① 蛋白質組組學研究的基本策略是什麼
蛋白質組 蛋白質組(Proteome)的概念最先由Marc Wilkins提出，指由一個基因組(genOME)，或一個細胞、組織表達的所有蛋白質(PROTein). 蛋白質組的概念與基因組的概念有許多差別，它隨著組織、甚至環境狀態的不同而改變. 在轉錄時，一個基因可以多種mRNA形式剪接，並且，同一蛋白可能以許多形式進行翻譯後的修飾. 故一個蛋白質組不是一個基因組的直接產物，蛋白質組中蛋白質的數目有時可以超過基因組的數目. 蛋白質組學(Proteomics)處於早期「發育」狀態，這個領域的專家否認它是單純的方法學，就像基因組學一樣，不是一個封閉的、概念化的穩定的知識體系，而是一個領域. 蛋白質組學集中於動態描述基因調節，對基因表達的蛋白質水平進行定量的測定，鑒定疾病、葯物對生命過程的影響，以及解釋基因表達調控的機制. 作為一門科學，蛋白質組研究並非從零開始，它是已有20多年歷史的蛋白質(多肽)譜和基因產物圖譜技術的一種延伸. 多肽圖譜依靠雙向電泳(Two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)和進一步的圖象分析；而基因產物圖譜依靠多種分離後的分析，如質譜技術、氨基酸組分分析等.
[編輯本段]蛋白質組學的研究內容
主要有兩方面，一是結構蛋白質組學，二是功能蛋白質組學。其研究前沿大致分為三個方面：
① 針對有關基因組或轉錄組資料庫的生物體或組織細胞，建立其蛋白質組或亞蛋白質組及其蛋白質組連鎖群，即組成性蛋白質組學。
② 以重要生命過程或人類重大疾病為對象，進行重要生理病理體系或過程的局部蛋白質組或比較蛋白質組學。
③ 通過多種先進技術研究蛋白質之間的相互作用，繪制某個體系的蛋白，即相互作用蛋白質組學，又稱為「細胞圖譜」蛋白質組學。
此外，隨著蛋白質組學研究的深入，又出現了一些新的研究方向，如亞細胞蛋白質組學、定量蛋白質組學等。
[編輯本段]蛋白質組學研究中的主要技術
1 雙向凝膠電泳技術(2-DE)
雙向凝膠電泳技術與質譜技術是目前應用最為廣泛的研究蛋白質組學的方法。雙向凝膠電泳技術利用蛋白質的等電點和分子量差別將各種蛋白質區分開來。雖然二維凝膠電泳難以辨別低豐度蛋白，對操作要求也較高，但其通量高、解析度和重復性好以及可與質譜聯用的特點，使其成為目前最流行、可靠的蛋白質組研究手段。雙向凝膠電泳技術及質譜基礎的蛋白質組學研究程序為樣品制備→等電聚焦→聚丙烯醯胺凝膠電泳→凝膠染色→挖取感興趣的蛋白質點→膠內酶切→質譜分析確定肽指紋圖譜或部分氨基酸序列→利用資料庫確定蛋白。蛋白質組研究要求有高解析度的蛋白質分離及准確、靈敏的質譜鑒定技術。凝膠電泳中蛋白質的著色不僅影響蛋白質分離的解析度，同時也影響後續的質譜鑒定。蛋白質的染色可分為有機試劑染色、銀染、熒光染色及同位素顯色四類。
Unlu 等提出了一種熒光差異顯示雙向電泳(F-2D-DIGE)的定量蛋白質組學分析方法。差異凝膠電泳(DIGE)是對2-DE 在技術上的改進，結合了多重熒光分析的方法，在同一塊膠上共同分離多個分別由不同熒游標記的樣品，並第一次引入了內標的概念。兩種樣品中的蛋白質採用不同的熒游標記後混合，進行2-DE，用來檢測蛋白質在兩種樣品中表達情況，極大地提高了結果的准確性、可靠性和可重復性。在DIGE技術中，每個蛋白點都有它自己的內標，並且軟體可全自動根據每個蛋白點的內標對其表達量進行校準，保證所檢測到的蛋白豐度變化是真實的。DIGE 技術已經在各種樣品中得到應用。
2 高效液相色譜技術(HPLC)
盡管二維凝膠電泳（2-DE）是目前常用的對全蛋白組的分析方法，但其存在分離能力有限、存在歧視效應、操作程序復雜等缺陷。對於分析動態范圍大、低豐度以及疏水性蛋白質的研究往往很難得到滿意的結果。Chong 等使用HPLC/ 質譜比較分析惡性腫瘤前和癌症兩種蛋白質差異表達。利用HPLC 分離蛋白質，並用MALDI-TOF-MS 鑒定收集的組分，從而在兩種細胞中的差異表達中對蛋白質進行定量分析。多維液相色譜作為一種新型分離技術，不存在相對分子質量和等電點的限制，通過不同模式的組合，消除了二維凝膠電泳的歧視效應，具有峰容量高、便於自動化等特點。二維離子交換- 反相色譜(2D-IEC-RPLC)是蛋白質組學研究中最常用的多維液相色譜分離系統。
