A. 蛋白質組學的研究手段有哪些
比較多：最基本的
1、雙向電泳技術（理想目的：將細胞（或組織）內所有蛋白質都分離開來）
2、質譜技術及一系列派生技術 （測蛋白質序列）
3 、蛋白質互相作用研究：
酵母雙雜交，細菌雙雜交，免疫共沉澱技術，pull-down，FRET,BiFC等
4、蛋白質定位：
熒游標記技術，共聚焦熒光顯微鏡技術，免疫熒光，免疫化學等技術。
B. 六，蛋白組學的概念和研究方法有哪些
概念
蛋白質組學（Proteomics）一詞,源於蛋白質（protein）與 基因組學（genomics）兩個詞的組合,意指「一種基因組所表達的全套蛋白質」,即包括一種細胞乃至一種生物所表達的全部蛋白質.蛋白質組本質上指的是在大規模水平上研究蛋白質的特徵,包括蛋白質的表達水平,翻譯後的修飾,蛋白與蛋白相互作用等,由此獲得蛋白質水平上的關於疾病發生,細胞代謝等過程的整體而全面的認識
研究技術
二維電泳和質譜技術
應用
1.蛋白質鑒定：可以利用一維電泳和二維電泳並結合Western等技術,利用蛋白質晶元和抗體晶元及免疫共沉澱等技術對蛋白質進行鑒定研究.
2.翻譯後修飾：很多mRNA表達產生的蛋白質要經歷翻譯後修飾如磷酸化,糖基化,酶原激活等.翻譯後修飾是蛋白質調節功能的重要方式,因此對蛋白質翻譯後修飾的研究對闡明蛋白質的功能具有重要作用.
3.蛋白質功能確定：如分析酶活性和確定酶底物,細胞因子的生物分析/配基-受體結合分析.可以利用基因敲除和反義技術分析基因表達產物-蛋白質的功能.另外對蛋白質表達出來後在細胞內的定位研究也在一定程度上有助於蛋白質功能的了解.Clontech的熒光蛋白表達系統就是研究蛋白質在細胞內定位的一個很好的工具.
4.對人類而言,蛋白質組學的研究最終要服務於人類的健康,主要指促進分子醫學的發展.如尋找葯物的靶分子.很多葯物本身就是蛋白質,而很多葯物的靶分子也是蛋白質.葯物也可以干預蛋白質-蛋白質相互作用.
在基礎醫學和疾病機理研究中,了解人不同發育、生長期和不同生理、病理條件下及不同細胞類型的基因表達的特點具有特別重要的意義.這些研究可能找到直接與特定生理或病理狀態相關的分子,進一步為設計作用於特定靶分子的葯物奠定基礎.
C. 檢測蛋白質表達量的實驗方法有哪些，western-blotting的原理，方法
蛋白質印跡（免疫印跡試驗）即Western Blot物、物化免疫遺傳用種實驗其基本原理通特異性抗體凝膠電泳處理細胞或物組織品進行著色通析著色位置著色深度獲特定蛋白質所析細胞或組織表達情況信息
蛋白質印跡由瑞士米歇爾弗雷德希物研究所（Friedrich Miescher Institute）Harry Towbin1979提尼爾·伯奈特（Neal Burnette）於1981所著《析物化》（Analytical Biochemistry）首稱Western Blot蛋白免疫印跡（Western Blot）電泳離細胞或組織總蛋白質凝膠轉移固相支持物NC膜或PVDF膜用特異性抗體檢測某特定抗原種蛋白質檢測技術現已廣泛應用於基蛋白水平表達研究、抗體性檢測疾病早期診斷等面
D. 如何研究蛋白質的表達規律
前者可以通過Western blot來研究而後者可以通過免疫學方法（如免疫膠體金、免疫熒光）或者organelle import assay（真核生物）來研究。
E. 5種蛋白質研究方法都是什麼
本文概括了研究蛋白質的五種方法的原理及優缺點。1.熒光共振能量轉移;2.蛋白質雙雜交技術;3.噬菌體展示技術;4.蛋白質的親和色譜;5.親和印跡。
……
詳細資料請參考：on
http://doc.bio1000.com/show-3109.html
F. 檢測蛋白質表達除了Western blot，還有什麼方法
你能否說的詳細一點呢？你想要怎麼做？至少說，你想看的蛋白是體內的，還是外源轉染進去的質粒表達的？
如果是體內的，western是比較好的方法；如果是分泌蛋白，則可以用ELISA；如果是外源轉染進去的，則可以融合一個GFP什麼的進去，看熒光就行了。還是得看你想怎麼做，還有你的蛋白是什麼狀態的。
上面有人說RT-PCR，檢測mRNA是一種間接的途徑。如果此蛋白有轉錄後調控的機制，則mRNA的量不能反應蛋白的量。
G. 蛋白質的哪幾種表達系統和方式
1.表達系統 a大腸桿菌 b哺乳動物細胞 c其他表達系統包括果蠅表達系統、桿狀病毒表達系統和酵母表達系統
2.表達方式 瞬時表達 穩定表達 誘導表達
H. 蛋白表達用哪種表達方式比較好呢常用的表達方式是哪種呢
蛋白表達是指用模式生物如細菌、酵母、動物細胞或者植物細胞表達外源基因蛋白的一種分子生物學技術。在基因工程技術中佔有核心地位。
蛋白表達系統概述
