而且該方法還在不斷改進之中，但它仍然存在幾個難以解決的問題：(1)重復率低，至少有20%的差異條帶不能被准確重復〔5〕；(2)假陽性率可以高達90%〔6〕；(3)獲得的差異表達序列極少包含編碼信息。近年來，針對 dDRT-PCR方法的不足，又有幾種新的檢測差異表達基因的方法出現，現僅就這方面的進展做一簡要介紹。
1.基因表達指紋（ gene expression fingerprinting， gEF）： gEF技術使用生物素標記的引物 bio-T13合成 cDNA第一鏈，用 dGTP對其進行末端加尾，再以富含 c的引物引發合成 cDNA第二鏈。用限制性內切酶消化雙鏈 cDNA，以交聯有抗生物素蛋白的微球捕獲 cDNA3′端，以 t4DNA連接酶連接同前述內切酶相對應的適配子，並以 bio-T13及適配子中的序列作為新的引物進行特異的 pCR擴增，得到大量的特異 cDNA片段。適配子末端被32P-dATP標記後，固定於微球上的 cDNA片段經過一系列酶切，產生的酶切片段從微球表面釋放出來，其中那些含有標記末端的片段經凝膠電泳後構成 mRNA指紋圖譜。通過分析不同細胞間的指紋圖譜就能得到差異表達的序列〔7〕。 gEF技術所需的工作量較 dDRT-PCR明顯減少，由於用酶切反應替代了條件不嚴格的 pCR反應，其重復性也較好，假陽性率低，並且所獲得的片段中包含有一定的編碼信息。 gEF技術最大的缺點在於電泳技術的局限。由於它的指紋圖譜要顯示在同一塊電泳膠上，經過幾輪酶切之後常會得到1 000～2 000條電泳帶，而現有的 pAGE電泳很少能分辨超過400條帶，故只有15%～30%的 mRNA能夠被辨認出來，因此得到的只能是高表達基因。如果希望尋找部分新基因，這是一種比較簡單有效的方法；如果希望得到有關某種細胞的基因表達譜，可能比較困難；採用雙向電泳技術可能會有所幫助〔8〕。
2．基因表達系統分析（ serial analysis of gene expression， sAGE）： sAGE法的建立基於兩條理論。首先，一段來自某個轉錄子確定位置的核苷酸，其長度只要有9～10個 bp，就能夠特異地確認該轉錄子。第二，對短片段標簽的鏈接有利於在同一克隆中對多個標簽測序。 sAGE也是用生物素標記的 bio-Oligo(dT)為引物合成雙鏈 cDNA，然後以限制酶（錨定酶）進行酶切，捕獲 cDNA3′端。在此處產物被分為兩部分，分別與包含有 iIS型內切酶（標簽酶）位點的 a、 b連接子相接。 iIS型內切酶的特點是作用位點處於識別位點之外。這樣經過酶切，就有可能得到只有9～10bp的標簽序列。每兩個標簽的鈍端結合後成為 pCR的模板，以基於 a、 b連接子的引物進行 pCR反應的結果是得到了大量每條包含兩個不同來源標簽的序列，接下來再用錨定酶酶切、連接，就能將多個不同的標簽鏈接在一起（大約為每條包含數十個不同來源的標簽），克隆至質粒載體中後集中測序〔9，10〕。 sAGE的最終結果是通過計算機統計得到的，根據某個標簽出現頻率的高低來判斷並計算其所屬基因表達的豐度。對於在資料庫中找不到對應序列的標簽，還可以利用13bp的寡核苷酸探針（9bp加上錨定酶識別位點的4bp）對 cDNA文庫進行篩選，以尋找新基因。 sAGE可以檢測不同細胞間已知基因表達的具體差異，精確到每個細胞中大約有多少拷貝，可以建立較全面的基因表達譜，系統地分析基因表達的差異。它的缺點在於工作量非常大，有大量的測序及計算機分析任務；而且，對於尋找新基因而言，僅用長度為13bp的寡核苷酸探針篩選 cDNA文庫是很不嚴格的，根據我們的經驗，往往是假陽性結果居多。
3 . cDNA3′端限制酶切片段顯示（ display of 3′ end restriction fragments of cDNAs）:cDNA3′端 rFD利用帶有「踵」結構的錨定 oligo(dT)引物合成 cDNA第一鏈，以 okayama和 berg的置換法合成 cDNA第二鏈，然後將雙鏈 cDNA以限制酶消化。本方法的適配子由 a1和 a2兩條寡核苷酸構成，其序列與所用限制酶識別位點相符合，先將 a2的5′端磷酸化，再加入 a1退火，就會形成一個 y型結構；把 y型適配子與酶切後的 cDNA片段相連接，以適配子及錨定引物中所含序列為特異引物進行 pCR反應，則只有 cDNA3′末端的一段被擴增出來，這時的產物可用凝膠電泳表示出來構成差異表達圖譜。對於每次切割6bp的限制酶來說，每種大概只能切割8%的 cDNA，因此至少需要12種以上的限制酶才能使所有 cDNA都顯示出來〔11〕。 cDNA3′端 rFD與 gEF的思路比較相似，由於它利用多種限制酶進行酶切，因此不會象 gEF因凝膠電泳解析度不夠而漏掉信息。它的重復性較好，假陽性率低，尤其是對於已知基因，可以根據選擇內切酶的作用位點確定該基因在凝膠電泳中的位置並判斷其含量，從而避免了進一步的分析。對於精力有限的研究人員，這可能是個值得一試的方法。 cDNA3′端 rFD方法也存在一些和 dDRT-PCR相類似的缺點，它得到的片段中包含的編碼信息比較少，需要多花一些時間對所得到的差異條帶進一步分析。
4.分子指數的 rNA指紋（ rNA fingerprinting by molecular indexing， mI）:MI是一種能夠較好地顯示 mRNA中編碼序列的方法。它利用Ⅱ s型內切酶的作用位點在識別位點之外可以形成一個4bp的突出端的特點，設計43共64種（最外側一個核苷酸隨機）適配子，使得獲取編碼序列片段成為可能。首先是以常規方法合成雙鏈 cDNA，用Ⅱ類限制酶進行酶切後連接5′端磷酸化的相應適配子，再以Ⅱ s類
『拾』 從mRNA和蛋白水平來分析基因表達差異的方法有哪些
從mRNA和蛋白水平來分析基因表達差異的方法有哪些
基因的表達是DNA-RNA-蛋白,期間有轉錄水平調控、轉錄後復調控、翻譯後調控等多種調控機制影響該基因的表達.所以蛋白水平高低的原因就可能是多方面的.蛋白表達多,可能是mRNA多,也可能mRNA變化不大,而是翻譯多了；蛋白表達少制,原因亦然.從2個水平檢測一個基因的表達,可以更全面地了解該基因在該組織某個時期或某種條件下的變化受到什麼水平的調控.
所謂基因表達,就是從DNA到mRNA再到蛋白的一個過程,基因表達水平一般是通過百該基因轉錄的mRNA的多少來衡量的.每個基因轉錄產生的mRNA的量,是受到時空等多種因素調控的,個體在不同的生長發育階段,或者不同的組織水平,基因轉錄出mRNA的量都是不一樣的.例如,當某種植物長期生長在高度鹽的環境里,該植物體內與抗鹽相關的基因的表達量就會增加,以適應這種高鹽環境,是植物能夠生存下來,這時植物抗鹽相關的基因表達水平就相對高,希望我的回答能夠幫你弄清這個問題,