3 表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜(SEL-DI)技術
表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜技術於2002 年由諾貝爾化學獎得主田中發明，剛剛產生便引起學術界的高度重視。SELDI 技術是目前蛋白質組學研究中比較理想的技術平台，其全稱是表面增強激光解吸電離飛行時間質譜技術(SELDI-tof)。其方法主要如下：通常情況下將樣品經過簡單的預處理後直接滴加到表面經過特殊修飾的晶元上，既可比較兩個樣品之間的差異蛋白，也可獲得樣品的蛋白質總覽。因此，在應用方面具有顯著優勢。SELDI 技術分析的樣品不需用液相色譜或氣相色譜預先純化，因此可用於分析復雜的生物樣品。SELDI 技術可以分析疏水性蛋白質，PI 過高或過低的蛋白質以及低分子質量的蛋白質( < 25 000) ，還可以發現在未經處理的樣品中許多被掩蓋的低濃度蛋白質，增加發現生物標志物的機會。SELDI 技術只需少量樣品，在較短時間內就可以得到結果，且試驗重復性好，適合臨床診斷及大規模篩選與疾病相關的生物標志物，特別是它可直接檢測不經處理的尿液、血液、腦脊液、關節腔滑液、支氣管洗出液、細胞裂解液和各種分泌物等， 從而可檢測到樣品中目標蛋白質的分子量、PI、糖基化位點、磷酸化位點等參數。
4 同位素標記親和標簽(ICAT)技術
同位素親和標簽技術是近年發展起來的一種用於蛋白質分離分析技術，此技術目前是蛋白質組研究技術中的核心技術之一。該技術用具有不同質量的同位素親和標簽( ICATs) 標記處於不同狀態下的細胞中的半胱氨酸，利用串聯質譜技術，對混合的樣品進行質譜分析。來自兩個樣品中的同一類蛋白質會形成易於辨識比較的兩個不同的峰形，能非常准確的比較出兩份樣品蛋白質表達水平的不同。ICAT 的好處在於它可以對混合樣品直接測試；能夠快速定性和定量鑒定低豐度蛋白質，尤其是膜蛋白等疏水性蛋白等；還可以快速找出重要功能蛋白質。
由於採用了一種全新的ICAT 試劑，同時結合了液相色譜和串聯質譜，因此不但明顯彌補了雙向電泳技術的不足，同時還使高通量、自動化蛋白質組分析更趨簡單、准確和快速，代表著蛋白質組分析技術的主要發展方向。針對磷酸化蛋白分析以及與固相技術相結合ICAT 技術本身又取得了許多有意義的進展，已形成ICA T 系列技術。用具有不同質量的同位素親和標簽( ICATs) 標記處於不同狀態下的細胞中的半胱氨酸，利用串聯質譜技術，可對混合的樣品進行質譜分析。
5 生物信息學
近年來，生物信息學在生命科學研究中起著越來越重要的作用。利用生物信息學對蛋白質組的各種數據進行處理和分析，也是蛋白質組研究的重要內容。生物信息學是蛋白質組學研究中不可缺少的一部分。生物信息學的發展，已不僅是單純的對基因組、蛋白質組數據的分析，而且可以對已知的或新的基因產物進行全面分析。在蛋白質組資料庫中儲存了有機體、組織或細胞所表達的全部蛋白質信息，通過用滑鼠點擊雙向凝膠電泳圖譜上的蛋白質點就可獲得
如蛋白質鑒定結果、蛋白質的亞細胞定位、蛋白質在不同條件下的表達水平等信息。目前應用最普遍的資料庫是NRDB 和dbEST 資料庫。NRDB 由SWISS2PROT 和GENPETP 等幾個資料庫組成，dbEST是由美國國家生物技術信息中心（NCBI）和 歐洲生物信息學研究所(EBI)共同編輯的核酸資料庫；計算機分析軟體主要有蛋白質雙向電泳圖譜分析軟體、蛋白質鑒定軟體、蛋白質結構和功能預測軟體等。
② 蛋白質組學主要包括哪些分析技術及各自特點
雙向凝膠電泳
雙向凝膠電泳的原理是第一向基於蛋白質的等電點不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離，把復雜蛋白混合物中的蛋白質在二維平面上分開。由於雙向電泳技術在蛋白質組與醫學研究中所處的重要位置，它可用於蛋白質轉錄及轉錄後修飾研究，蛋白質組的比較和蛋白質間的相互作用，細胞分化凋亡研究，致病機制及耐葯機制的研究，療效監測，新葯開發，癌症研究，蛋白純度檢查，小量蛋白純化，新替代疫苗的研製等許多方面。近年來經過多方面改進已成為研究蛋白質組的最有使用價值的核心方法。
等電聚焦