蛋白表達系統是指由宿主、外源基因、載體和輔助成分組成的體系。通過這個體系可以實現外源基因在宿主中表達的目的。一般由以下幾個部分組成：
1、宿主。表達蛋白的生物體。可以為細菌、酵母、植物細胞、動物細胞等。由於各種生物的特性不同，適合表達蛋白的種類也不相同。
2、載體。載體的種類與宿主相匹配。根據宿主不同，分為原核（細菌）表達載體、酵母表達載體、植物表達載體、哺乳動物表達載體、昆蟲表達載體等。載體中含有外源基因片段。通過載體介導，外源基因可以在宿主中表達。
3、輔助成分。有的表達系統中還包括了協助載體進入宿主的輔助成分。比如昆蟲-桿狀病毒表達體系中的桿狀病毒。
原核蛋白表達系統既是最常用的表達系統，也是最經濟實惠的蛋白表達系統。原核蛋白表達系統以大腸桿菌表達系統為代表，具有遺傳背景清楚、成本低、表達量高和表達產物分離純化相對簡單等優點，缺點主要是蛋白質翻譯後缺乏加工機制，如二硫鍵的形成、蛋白糖基化和正確折疊，得到具有生物活性的蛋白的幾率較小。
酵母蛋白表達系統以甲醇畢赤酵母為代表，具有表達量高，可誘導，糖基化機制接近高等真核生物，分泌蛋白易純化，易實現高密發酵等優點。缺點為部分蛋白產物易降解，表達量不可控。
哺乳動物細胞和昆蟲細胞表達系統主要優點是蛋白翻譯後加工機制最接近體內的天然形式，最容易保留生物活性，缺點是表達量通常較低，穩定細胞系建立技術難度大，生產成本高。
艾柏森生物科技有限公司致力於基因、重組蛋白、抗體、噬菌體文庫等生物制劑的研發，並致力於為客戶提供一站式的CRO技術服務。
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I. 1. 蛋白質組學研究方法概述（上）
說明：此篇筆記系2016-2017年由克里克學院與康昱盛主辦的蛋白質組學網路大課堂整理而成，侵刪。該課程由上海交通大學系統生物醫學研究院助理研究員庫鑫博士所授。
大夥兒都知道，蛋白質組學（proteomics），是研究一種細胞或者一種生物體所表達的全部蛋白質。雖說現在基因組測序火得一塌糊塗，但是，我們不要忽略了，蛋白質才是執行生命體功能的基本單元，而且蛋白質都是通過形成各種復合物，組成通路網路，去行使各種生物學功能的！所以，有很多生物學問題只能在蛋白質層面上去研究去探索，而且需要站在系統的層面去考察，比如說：蛋白-蛋白相互作用、蛋白的細胞定位、翻譯後修飾、信號通路及代謝通路的調控和功能等。這就是為啥蛋白質組學如此重要啦！
既然重要，科學家們自然是想盡辦法來研究了！最開始使用的技術就是傳說中的雙向凝膠電泳（2-DE），由於解析度低、蛋白質重疊等各種問題，無論是通量還是准確度，都不盡如人意。當質譜技術興起以後，就迅速被替代了。
說起質譜技術的誕生，估計很多小夥伴都聽過那個著名的diao絲逆襲的段子，講的就是2002年諾貝爾化學獎得主田中耕一，作為蛋白質譜發明人之一，由於一個不小心在實驗時錯加了甘油，結果神奇地將質譜技術引入到鑒定生物大分子的應用領域。想想，大到整個人類的科技發展史，小到每個個體的人生，都充滿了多少不可思議~
當質譜技術與蛋白質組學碰到了一起，真是天雷引了地火，產生出強烈的化學反應，迅速引爆整個學科的發展！也就十幾年的時間吧，蛋白質組學的研究目標從細胞模型、動物模型，到人的體液、組織等人體樣本，應用范圍的生物復雜度越來越高。研究目的呢，也從最初的肽段序列推導，到多肽和蛋白質的定性定量分析，翻譯後修飾，再到如今成為新熱點的靶向蛋白質組學，總之，勢不可擋啊！
說到靶向蛋白質組學，咱們都知道，一直以來蛋白質組學的應用領域主要是針對基礎生物學，比如研究通路、蛋白復合物、互作網路，表徵細胞和組織的類型，觀察細胞周期內蛋白質的表達等。近年來，由於技術的飛速發展，蛋白質組學開始被用於醫學研究和葯物研究。比如說葯物研究，國內可能用得還不多，但在歐美已經開始越來越廣泛。以肝毒性為例，蛋白質組學可以為葯物研發前期的肝毒性評估提供研究手段。
那麼，怎麼將蛋白質組學應用到臨床及葯物研發中呢？就是需要靶向蛋白質組學技術了！以前，蛋白質組學技術主要用於發現新的未知物，比如肽段、蛋白復合物、蛋白的翻譯後修飾等。這部分的應用很廣，技術門檻比較低，方法比較通用。但問題是，這種方法思路沒辦法應對大量的臨床樣本，可重復性和准確性達不到要求。
於是，靶向分析開始興起，就是說，分析之前我們就明確知道需要分析的物質是什麼，然後把它挑出來，進行一個精確的定量和分析！我們不需要一次性驗證成千上萬的蛋白，但我們需要在成百上午的樣本中驗證十幾種或者幾十種我們關心的蛋白質，而且這些蛋白質常常都是濃度很低的蛋白，用傳統的方法基本上只有被遺漏的命（後面我會詳細講為什麼會遺漏）。有了靶向技術，對於研究臨床診斷的生物標志物，就有了更大的可能和更強的支撐了！