等電聚焦（isoelectric focusing，IEF）是60年代中期問世的一種利用有pH梯度的介質分離等電點不同的蛋白質的電泳技術。等電聚焦凝膠電泳依據蛋白質分子的靜電荷或等電點進行分離，等電聚焦中，蛋白質分子在含有載體兩性電解質形成的一個連續而穩定的線性pH梯度中電泳。載體兩性電解質是脂肪族多氨基多羧酸，在電場中形成正極為酸性，負極為鹼性的連續的pH梯度。蛋白質分子在偏離其等電點的pH條件下帶有電荷，因此可以在電場中移動；當蛋白質遷移至其等電點位置時，其靜電荷數為零，在電場中不再移動，據此將蛋白質分離。
生物質譜
生物質譜技術是蛋白質組學研究中最重要的鑒定技術，其基本原理是樣品分子離子化後，根據不同離子之間的荷質比（M/E）的差異來分離並確定分子量。對於經過雙向電泳分離的目標蛋白質用胰蛋白酶酶解（水解Lys或Arg的-C端形成的肽鍵）成肽段，對這些肽段用質譜進行鑒定與分析。目前常用的質譜包括兩種：基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）和電噴霧質譜（ESI- MS）。
飛行時間質譜
MALDI 的電離方式是 Karas和Hillenkamp於1988年提出。MALDI的基本原理是將分析物分散在基質分子（尼古丁酸及其同系物）中並形成晶體，當用激光（337nm的氮激光）照射晶體時，基質分子吸收激光能量，樣品解吸附，基質-樣品之間發生電荷轉移使樣品分子電離。它從固相標本中產生離子，並在飛行管中測定其分子量，MALDI-TOF-MS一般用於肽質量指紋圖譜，非常快速（每次分析只需3~5min），靈敏（達到fmol水平），可以精確測量肽段質量，但是如果在分析前不修飾肽段，MALDI-TOF-MS不能給出肽片段的序列。
電噴霧質譜（ESI-MS）
ESI- MS是利用高電場使質譜進樣端的毛細管柱流出的液滴帶電，在N2氣流的作用下，液滴溶劑蒸發，表面積縮小，表面電荷密度不斷增加，直至產生的庫侖力與液滴表面張力達到雷利極限，液滴爆裂為帶電的子液滴，這一過程不斷重復使最終的液滴非常細小呈噴霧狀，這時液滴表面的電場非常強大，使分析物離子化並以帶單電荷或多電荷的離子形式進入質量分析器。ESI-MS從液相中產生離子，一般說來，肽段的混合物經過液相色譜分離後，經過偶聯的與在線連接的離子阱質譜分析，給出肽片段的精確的氨基酸序列,但是 分析時間一般較長。 目前，許多實驗室兩種質譜方法連用，獲得有意義的蛋白質的肽段序列，設計探針或引物來獲得有意義的基因。隨著蛋白質組研究的深入，又有多種新型質譜儀出現，主要是在上述質譜儀的基礎上進行改進與重新組合。
③ 六，蛋白組學的概念和研究方法有哪些
概念
蛋白質組學（Proteomics）一詞,源於蛋白質（protein）與 基因組學（genomics）兩個詞的組合,意指「一種基因組所表達的全套蛋白質」,即包括一種細胞乃至一種生物所表達的全部蛋白質.蛋白質組本質上指的是在大規模水平上研究蛋白質的特徵,包括蛋白質的表達水平,翻譯後的修飾,蛋白與蛋白相互作用等,由此獲得蛋白質水平上的關於疾病發生,細胞代謝等過程的整體而全面的認識
研究技術
二維電泳和質譜技術
應用
1.蛋白質鑒定：可以利用一維電泳和二維電泳並結合Western等技術,利用蛋白質晶元和抗體晶元及免疫共沉澱等技術對蛋白質進行鑒定研究.
2.翻譯後修飾：很多mRNA表達產生的蛋白質要經歷翻譯後修飾如磷酸化,糖基化,酶原激活等.翻譯後修飾是蛋白質調節功能的重要方式,因此對蛋白質翻譯後修飾的研究對闡明蛋白質的功能具有重要作用.
3.蛋白質功能確定：如分析酶活性和確定酶底物,細胞因子的生物分析/配基-受體結合分析.可以利用基因敲除和反義技術分析基因表達產物-蛋白質的功能.另外對蛋白質表達出來後在細胞內的定位研究也在一定程度上有助於蛋白質功能的了解.Clontech的熒光蛋白表達系統就是研究蛋白質在細胞內定位的一個很好的工具.
4.對人類而言,蛋白質組學的研究最終要服務於人類的健康,主要指促進分子醫學的發展.如尋找葯物的靶分子.很多葯物本身就是蛋白質,而很多葯物的靶分子也是蛋白質.葯物也可以干預蛋白質-蛋白質相互作用.
在基礎醫學和疾病機理研究中,了解人不同發育、生長期和不同生理、病理條件下及不同細胞類型的基因表達的特點具有特別重要的意義.這些研究可能找到直接與特定生理或病理狀態相關的分子,進一步為設計作用於特定靶分子的葯物奠定基礎.