那麼接下來，根據老師講課的思路，我就從定性檢測、定量檢測和靶向蛋白質組學三個方面來分享下聽課的收獲。
無論是定性還是定量檢測，樣品制備是跑不掉的准備工作。用於質譜的蛋白質樣品，來源非常廣泛，只要你是包含了蛋白質的東西，都可以作為來源。對於復雜的樣品，比如人體體液或組織樣本，蛋白質的提取及去高峰度，常常需要復雜的精細的處理，而且處理流程根據樣本和研究目的的不同而不同。這部分內容呢，第二講「樣品前處理」會詳扒，感興趣的小夥伴可以期待我的下一篇聽課筆記吧~
話說，蛋白質的定性檢測有兩種思路：Bottom-up和Top down。Top down是指從一個完整的蛋白出發，在質譜中進行碎片化處理，通過對碎片分子的檢測，推導出蛋白的序列。而在使用中真正占絕大多數是Bottom-up方法，也就是我們常說的shotgun方法，它充分利用了蛋白質自身的特點：可以被特定的酶在特定的位點切斷。基本思路是，先用蛋白酶把蛋白序列進行酶切，再針對酶切後的肽段進行鑒定，所以進入質譜的檢測對象永遠是肽段，再根據肽段序列再推導出蛋白序列。
1. 樣本處理 ：拿到蛋白來源的各種樣本，進行前處理和優化。
2. 蛋白分離 ：根據研究需要，用凝膠分離，提取所需的蛋白，或者不分離，全部拿來檢測，需要注意去雜質；
3. 酶切 ：用序列特異性的酶，對蛋白進行酶切；
4. 肽段分離 ：酶切後的肽段進入HPLC（高壓液相色譜），這也就是我們常說的LC-MS中的LC，肽段會因為在色譜柱填料上的保留時間的不同，得到預分離；
5. 電離 ：分離後的肽段，加電壓使其離子化（ESI）；或者用MALDI基質輔助的激光解離，就不需要HPLC的過程；
6. 質譜解析 ：將帶上電荷的肽段送入質譜，肽段會在磁場中發生偏轉（質譜儀的基本原理），在質譜里收集信號，得到譜圖。
7. 搜庫 ：用搜索軟體對質譜圖進行自動化的分析，得到肽段及蛋白序列信息。
換個角度，對Shotgun方法的流程，我們可以這樣來總結：
這裡面最關鍵的一個指標，我們叫Peptide-Spectrum matching（PSM），就是指譜圖與肽段的匹配。匹配得越好，則反推出的蛋白就越准確。這個匹配的過程，也就是我們常說的搜庫。那麼接下來我就來分享一下從課程中學習到的搜庫背景知識、搜庫工具和演算法，以及對搜索結果的評估。
質譜，聽上去很高大上，無論有多貴重，都是由三部分組成的：離子源+質量分析器+檢測器。
一台質譜可以不止一個離子源＼分析器＼檢測器，可以把幾種串聯起來，針對不同分析需要來使用。
離子源
我們先來說說離子源。蛋白質譜所使用的ESI（Electrospray ionization）電噴霧離子化，對蛋白質組學來說是一個標志性的發明！因為是直接從液相進行離子化，使它與LC（液相色譜）的聯用變得更加容易了，我們可以先用LC將非常復雜的肽段混合物進行預分離，減少每次分析物的復雜度，然後分離的肽段可以直接進入ESI，形成電離噴霧。
那麼，ESI噴霧是怎麼形成的呢？簡單來說，分離柱前端有一個小開口，被分析物根據質量及電荷的不同，依次通過前端的小開口。小開口處加了電壓，剛開始，靜電力與表面張力相同，當加大靜電力使它大於表面張力的時候，液膜破裂，形成無數帶電的小液滴，就形成噴霧了。像現在比較新的nanoESI技術，LC的流速就更加慢，離子化的效果也更好。覺得以上描述還不夠形象的童鞋，直接看圖吧：
質量分析器
說完了離子源，接下來我們來說質量分析器，這是質譜儀里最重要的一部分。我們通常聽到的各種質譜儀的名字，就是根據質量分析器的類型來命名的。我們樣品中各組分在離子源中發生電離，並經加速電場的作用後，形成離子束，進入質量分析器中。質量分析器將帶電離子根據其質荷比加以分離，記錄各種離子的質量數和豐度，用於後續定性與定量的分析。
質量分析器有兩個主要的技術參數：質量范圍和解析度。質量范圍是指是所能測定的質荷比的范圍，它決定了咱們能檢測到的離子的范圍。比如，ESI離子源能產生許多m/z大於3000的離子，如果你選的質量分析器的上限達不到3000，那麼3000以上的離子你就檢測不出來了。
然而，另一個更為重要的指標，就是質量分析器的解析度！先上個公式描述：
解析度=觀測的一個質譜峰的質荷比/半峰高處的峰寬（FWHM）
啥意思呢？比如下圖中最左邊的那個峰，它的質荷比是1,085.55，峰高一半的地方的峰寬值是0.217，於是：
解析度=1,085.55/0.217=5,000
如果這么講還是不太明白，那你可以簡單理解為，質譜解析度越高，我們將得到越尖越細的譜峰。你可能會問：譜峰又尖又細的好處是什麼？這是個好問題！事實上，解析度可以表徵兩個相鄰的譜峰在質譜中被區分開的能力。大家通過下圖感受一下不同解析度的質譜儀能給我們多麼不同的譜峰圖。