④ bca蛋白定量步驟
BCA 蛋白定量法是實驗室常用的蛋白質定量方法。
BCA 法原理
鹼性條件下，蛋白將 Cu2+還原為 Cu+，Cu+與 BCA 試劑相互作用形成紫色的絡合物，該水溶性的復合物在 562nm 處顯示強烈的吸光性，吸光度和蛋白濃度在廣泛范圍內有良好的線性關系，因此根據吸光值可以推算出蛋白濃度。
實驗操作具體步驟
1. 梯度稀釋牛血清白蛋白（BSA）標准品（具體操作按試劑盒中說明操作）
2. 制備 BCA 工作液（具體操作按說明書進行）
3. 將各個稀釋濃度的蛋白質標准品和待測蛋白質樣品加入到微孔板或試管中，分別加入 BCA 工作液（比例參照試劑盒說明書）混勻。
4. 密封後，37℃ 保溫 30-60 min
5. 冷卻到室溫，以空白為對照，測量樣品在 562nm 或該波長附近的吸光值
6. 將各個標准品和待測蛋白質樣品在 562nm 處的吸光值減去空白標准品在 562nm 處的平均吸光值。
⑤ 蛋白質定量測定的方法有哪些
定氮法，雙縮尿法（Biuret法）、Folin－酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。考馬斯亮藍法（Bradford法）。
凱氏定氮 靈敏度低，適用於0.2~ 1.0mg氮，誤差為 ±2％ 費時
8～10小時 將蛋白氮轉化為氨，用酸吸收後滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉澱蛋白質而分離） 用於標准蛋白質含量的准確測定；干擾少；費時太長
雙縮脲法（Biuret法） 靈敏度低 1～20mg 中速 20~30分鍾 多肽鍵＋鹼性Cu2＋®紫色絡合物 硫酸銨；Tris緩沖液；某些氨基酸 用於快速測定，但不太靈敏；不同蛋白質顯色相似
紫外吸收法 較為靈敏 50～100mg 快速 5～10分鍾 蛋白質中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收 各種嘌吟和嘧啶；
Folin－酚試劑法（Lowry法） 靈敏度高 ～5mg 慢速 40～60分鍾 雙縮脲反應；磷鉬酸－磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原 硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸；
各種硫醇 耗費時間長；操作要嚴格計時；顏色深淺隨不同蛋白質變化
考馬斯亮藍法(Bradford法) 靈敏度最高 1～5mg 快速5～15分鍾 考馬斯亮藍染料與蛋白質結合時，其lmax由465nm變為595nm 強鹼性緩沖液；
SDS 最好的方法；干擾物質少；顏色穩定； 顏色深淺隨不同蛋白質變化
⑥ 測定蛋白質的定量的方法有哪些及其原理各是什麼
常用的蛋白質純化方法有離子交換色譜、親和色譜、電泳、疏水色譜等等
離子交換色譜：蛋白質和氨基酸一樣會兩性解離，所帶電荷決定於溶液ph。ph小於pi時蛋白質帶正電，ph大於pi時蛋白質帶負電。不同蛋白質等電點的蛋白質在同一個溶液中，表面電荷情況不同。離子交換就是利用不同蛋白質在同一溶液中表面電荷的差異來實現分離的。
親和色譜：生物大分子有一個特性，某些分子或基因對它們有特異性很強的吸附作用。如鎳柱中ni可以與his標簽的蛋白結合，這種只針對一種或一類物質的吸附就是親和色譜的原理。
電泳：sds-聚丙烯醯胺凝膠電泳，sds能斷裂分子內和分子間氫鍵，破壞蛋白質的二級和三級結構，強還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質在一定濃度的含有強還原劑的sds溶液中，
與sds分子按比例結合，形成帶負電荷的sds-蛋白質復合物，這種復合物由於結合大量的sds，使蛋白質喪失了原有的電荷狀態形成僅保持原有分子大小為特徵的負離子團塊，從而降低或消除了各種蛋白質分子之間天然的電荷差異，由於sds與蛋白質的結合是按重量成比例的，因此在進行電泳時，蛋白質分子的遷移速度取決於分子大小。
疏水色譜：疏水色譜基於蛋白質表面的疏水區與介質疏水配體間的相互作用，在高濃度鹽作用下，蛋白質的疏水區表面上有序排列的水分子通過鹽離子的破壞被釋放，裸露的疏水區與疏水配體相互作用而被吸附。疏水色譜就是利用樣品中各組分在色譜填料上配基相互作用的差異，在洗脫時各組分移動速度不同而達到分離的目的。隨著鹽離子濃度的降低，疏水作用降低，蛋白質的水化層又形成，蛋白質被解吸附。
⑦ 蛋白質組學的研究手段有哪些
比較多：最基本的
1、雙向電泳技術（理想目的：將細胞（或組織）內所有蛋白質都分離開來）
2、質譜技術及一系列派生技術 （測蛋白質序列）
3 、蛋白質互相作用研究：
酵母雙雜交，細菌雙雜交，免疫共沉澱技術，pull-down，FRET,BiFC等
4、蛋白質定位：
熒游標記技術，共聚焦熒光顯微鏡技術，免疫熒光，免疫化學等技術。
⑧ 蛋白質組學主要包括哪些分析技術及各自特點