圖中以Glucagon（胰高血糖素）為例，展示了不同解析度的質譜儀給出的譜峰。當解析度是1000時，只能看一個很寬的峰（藍色）；解析度增加到3000時，峰窄一些（紅色），但還感受不到明顯的差別；當提高到10000時，很明顯能看到，其實這里包含了8個峰（綠色）；再提高到30000的時候，半峰寬更窄，兩個相鄰的峰可以徹底地被分開（黑色）。顯然，我們在解析度為1000或3000，不能准確的檢測被分析肽段的精確分子量， 從而導致譜圖無法匹配或者發生錯配。
不同的質量分析器有不同的解析度，通常的順序是：傅里葉變換質譜解析度最高，但造價太貴；其次是Orbitrap（軌道阱系列），解析度遠遠高於其它質譜；再次是TOF（時間飛行質譜）；然後是離子阱（Ion Trap）；最後是四級桿質譜（Quadrupole）。
這里我多說一句，解析度高固然好，但價格肯定就貴，選擇質譜儀的時候要根據咱們自己的研究目的以及預算范圍啦！
二級質譜
然而，要對肽段進行鑒定，一級質譜顯然是辦不到的，我們沒法根據肽段離子m/z的值就推斷出這個肽段由哪些氨基酸殘基組成（可能的組合非常多），以及序列順序是怎麼樣的，對吧？所以，鑒定肽段還需要二級質譜。
什麼是二級質譜呢？簡單來說，肽段混合物通過一級質譜得到了一級譜圖，然後從中選擇一個肽段，通過一些方法，比如，與隨性氣體進行碰撞，把肽段碰碎，得到碎片離子，再形成二級譜圖。我們通過觀察碎片離子的質量分布來推斷肽斷的殘基組成，最後再反推出蛋白質是什麼。上個圖，幫助大家理解一下二級質譜是怎麼來的。
在上一段，我提到是從一級質譜中「選擇」一個肽段進入二級質譜。這里看似講得雲淡風輕，事實上怎麼選卻是一個很關鍵的問題！通常選擇的方法我們可以叫做「TOP」法（這是我自己起的名字），比如TOP15就是指從一級譜里選前15個高度的峰，每一次分離一個肽段，然後對這個肽段進行掃描，得到二級譜圖。
大家發現了沒有？如果一個肽段在一級譜圖中沒有進入TOP15，那它連打二級譜圖的資格都沒有！原來質譜的世界競爭也是如何殘酷！二級質譜能掃描哪些肽段是由一級質譜決定的，所以我們將這種方法稱為「數據依賴性採集（DDA, data dependent acquisition）！
明白了吧，DDA這個名字就是這么來的！下次大夥兒再聽到有人說DDA，心裡不會再一百個問號飛過了吧？
咱們細想一下就不難發現，如果一個蛋白的濃度不夠高，也就是說，它的肽段在一級譜圖中很難成為那些TOPs，那麼它能進入二級質譜的可能性基本上沒有。這就是為什麼低峰度蛋白很難被鑒定到！這也就是為什麼我們在做比如血液這種樣品的時候，一定要去除血紅蛋白等高峰度蛋白（如果你想鑒定的蛋白不是血紅蛋白的話）！
很顯然，DDA方法的局限性就擺在那裡！這叫想要研究低峰度蛋白的科學家們怎麼忍？於是，一種叫做數據非依賴性採集（DIA）的新方法就應運而生了！關於這種方法的原理，下一篇推文會詳扒。
我們再通過以下這個圖來感受一下一級譜圖與二級譜圖之間的關系：
比如，第一個時間點，我們先進行MS1掃描，然後選一個峰高的肽段進行MS2掃描，依次類推。在一些掃描速度比較快的質譜儀里，一個MS1譜圖可以進行80張MS2的掃描。
鑒定碎片離子
好，我們搞清楚了二級質譜是怎麼來的，那麼我們怎麼根據檢測到的離子信息來推測這是什麼氨基酸呢？可能你會說，這還不簡單么？根據分子量呀！
沒錯，不同的氨基酸，它的分子量不就是一個簡單的值嗎？然而，這件事卻並沒有這么簡單，因為這個世界上還存在一個神奇的東西，它的名字叫同位素！
比如說碳元素，最常見的是原子量12的這種，我們叫C12，然而它還有一個同樣很穩定的好基友，C13（多一個中子）。於是，我們得考慮到這兩種穩定同位素的含量（網路說C13占 1.11%，C12佔98.89%），對於一個氨基酸而言，我們就會得到兩個不同的分子量：
為啥說平均呢？因為當肽段分子量越大，含有各種同位素的可能性及不同組合就越多，我們如果把每一種組合都算一遍分子量，這樣會得到一個長長的list，到時候做譜圖匹配時用哪一個值呢？也沒譜。所以乾脆用一個平均值來表示。
我們通過下表來感受一下各種不同的氨基酸殘基的單同位素分子量與平均分子量有多大的區別：
可能你又會問，這兩個不同的分子量分別在什麼情況下用呢？這里又要說到解析度了，如果咱們用的是高解析度質譜儀，不同的同位素峰會被明顯地分開，也就是說，譜圖里我們能看幾個同位素峰，這時我們就可以使用單同位素分子量，可以與相應的單同位素峰准確對應。但在低解析度質譜儀里，這些峰很可能混在一起，看上去只是一個峰，這種情況下，也沒辦法，只能用平均分子量去近似一下了。
下面這個圖可以很形象地展示出，單同位素分子量與平均分子量在質譜圖上差別有多大。在高分辨質譜看來，這完全就是兩種不同的離子了。上面我們也說了，根據平均分子量來計算，結果並不準確，但用單同位素分子量來計算，就可以准確對應了。
除了同位素，還有一個因素我們也需要考慮，那就是肽段碎裂進入二級質譜時，可能會形成三種不同的離子類型，這就是我們通常所說的by離子，ax離子和cz離子。
之所以會形成不同的離子對，是因為不同的碎裂方法，造成肽段斷裂的位置不同。大夥兒看看上面這個圖就明白了。當我們使用CID（碰撞誘導解離）或HCD（High-energy C-trap Dissociation）碎裂時，與惰性氣體碰撞的是C-N鍵這里，C端生成y離子，N端生成b離子，這是二級質譜產生的最常見的離子對了。當我們使用ETD（電子轉移解離）碎裂時，因為有一個電子反應的過程，在加上電子後才產生的碎裂，它的斷裂位置可能出現在N-C鍵這里，形成cz離子，而TOF類儀器可能會產生ax離子。
離子類型的信息需要傳遞給後續的搜庫步驟（通常我們在搜庫軟體中指定了儀器類型，軟體就會自動匹配離子類型），計算機需要模擬最可能的碎裂位置，生成對應的理論譜圖，然後拿來與實際譜圖比對。我們以by離子為例，來看看對一個肽段來說，它可能碎裂成哪些碎片離子：
那麼它可能會生成如下這樣的譜圖：
從譜圖上看，這個肽段所有的by離子都檢測到了。通常來說，對於豐度不錯，長短合適的肽段，在高精度質譜儀上被完整捕獲到的情況是很常見的。通常情況下50%-80%的by離子都能被捕獲到。
下篇繼續講定性檢測里的搜庫工具、結果評估，以及定量檢測的各種背景知識。
J. 蛋白的表達與純化
pET，原核表達金標准（轉）
pET 載體中，目標基因克隆到 T7 噬菌體強轉錄和翻譯信號控制之下，並通過在宿主細胞提供 T7 RNA 聚合酶來誘導表達。 Novagen 的 pET 系統不斷擴大，提供了用於表達的新技術和選擇，目前共包括 36 種載體類型、 15 種不同宿主菌和設計用於有效檢測和純化目標蛋白的許多其它相關產品。
優點
· 是原核蛋白表達引用最多的系統
· 在任何大腸桿菌表達系統中，基礎表達水平最低
· 真正的調節表達水平的「變阻器」控制
· 提供各種不同融合標簽和表達系統配置
· 可溶性蛋白生產、二硫鍵形成、蛋白外運和多肽生產等專用載體和宿主菌
· 許多載體以 LIC 載體試劑盒提供，用於迅速定向克隆 PCR 產物
· 許多宿主菌株以感受態細胞形式提供，可立即用於轉化
陽性 pFORCE TM 克隆系統具有高效克隆 PCR 產物、陽性選擇重組體和高水平表達目標蛋白等特點。
pET 系統概述
pET 系統是在大腸桿菌中克隆和表達重組蛋白的最強大系統。根據最初由 Studier 等開發的 T7 啟動子驅動系統， Novagen 的 pET 系統已用於表達成千上萬種不同蛋白。
控制基礎表達水平
pET 系統提供 6 種載體 - 宿主菌組合，能夠調節基礎表達水平以優化目標基因的表達。沒有單一策略或條件適用於所有目標蛋白，所以進行優化選擇是必要的。
宿主菌株
質粒在非表達宿主菌中構建完成後，通常轉化到一個帶有 T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（ λ DE3 溶原菌）中表達目標蛋白。在 λ DE3 溶原菌中， T7 RNA 聚合酶基因由 lacUV5 啟動子控制。未誘導時便有一定程度轉錄，因此適合於表達其產物對宿主細胞生長無毒害作用的一些基因。而宿主菌帶有 pLysS 和 pLyE 時調控會更嚴緊。 pLys 質粒編碼 T7 溶菌酶，它是 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未誘導細胞中轉錄目標基因的能力。 pLysS 宿主菌產生低量 T7 溶菌酶，而 pLysE 宿主菌產生更多酶，因此是最嚴緊控制的 λ DE3 溶原菌。
有 11 種不同DE3 溶原化宿主菌。使用最廣泛的為 BL21 及其衍生菌株，它的優點在於缺失 lon 和 ompT 蛋白酶。 B834 菌株為甲硫氨酸營養缺陷型，因此可用 35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸對目標蛋白進行高特異活性標記。 BLR 為 recA - 衍生菌株，改善了質粒單體產量，有助於穩定含有重復序列的目標質粒。兩個硫氧還蛋白還原酶 ( trxB ) 突變菌株 (AD494,BL21 trxB ) ，有利於大腸桿菌胞漿中二硫鍵形成。 Origami TM 和 OrigamiB 菌株為 trxB/gor 雙突變，這兩個酶是主要還原途徑的關鍵酶。 Origami 和 OrigamiB 宿主菌的主要優點是能形成正確折迭的含有二硫鍵的蛋白。新的 Rosetta TM 菌株補充了四種大腸桿菌稀有密碼子的 tRNA ，改善了由於密碼子使用頻率不同而引起的一些真核蛋白低表達。