為探究生物進程的分子機制，需要確定介導這個過程的蛋白質-蛋白質間的相互作用。研究蛋白質間相互作用的主要技術總結如下：
一、酵母雙雜交系統
酵母雙雜交系統是當前廣泛用於蛋白質相互作用組學研究的一種重要方法。其原理是當靶蛋白和誘餌蛋白特異結合後，誘餌蛋白結合於報道基因的啟動子，啟動報道 基因在酵母細胞內的表達，如果檢測到報道基因的表達產物，則說明兩者之間有相互作用，反之則兩者之間沒有相互作用。將這種技術微量化、陣列化後則可用於大 規模蛋白質之間相互作用的研究。在實際工作中，人們根據需要發展了單雜交系統、三雜交系統和反向雜交系統等。Angermayr等設計了一個SOS蛋白介 導的雙雜交系統。可以研究膜蛋白的功能，豐富了酵母雙雜交系統的功能。此外，酵母雙雜交系統的作用也已擴展至對蛋白質的鑒定。
二、噬茵體展示技術
在編碼噬菌體外殼蛋白基因上連接一單克隆抗體的DNA序列，當噬菌體生長時，表面就表達出相應的單抗，再將噬菌體過柱，柱上若含目的蛋白，就會與相應抗體 特異性結合，這被稱為噬菌體展示技術。此技術也主要用於研究蛋白質之間的相互作用，不僅有高通量及簡便的特點，還具有直接得到基因、高選擇性的篩選復雜混 合物、在篩選過程中通過適當改變條件可以直接評價相互結合的特異性等優點。目前，用優化的噬菌體展示技術，已經展示了人和鼠的兩種特殊細胞系的cDNA文 庫，並分離出了人上皮生長因子信號傳導途徑中的信號分子。
三、等離子共振技術
表 面等離子共振技術(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成為蛋白質相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一種納米級的薄膜吸附上「誘餌蛋白」，當待測蛋白與誘餌蛋白結合後，薄 膜的共振性質會發生改變，通過檢測便可知這兩種蛋白的結合情況。SPR技術的優點是不需標記物或染料，反應過程可實時監控。測定快速且安全，還可用於檢測 蛋白一核酸及其它生物大分子之間的相互作用。
四、熒光能量轉移技術
熒 光共振能量轉移（FRET ）廣泛用於研究分子間的距離及其相互作用; 與熒光顯微鏡結合，可定量獲取有關生物活體內蛋白質、脂類、DNA 和RNA 的時空信息。隨著綠色熒光蛋白（GFP）的發展，FRET 熒光顯微鏡有可能實時測量活體細胞內分子的動態性質。提出了一種定量測量FRET效率以及供體與受體間距離的簡單方法，僅需使用一組濾光片和測量一個比 值，利用供體和受體的發射譜消除光譜間的串擾。該方法簡單快速，可實時定量測量FRET 的效率和供體與受體間的距離，尤其適用於基於GFP 的供體受體對。
五、抗體與蛋白質陣列技術
蛋 白晶元技術的出現給蛋白質組學研究帶來新的思路。蛋白質組學研究中一個主要的內容就是研究在不同生理狀態下蛋白水平的量變，微型化，集成化，高通量化的抗 體晶元就是一個非常好的研究工具，他也是晶元中發展最快的晶元，而且在技術上已經日益成熟。這些抗體晶元有的已經在向臨床應用上發展，比如腫瘤標志物抗體 晶元等，還有很多已經應用再眼就的各個領域里。
六、免疫共沉澱技術 免 疫共沉澱主要是用來研究蛋白質與蛋白質相互作用的一種技術，其基本原理是，在細胞裂解液中加入抗興趣蛋白的抗體，孵育後再加入與抗體特異結合的結合於 Pansobin珠上的金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)，若細胞中有正與興趣蛋白結合的目的蛋白，就可以形成這樣一種復合物：「目的蛋白—興趣蛋白—抗興 趣蛋白抗體—SPA\|Pansobin」，因為SPA\|Pansobin比較大，這樣復合物在離心時就被分離出來。經變性聚丙烯醯胺凝膠電泳，復合物 四組分又被分開。然後經Western blotting法，用抗體檢測目的蛋白是什麼，是否為預測蛋白。這種方法得到的目的蛋白是在細胞內天然與興趣蛋白結合的，符合體內實際情況，得到的蛋白 可信度高。但這種方法有兩個缺陷：一是兩種蛋白質的結合可能不是直接結合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；二是必須在實驗前預測目的蛋白是什麼，以選擇 最後檢測的抗體，所以，若預測不正確，實驗就得不到結果，方法本身具有冒險性。
七、pull-down技術
蛋 白質相互作用的類型有牢固型相互作用和暫時型相互作用兩種。牢固型相互作用以多亞基蛋白復合體常見，最好通過免疫共沉澱（Co-IP） 、Pull-down技術或Far-western法研究。Pull-down技術用固相化的、已標記的餌蛋白或標簽蛋白（生物素-、PolyHis-或 GST-），從細胞裂解液中釣出與之相互作用的蛋白。通過Pull-down技術可以確定已知的蛋白與釣出蛋白或已純化的相關蛋白間的相互作用關系，從體 外傳路或翻譯體系中檢測出蛋白相互作用關系。
⑨ 蛋白質組學常用的研究方法
酵母雙雜交系統、抗體晶元、LCM技術、mic Solution Inc、SPR技術、色譜分離技術、雙相電泳技術、有機質譜等等。
LCM技術獲得的細胞可以用於蛋白質樣品的制備。
蛋白質樣品中的不同類型的蛋白質可以通過二維電泳進行分離。
膠染色後可以利用凝膠圖象分析系統成像，然後通過分析軟體對蛋白質點進行定量分析，並且對感興趣的蛋白質點進行定位。
Genomic Solution可以為研究者提供除質譜外的所有蛋白質組學研究工具，包括二維電泳系統，成像系統及分析軟體，膠切割系統，蛋白質消化濃縮工作站，點樣工作站等；同時還可以提供相關試劑和消耗品。
蛋白質相互作用的研究，酵母雙雜交和噬菌體展示技術無疑是很好的研究方法。
LCM-二維電泳-質譜的技術路線是典型的一條蛋白質組學研究的技術路線，除此以外，LCM-抗體晶元也是一條重要的蛋白質組學研究的技術路線。
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詳細資料請參考：on
http://proct.bio1000.com/101969/
⑩ 1. 蛋白質組學研究方法概述（上）
說明：此篇筆記系2016-2017年由克里克學院與康昱盛主辦的蛋白質組學網路大課堂整理而成，侵刪。該課程由上海交通大學系統生物醫學研究院助理研究員庫鑫博士所授。
大夥兒都知道，蛋白質組學（proteomics），是研究一種細胞或者一種生物體所表達的全部蛋白質。雖說現在基因組測序火得一塌糊塗，但是，我們不要忽略了，蛋白質才是執行生命體功能的基本單元，而且蛋白質都是通過形成各種復合物，組成通路網路，去行使各種生物學功能的！所以，有很多生物學問題只能在蛋白質層面上去研究去探索，而且需要站在系統的層面去考察，比如說：蛋白-蛋白相互作用、蛋白的細胞定位、翻譯後修飾、信號通路及代謝通路的調控和功能等。這就是為啥蛋白質組學如此重要啦！
既然重要，科學家們自然是想盡辦法來研究了！最開始使用的技術就是傳說中的雙向凝膠電泳（2-DE），由於解析度低、蛋白質重疊等各種問題，無論是通量還是准確度，都不盡如人意。當質譜技術興起以後，就迅速被替代了。
說起質譜技術的誕生，估計很多小夥伴都聽過那個著名的diao絲逆襲的段子，講的就是2002年諾貝爾化學獎得主田中耕一，作為蛋白質譜發明人之一，由於一個不小心在實驗時錯加了甘油，結果神奇地將質譜技術引入到鑒定生物大分子的應用領域。想想，大到整個人類的科技發展史，小到每個個體的人生，都充滿了多少不可思議~
當質譜技術與蛋白質組學碰到了一起，真是天雷引了地火，產生出強烈的化學反應，迅速引爆整個學科的發展！也就十幾年的時間吧，蛋白質組學的研究目標從細胞模型、動物模型，到人的體液、組織等人體樣本，應用范圍的生物復雜度越來越高。研究目的呢，也從最初的肽段序列推導，到多肽和蛋白質的定性定量分析，翻譯後修飾，再到如今成為新熱點的靶向蛋白質組學，總之，勢不可擋啊！
說到靶向蛋白質組學，咱們都知道，一直以來蛋白質組學的應用領域主要是針對基礎生物學，比如研究通路、蛋白復合物、互作網路，表徵細胞和組織的類型，觀察細胞周期內蛋白質的表達等。近年來，由於技術的飛速發展，蛋白質組學開始被用於醫學研究和葯物研究。比如說葯物研究，國內可能用得還不多，但在歐美已經開始越來越廣泛。以肝毒性為例，蛋白質組學可以為葯物研發前期的肝毒性評估提供研究手段。
那麼，怎麼將蛋白質組學應用到臨床及葯物研發中呢？就是需要靶向蛋白質組學技術了！以前，蛋白質組學技術主要用於發現新的未知物，比如肽段、蛋白復合物、蛋白的翻譯後修飾等。這部分的應用很廣，技術門檻比較低，方法比較通用。但問題是，這種方法思路沒辦法應對大量的臨床樣本，可重復性和准確性達不到要求。
於是，靶向分析開始興起，就是說，分析之前我們就明確知道需要分析的物質是什麼，然後把它挑出來，進行一個精確的定量和分析！我們不需要一次性驗證成千上萬的蛋白，但我們需要在成百上午的樣本中驗證十幾種或者幾十種我們關心的蛋白質，而且這些蛋白質常常都是濃度很低的蛋白，用傳統的方法基本上只有被遺漏的命（後面我會詳細講為什麼會遺漏）。有了靶向技術，對於研究臨床診斷的生物標志物，就有了更大的可能和更強的支撐了！
那麼接下來，根據老師講課的思路，我就從定性檢測、定量檢測和靶向蛋白質組學三個方面來分享下聽課的收獲。
無論是定性還是定量檢測，樣品制備是跑不掉的准備工作。用於質譜的蛋白質樣品，來源非常廣泛，只要你是包含了蛋白質的東西，都可以作為來源。對於復雜的樣品，比如人體體液或組織樣本，蛋白質的提取及去高峰度，常常需要復雜的精細的處理，而且處理流程根據樣本和研究目的的不同而不同。這部分內容呢，第二講「樣品前處理」會詳扒，感興趣的小夥伴可以期待我的下一篇聽課筆記吧~
話說，蛋白質的定性檢測有兩種思路：Bottom-up和Top down。Top down是指從一個完整的蛋白出發，在質譜中進行碎片化處理，通過對碎片分子的檢測，推導出蛋白的序列。而在使用中真正占絕大多數是Bottom-up方法，也就是我們常說的shotgun方法，它充分利用了蛋白質自身的特點：可以被特定的酶在特定的位點切斷。基本思路是，先用蛋白酶把蛋白序列進行酶切，再針對酶切後的肽段進行鑒定，所以進入質譜的檢測對象永遠是肽段，再根據肽段序列再推導出蛋白序列。