其它菌株背景包括 K-12 菌株 HMS174 和 NovaBlue ，象 BLR 一樣為 recA - 。這些菌株可穩定表達其產物可能導致 DE3 噬菌體丟失的某些目標基因。由於存在 F 附加體編碼的高親和力 lacIq 阻遏蛋白， NovaBlue 為一個有用的嚴緊型宿主菌。此外， Novagen 提供了 λ DE3 溶原化試劑盒，用於制備其它遺傳背景的新表達宿主菌。表達高毒性基因或制備新的 λ DE3 溶原菌的另一替代方法是通過 l CE6 感染提供 T7 RNA 聚合酶。雖然不如用 IPTG 誘導 λ DE3 溶原菌方便，這種策略也被優先用於一些應用中。
高嚴緊性 T7 lac 啟動子
除了在宿主菌水平選擇三種基本的表達嚴緊性， pET 系統中 T7 啟動子本身提供了兩種不同的嚴緊性選擇：普通 T7 啟動子和 T7 lac 啟動子。 T7 lac 啟動子在啟動子區下游 17bp 處含有一個 25bp 的 lac 操縱序列。該位點結合 lac 阻遏蛋白能夠有效降低 T7 RNA 聚合酶的轉錄，這樣提供了在 λ DE3 溶原菌中抑制基礎表達的第二種基於 lacI 的機制（除了抑制 lacUV5 ）。含 T7 lac 啟動子的 pET 質粒還具有它們自己的 lacI ，確保足夠的阻遏蛋白結合到操縱基因位點上。
在實際應用中，為了獲得最高產量的蛋白，通常應該測試多種不同的載體 / 宿主菌組合。
控制誘導的表達水平
在許多情況下，表達活性可溶性最好的蛋白依賴於宿主細胞的背景、培養條件和合適的載體配置。通常，目標蛋白活性最高的條件與產量最高的條件不一致。除了根據載體 / 宿主菌組合控制 T7 RNA 聚合酶的基礎表達提供不同嚴緊性， pET 系統還根據誘導物（ IPTG ）濃度，對目標蛋白表達提供了真正的「變阻器」控制。 Tuner 和 OrigamiB 宿主菌的 lacY 突變使這種控製成為可能。
選擇 pET 載體
所有的 pET 載體均來自 pBR322 ，但彼此間先導序列、表達信號、融合標簽、相關限制性位點和其它特點有所不同。有兩大類 pET 質粒，即轉錄載體和翻譯載體：
轉錄載體（包括 pET-21 、 pET-23 和 pET-24 ）表達目標 RNA ，但不提供翻譯信號。它們用於從自身帶有細菌翻譯信號的目標基因表達蛋白。（注意：轉錄載體通過命名後面的一個缺失字母後綴加以區分）
翻譯載體含有設計用於蛋白表達的有效翻譯起始信號。許多載體在讀碼框 a 、 b 和 c 中帶有克隆位點，分別對應於 BamH I 位點的 GGA 、 GAT 和 ATC 三聯體。
選擇要點
選擇用於表達的 pET 載體通常涉及多種因素。考慮以下三個主要因素：
· 所表達蛋白的用途
· 所表達蛋白的已知信息
· 克隆策略
pET 載體表達的蛋白用途各種各樣。例如，表達量為分析級的蛋白可用於活性研究、突變體篩選和定性、篩選配體相互作用和抗原制備。大量活性蛋白用於結構研究、試劑或親和基質制備。許多載體適合表達用於篩選或抗原制備的分析量蛋白，然而只有載體、宿主菌和培養條件組合十分適宜才可能用於大量純化。如果需要活性蛋白連續高產，應該試驗多種載體、宿主菌和培養條件組合以找到最優化結果。
任何關於目標蛋白的已知信息都有助於載體選擇。例如，一些蛋白的活性要求一個或兩個末端沒有外源序列。許多 pET 載體能夠克隆非融合序列，然而如果特定翻譯起始序列不能在大腸桿菌中有效利用，表達水平可能受影響。在這些情況下，常可用有效表達的氨基末端序列構建融合蛋白，然後在純化後用位點特異性蛋白酶消化去除融合序列。 LIC （連接非依賴的克隆）策略對這種方法特別有用，因為克隆操作通過腸激酶和因子 Xa 能夠去除所有氨基端載體編碼序列。
由於限制性位點和讀碼框相容性的需要，克隆策略也會影響載體選擇。由於許多 pET 載體具有共同的限制性位點配置，通常可能將一次制備的目標基因克隆到幾個載體中。采 PCR 克隆策略時則有不同的考慮。 LIC 載體試劑盒推薦用於此目的，可通過 PCR 制備插入片段，而不需要限制性消化載體或插入片段。
溶解性和細胞定位
考慮了目標蛋白的應用和克隆策略，還應該確定目標蛋白的細胞定位和溶解性，這一點十分重要。在許多實際應用中常希望表達可溶的活性蛋白。
特定目標蛋白的溶解性取決於多種因素，包括各自的蛋白序列。在許多情況下，溶解性不是有或無的現象，載體、宿主菌和培養條件可被用來增加或減少獲得的可溶或不可溶形式的比例。 PET-32 載體系列使目標序列與通常能夠增加可溶性蛋白比例的硫氧還蛋白 (Trx.Tag ) 融合。新推出的 pET-43.1 系列具有通過大量系統篩選而得到的一種過量表達時具有極高溶解性的大腸桿菌蛋白 --Nus.Tag 融合伴侶，從而進一步提高了目標蛋白的可溶性。此外， trxB 突變株 AD494 和 BL21 trxB ，或 trxB/gor OrigamiTM 和 OrigamiB 菌株可用於在胞漿中形成許多真核蛋白正確折迭和活性所要求的二硫鍵。低溫誘導（ 15 -25 ° C ）也可增加可溶性目標蛋白的比例。
獲得可溶性活性蛋白的另一策略是使蛋白外泌到胞外周質中，為折迭和二硫鍵形成有更適宜的環境。為了達到這一目的，通常使用帶信號肽的載體。
一些純化策略可以優化胞質中不溶性包涵體的產量。抽提包涵體並溶解，然後目標蛋白在體外重新折迭 ( 如使用 Novagen 的蛋白折迭試劑盒 ) 。該過程通常產生高產量初始蛋白並防止宿主細胞中的蛋白降解。然而，重新折迭成活性蛋白的效率隨不同蛋白變化很大，可能相當低。 pET-31b （ + ）載體專為產生不可溶融合蛋白而設計，提供了生產小蛋白和多肽的有效方法。
滿足不同需要的融合標簽
如果融合序列不影響應用，生產帶有 S.Tag 、 T7.Tag a 、 His.Tag a 和 HSV.Tag a 的融合蛋白會很方便後續操作，並易於通過蛋白雜交檢測。這些多肽（融合序列很小），它們的檢測試劑極特異和靈敏。通過使用相應樹脂和緩沖液試劑盒， GST.Tag 、 S.Tag 和 T7.Tag 序列可用於親和純化。
使用 S.Tag 和 GST.Tag 分析試劑盒可對粗提或純化的融合蛋白准確定量。採用一種新穎底物的 FRETWorks S.Tag 分析試劑盒可通過熒光檢測到少於 1fmol 的融合蛋白。
His.Tag a 序列作為純化蛋白的融合伴侶非常有用，尤其對那些以包涵體形式表達的蛋白來說，它可以使親和純化可在溶解蛋白的完全變性條件下進行。
CBD.Tag a 在低費用親和純化中非常有用。它們也特別適用於重新折迭（特別是帶有 CBD clos .Tag a 序列的 pET-34b （ + ）和 35b （ + ））。因為只有正確重新折迭的 CBDs 結合到纖維素基質上， CBIND 親和純化步驟能夠從制備物中去除不正確折迭的分子。任何標簽可用於固定目標蛋白，但由於 CBD.Tag 序列的低非特異性結合以及與纖維素基質的生物相容性，使它更適合用於這一目的。
Nus.Tag 、 Trx.Tag 和 GST.Tag 序列用來增加其融合伴侶的溶解性。 Nus.Tag 和 Trx.Tag 載體與利於在胞漿中形成二硫鍵的 Origami 宿主菌相容。
各種融合標簽和相應 pET 載體見列表。一些 pET 載體帶有數個***的融合標簽，作為 5' 融合伴侶。此外，許多載體通過目標基因序列符合讀碼框的通讀而表達末端帶有不同多肽標簽的融合蛋白。使用在 5' 標簽和目標序列之間含有蛋白酶切割位點（凝血酶、因子 Xa 和腸激酶）的載體，可以在純化後選擇性去除一個或多個標簽。 pET-30 Ek/LIC 、 pET-32 Ek/LIC 、 pET-34 Ek/LIC 和 pET-36 Ek/LIC 是細胞定位和親和標簽配置良好的代表。 pET Ek/LIC 載體 Combo 試劑盒包括所有 4 種即用型載體，可直接用於構建數種目標基因構型。
pET NusA 融合系統 43.1
在大腸桿菌中生產可溶性活性蛋白
新推出的 pET NusA 融合系統設計用於克隆和高水平表達與 495aa NusA （ Nus.Tag ）蛋白融合的多肽序列。對資料庫中 4000 個以上蛋白進行可溶性建模， NusA 蛋白被確認為具有最高的可溶性。在用四種不同 NusA 融合蛋白進行的試驗中，大於 85% 的表達蛋白都是可溶的。 pET-43.1 載體含有 Nus.Tag 融合伴侶並與 trx/gor 突變體 Origami 和 OrigamiB 菌株相容，有利於在胞漿中形成二硫鍵。使用 pET-43.1 載體和這些 trx/gor 宿主菌組合可能獲得二硫鍵結合的蛋白。
優點
· 高可溶性的 N- 末端 Nus.Tag 融合伴侶
· 上游 His.Tag a 、 S.Tag 和可選擇的 C- 末端 HSV.Tag a 、 His.Tag 融合標簽
· 凝血酶和腸激酶切割位點
· 多克隆位點位於所有讀碼框中
· 與 AD494 和 Origami 宿主菌株相容，可促進表達蛋白的正確折迭
pET 宿主菌株感受態細胞
所有 pET 系統宿主菌以預測試的感受態細胞形式提供，可立即用於轉化。