1. 樣本處理 ：拿到蛋白來源的各種樣本，進行前處理和優化。
2. 蛋白分離 ：根據研究需要，用凝膠分離，提取所需的蛋白，或者不分離，全部拿來檢測，需要注意去雜質；
3. 酶切 ：用序列特異性的酶，對蛋白進行酶切；
4. 肽段分離 ：酶切後的肽段進入HPLC（高壓液相色譜），這也就是我們常說的LC-MS中的LC，肽段會因為在色譜柱填料上的保留時間的不同，得到預分離；
5. 電離 ：分離後的肽段，加電壓使其離子化（ESI）；或者用MALDI基質輔助的激光解離，就不需要HPLC的過程；
6. 質譜解析 ：將帶上電荷的肽段送入質譜，肽段會在磁場中發生偏轉（質譜儀的基本原理），在質譜里收集信號，得到譜圖。
7. 搜庫 ：用搜索軟體對質譜圖進行自動化的分析，得到肽段及蛋白序列信息。
換個角度，對Shotgun方法的流程，我們可以這樣來總結：
這裡面最關鍵的一個指標，我們叫Peptide-Spectrum matching（PSM），就是指譜圖與肽段的匹配。匹配得越好，則反推出的蛋白就越准確。這個匹配的過程，也就是我們常說的搜庫。那麼接下來我就來分享一下從課程中學習到的搜庫背景知識、搜庫工具和演算法，以及對搜索結果的評估。
質譜，聽上去很高大上，無論有多貴重，都是由三部分組成的：離子源+質量分析器+檢測器。
一台質譜可以不止一個離子源＼分析器＼檢測器，可以把幾種串聯起來，針對不同分析需要來使用。
離子源
我們先來說說離子源。蛋白質譜所使用的ESI（Electrospray ionization）電噴霧離子化，對蛋白質組學來說是一個標志性的發明！因為是直接從液相進行離子化，使它與LC（液相色譜）的聯用變得更加容易了，我們可以先用LC將非常復雜的肽段混合物進行預分離，減少每次分析物的復雜度，然後分離的肽段可以直接進入ESI，形成電離噴霧。
那麼，ESI噴霧是怎麼形成的呢？簡單來說，分離柱前端有一個小開口，被分析物根據質量及電荷的不同，依次通過前端的小開口。小開口處加了電壓，剛開始，靜電力與表面張力相同，當加大靜電力使它大於表面張力的時候，液膜破裂，形成無數帶電的小液滴，就形成噴霧了。像現在比較新的nanoESI技術，LC的流速就更加慢，離子化的效果也更好。覺得以上描述還不夠形象的童鞋，直接看圖吧：
質量分析器
說完了離子源，接下來我們來說質量分析器，這是質譜儀里最重要的一部分。我們通常聽到的各種質譜儀的名字，就是根據質量分析器的類型來命名的。我們樣品中各組分在離子源中發生電離，並經加速電場的作用後，形成離子束，進入質量分析器中。質量分析器將帶電離子根據其質荷比加以分離，記錄各種離子的質量數和豐度，用於後續定性與定量的分析。
質量分析器有兩個主要的技術參數：質量范圍和解析度。質量范圍是指是所能測定的質荷比的范圍，它決定了咱們能檢測到的離子的范圍。比如，ESI離子源能產生許多m/z大於3000的離子，如果你選的質量分析器的上限達不到3000，那麼3000以上的離子你就檢測不出來了。
然而，另一個更為重要的指標，就是質量分析器的解析度！先上個公式描述：
解析度=觀測的一個質譜峰的質荷比/半峰高處的峰寬（FWHM）
啥意思呢？比如下圖中最左邊的那個峰，它的質荷比是1,085.55，峰高一半的地方的峰寬值是0.217，於是：
解析度=1,085.55/0.217=5,000
如果這么講還是不太明白，那你可以簡單理解為，質譜解析度越高，我們將得到越尖越細的譜峰。你可能會問：譜峰又尖又細的好處是什麼？這是個好問題！事實上，解析度可以表徵兩個相鄰的譜峰在質譜中被區分開的能力。大家通過下圖感受一下不同解析度的質譜儀能給我們多麼不同的譜峰圖。
圖中以Glucagon（胰高血糖素）為例，展示了不同解析度的質譜儀給出的譜峰。當解析度是1000時，只能看一個很寬的峰（藍色）；解析度增加到3000時，峰窄一些（紅色），但還感受不到明顯的差別；當提高到10000時，很明顯能看到，其實這里包含了8個峰（綠色）；再提高到30000的時候，半峰寬更窄，兩個相鄰的峰可以徹底地被分開（黑色）。顯然，我們在解析度為1000或3000，不能准確的檢測被分析肽段的精確分子量， 從而導致譜圖無法匹配或者發生錯配。
不同的質量分析器有不同的解析度，通常的順序是：傅里葉變換質譜解析度最高，但造價太貴；其次是Orbitrap（軌道阱系列），解析度遠遠高於其它質譜；再次是TOF（時間飛行質譜）；然後是離子阱（Ion Trap）；最後是四級桿質譜（Quadrupole）。
這里我多說一句，解析度高固然好，但價格肯定就貴，選擇質譜儀的時候要根據咱們自己的研究目的以及預算范圍啦！
二級質譜
然而，要對肽段進行鑒定，一級質譜顯然是辦不到的，我們沒法根據肽段離子m/z的值就推斷出這個肽段由哪些氨基酸殘基組成（可能的組合非常多），以及序列順序是怎麼樣的，對吧？所以，鑒定肽段還需要二級質譜。
什麼是二級質譜呢？簡單來說，肽段混合物通過一級質譜得到了一級譜圖，然後從中選擇一個肽段，通過一些方法，比如，與隨性氣體進行碰撞，把肽段碰碎，得到碎片離子，再形成二級譜圖。我們通過觀察碎片離子的質量分布來推斷肽斷的殘基組成，最後再反推出蛋白質是什麼。上個圖，幫助大家理解一下二級質譜是怎麼來的。
在上一段，我提到是從一級質譜中「選擇」一個肽段進入二級質譜。這里看似講得雲淡風輕，事實上怎麼選卻是一個很關鍵的問題！通常選擇的方法我們可以叫做「TOP」法（這是我自己起的名字），比如TOP15就是指從一級譜里選前15個高度的峰，每一次分離一個肽段，然後對這個肽段進行掃描，得到二級譜圖。
大家發現了沒有？如果一個肽段在一級譜圖中沒有進入TOP15，那它連打二級譜圖的資格都沒有！原來質譜的世界競爭也是如何殘酷！二級質譜能掃描哪些肽段是由一級質譜決定的，所以我們將這種方法稱為「數據依賴性採集（DDA, data dependent acquisition）！
明白了吧，DDA這個名字就是這么來的！下次大夥兒再聽到有人說DDA，心裡不會再一百個問號飛過了吧？
咱們細想一下就不難發現，如果一個蛋白的濃度不夠高，也就是說，它的肽段在一級譜圖中很難成為那些TOPs，那麼它能進入二級質譜的可能性基本上沒有。這就是為什麼低峰度蛋白很難被鑒定到！這也就是為什麼我們在做比如血液這種樣品的時候，一定要去除血紅蛋白等高峰度蛋白（如果你想鑒定的蛋白不是血紅蛋白的話）！
很顯然，DDA方法的局限性就擺在那裡！這叫想要研究低峰度蛋白的科學家們怎麼忍？於是，一種叫做數據非依賴性採集（DIA）的新方法就應運而生了！關於這種方法的原理，下一篇推文會詳扒。
我們再通過以下這個圖來感受一下一級譜圖與二級譜圖之間的關系：
比如，第一個時間點，我們先進行MS1掃描，然後選一個峰高的肽段進行MS2掃描，依次類推。在一些掃描速度比較快的質譜儀里，一個MS1譜圖可以進行80張MS2的掃描。
鑒定碎片離子
好，我們搞清楚了二級質譜是怎麼來的，那麼我們怎麼根據檢測到的離子信息來推測這是什麼氨基酸呢？可能你會說，這還不簡單么？根據分子量呀！
沒錯，不同的氨基酸，它的分子量不就是一個簡單的值嗎？然而，這件事卻並沒有這么簡單，因為這個世界上還存在一個神奇的東西，它的名字叫同位素！
比如說碳元素，最常見的是原子量12的這種，我們叫C12，然而它還有一個同樣很穩定的好基友，C13（多一個中子）。於是，我們得考慮到這兩種穩定同位素的含量（網路說C13占 1.11%，C12佔98.89%），對於一個氨基酸而言，我們就會得到兩個不同的分子量：
為啥說平均呢？因為當肽段分子量越大，含有各種同位素的可能性及不同組合就越多，我們如果把每一種組合都算一遍分子量，這樣會得到一個長長的list，到時候做譜圖匹配時用哪一個值呢？也沒譜。所以乾脆用一個平均值來表示。
我們通過下表來感受一下各種不同的氨基酸殘基的單同位素分子量與平均分子量有多大的區別：
可能你又會問，這兩個不同的分子量分別在什麼情況下用呢？這里又要說到解析度了，如果咱們用的是高解析度質譜儀，不同的同位素峰會被明顯地分開，也就是說，譜圖里我們能看幾個同位素峰，這時我們就可以使用單同位素分子量，可以與相應的單同位素峰准確對應。但在低解析度質譜儀里，這些峰很可能混在一起，看上去只是一個峰，這種情況下，也沒辦法，只能用平均分子量去近似一下了。
下面這個圖可以很形象地展示出，單同位素分子量與平均分子量在質譜圖上差別有多大。在高分辨質譜看來，這完全就是兩種不同的離子了。上面我們也說了，根據平均分子量來計算，結果並不準確，但用單同位素分子量來計算，就可以准確對應了。
除了同位素，還有一個因素我們也需要考慮，那就是肽段碎裂進入二級質譜時，可能會形成三種不同的離子類型，這就是我們通常所說的by離子，ax離子和cz離子。
之所以會形成不同的離子對，是因為不同的碎裂方法，造成肽段斷裂的位置不同。大夥兒看看上面這個圖就明白了。當我們使用CID（碰撞誘導解離）或HCD（High-energy C-trap Dissociation）碎裂時，與惰性氣體碰撞的是C-N鍵這里，C端生成y離子，N端生成b離子，這是二級質譜產生的最常見的離子對了。當我們使用ETD（電子轉移解離）碎裂時，因為有一個電子反應的過程，在加上電子後才產生的碎裂，它的斷裂位置可能出現在N-C鍵這里，形成cz離子，而TOF類儀器可能會產生ax離子。
離子類型的信息需要傳遞給後續的搜庫步驟（通常我們在搜庫軟體中指定了儀器類型，軟體就會自動匹配離子類型），計算機需要模擬最可能的碎裂位置，生成對應的理論譜圖，然後拿來與實際譜圖比對。我們以by離子為例，來看看對一個肽段來說，它可能碎裂成哪些碎片離子：
那麼它可能會生成如下這樣的譜圖：
從譜圖上看，這個肽段所有的by離子都檢測到了。通常來說，對於豐度不錯，長短合適的肽段，在高精度質譜儀上被完整捕獲到的情況是很常見的。通常情況下50%-80%的by離子都能被捕獲到。
下篇繼續講定性檢測里的搜庫工具、結果評估，以及定量檢測的各種背景知識。