（ DE3 ）指宿主為 λ DE3 溶原菌，其染色體上帶有一拷貝由 lacUV5 啟動子控制的 T7 RNA 聚合酶基因。這類菌株適用於從克隆到 pET 載體的目標基因生產蛋白。命名為 pLysS 和 pLysE 的宿主菌帶有編碼 T7 溶菌酶（為 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物）的 pET 相容性質粒。帶有 pLysS 的細胞產生少量溶菌酶，而 pLysE 宿主菌產生更大量酶。這些菌株用於在誘導前抑制 T7 RNA 聚合酶的基礎表達，這樣可以穩定編碼影響細胞生長和活力的目標蛋白的 pET 重組體。帶有 pLacI 的宿主菌產生額外的抑制 pETBlue 和 pTriEx 載體基礎表達的 lac 阻遏蛋白。 λ DE3 溶原化試劑盒用於制備其它遺傳背景的新表達宿主菌。
AD494 菌株為硫氧還蛋白還原酶 ( trxB ) 突變菌株，能夠在胞漿內形成二硫鍵，提供了生產正確折迭的活性蛋白的潛力。 TrxB 突變可用卡那黴素選擇，因此該菌株建議用於帶氨苄抗性標記 bla 的質粒。
B834 為 BL21 的親本菌株。這些蛋白酶缺陷宿主菌為甲硫氨酸營養缺陷型，可用 35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸對目標蛋白進行高特異活性標記，從而用於結晶學研究。
BL21 應用最廣的宿主菌來源，具有 lon 和 ompT 蛋白酶缺陷的優點。
BL21 TrxB 菌株在蛋白酶缺陷 BL21 背景上具有與 AD494 菌株相同的硫氧還蛋白還原酶突變 ( trxB ) 。由於 trxB 宿主有利於胞漿內二硫鍵形成，它們的使用可增加正確折迭的蛋白組分。 TrxB 突變可用卡那黴素選擇，因此該菌株建議用於帶氨苄抗性標記 bla 的質粒。
BLR 為 BL21 的 recA - 衍生菌株，能夠改善質粒單體產量，有助於穩定含有重復序列或其產物能夠引起 DE3 噬菌體丟失的目標質粒。
HMS174 菌株在 K-12 背景上提供了 recA 突變。與 BLR 一樣，這些菌株能夠穩定其產物能夠引起 DE3 噬菌體丟失的某些目標基因。
NovaBlue 適合 用作初始克隆宿主菌的 K-12 菌株，具有高轉化效率、藍 / 白斑篩選能力（與合適質粒）和導致優質質粒 DNA 高產的 recA endA 突變。由於存在 F 附加體編碼的 lacI q 阻遏蛋白， NovaBlue 的 DE3 溶原菌是一個非常有用的嚴緊型宿主菌。
Origami 為 K-12 衍生的宿主菌，硫氧還蛋白還原酶突變 ( trxB ) 和谷胱甘肽還原酶 ( gor ) 基因均為突變，能夠大大增強胞漿內二硫鍵的形成。研究表明即使總體表達水平相似， Origami （ DE3 ）表達的活性蛋白比其它宿主菌高 10 倍以上。 Origami 宿主菌與氨苄抗性質粒相容，可用於 pET-32 載體，硫氧還蛋白標簽能夠進一步增強在胞漿內形成二硫鍵。 TrxB 和 gor 突變可分別用卡那黴素和四環素選擇，因此該菌株建議用於帶氨苄抗性標記 bla 的 pET 質粒。
Origami B 宿主菌來源於 BL21 lacZY 突變株，還帶有與原始 Origami 菌株相同的 TrxB / gor 突變。 Origami B 菌株集 BL21 、 Tuner 和 Origami 宿主菌的優點於一體。 TrxB 和 gor 突變可分別用卡那黴素和四環素選擇，因此該菌株建議用於帶氨苄抗性標記 bla 的 pET 質粒。
Rosetta 宿主菌從 BL21 衍生而來，可增強帶有大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白的表達。該菌株通過一個相容性氯黴素抗性質粒補充密碼子 AUA 、 AGG 、 AGA 、 CUA 、 CCC 和 GGA 的 tRNAs 。這樣 Rosetta 菌株提供了「萬能」的翻譯，從而避免因大腸桿菌密碼子使用頻率導致的表達限制。 tRNA 基因由它們的天然啟動子驅動。在 Rosetta （ DE3 ） pLysS 和 Rosetta （ DE3 ） pLacI 中，稀有 tRNA 基因存在於分別帶有 T7 溶菌酶和 lac 阻遏基因的同一質粒上。
Tuner 菌株為 BL21 的 lacZY 缺失突變株，能夠調整培養物中所有細胞的蛋白表達水平。 lac 通透酶（ lacY ）突變使得 IPTG 均勻進入群體所有細胞，從而具有濃度依賴、水平均一的誘導表達。通過調整 IPTG 濃度，表達可從極低水平調節到極強、完全誘導的表達水平（通常與 pET 載體相關）。低水平表達有時可能增強難表達蛋白的溶解性和活性。 Tuner （ DE3 ） pLacI 菌株與 pETBlue 和 pTriEx 載體的表達相容。
重組蛋白的純化
http://www.bioon.com/experiment/protein4/86143.shtml