核苷酸序列分析常用方法

A. DNA的一級結構也即鹼基在核酸鏈上的排列順序是如何測定的

DNA測序（DNA sequencing，或譯DNA定序）是指分析特定DNA片段的鹼基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）與鳥嘌呤（G）的排列方式。

最常用方法是Sanger（桑格）雙脫氧鏈終止法，是弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）於1975年發明的。測序過程需要先做一個聚合酶連鎖反應（PCR）。PCR過程中，雙脫氧核苷酸可能隨機地被加入到正在合成中的DNA片段里。由於雙脫氧核糖核苷酸又少了一個氧原子，一旦它被加入到DNA鏈上，這個DNA鏈就不能繼續增加長度。最終的結果是獲得所有可能獲得的、不同長度的DNA片段。目前最普遍最先進的方法，是將雙脫氧核糖核苷酸進行不同熒游標記。將PCR反應獲得的總DNA通過毛細管電泳分離，跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下發出熒光。由於ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP（4種雙脫氧核糖核苷酸）熒游標記不同，計算機可以自動根據顏色判斷該位置上鹼基究竟是A，T，G，C中的哪一個。

B. 獲得一個未知的基因的核苷酸系列後，你如何對其功能進行初步預測如何得到該基因產物及其抗體

1.可以去NCBI進行blast，搜索其同源基因，這樣其功能便知道個大概了。
2.已知這個基因的核苷酸序列，如果你已有其質粒，想要得到，最簡單的方法就是使用PCR擴增，如果沒有就只有去相關基因公司購買或者請專業的基因合成公司來為你合成。
3.這個問題太過復雜，關於抗體的制備有雜交瘤技術，噬菌體篩選技術等等。
你問的這些問題牽涉到分子生物學，免疫學等極為專業的知識，詳細解答恐怕幾年也說不完，建議你先去學習相關知識。
另外二樓的回答第一句是不正確的，從已知基因是可以推出蛋白序列的，但反過來，由於簡並密碼子的原因，從蛋白是不能推出准確的核苷酸序列的。

C. DNA測序技術有哪些

DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。目前用於測序的技術主要有Sanger等（1977）發明的雙脫氧鏈末端終止法與Gilbert（1977）發明的化學降解法。這兩種方法在原理上差異很大，但都是根據核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的鹼基處終止，產生A，T，C，G四組不同長度的一系列核苷酸，然後在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得DNA序列。目前Sanger測序法得到了廣泛的應用。

D. 核糖核酸檢測步驟

1、核酸提取使用硅膠柱離心、磁性硅膠顆粒分離方法以及自動化儀器等商品化試劑或設備並按說明書操作。提取RNA時應注意防止RNA降解。DNA應置於-20℃保存，RNA和需長期保存的DNA應置於-80℃保存。
2、逆轉錄合成cDNA。逆轉錄cDNA合成反應需使用逆轉錄引物、dNTPs、逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、DTT、緩沖液和適量無RNA/DNA酶的超純水以及RNA模板。在擴增儀或水浴箱中，在規定的溫度和時間下進行逆轉錄反應。
3、PCR擴增反應PCR反應需使用引物、dNTPs、DNA聚合酶、緩沖液、和適量無RNA/DNA酶超純水、以及模板。在擴增儀中，按照設定的程序進行擴增。使用二次擴增的套式PCR擴增方法。
4、擴增產物定性分析；擴增產物常用分析方法是瓊脂糖凝膠電泳法，與分子量標准比較，判斷擴增片段是否在預期的分子量范圍內。其它擴增產物分析方法還有限制性內切酶酶切分析、特異性探針雜交分析以及DNA序列分析等。
5、結果判定和完成報告單：每一次檢測需同時做兩個陽性對照、兩個陰性對照，只有陽性對照擴增出預期的片段、陰性對照沒有擴增出任何片段、雙份平行樣品結果一致的情況下實驗才成立，可以作出核酸陽性或陰性反應結果的判定。
(4)核苷酸序列分析常用方法擴展閱讀：
檢測新型冠狀病毒特異序列的方法最常見的是熒光定量PCR。因PCR反應模板僅為DNA，因此在進行PCR反應前，應將新型冠狀病毒核酸逆轉錄為DNA。在PCR反應體系中，
包含一對特異性引物以及一個Taqman探針，該探針為一段特異性寡核苷酸序列，兩端分別標記了報告熒光基團和淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；
如反應體系存在靶序列，PCR反應時探針與模板結合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性將探針酶切降解，報告基團與淬滅基團分離，發出熒光。
每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子產生。熒光定量PCR儀能夠監測出熒光到達預先設定閾值的循環數與病毒核酸濃度有關，病毒核酸濃度越高， Ct值越小。不同生產企業的產品會依據自身產品的性能確定本產品的陽性判斷值。
參考資料：網路——核酸檢測法

E. 用DNA探針測定目的基因中的核苷酸序列的實驗步驟有哪些

首先用適當濃度的DNA酶Ⅰ（DNAseⅠ）在探針DNA雙鏈上造成缺口.
然後再藉助於DNA聚合酶Ⅰ（DNa
poly
merasⅠ）的外切酶活性，切去帶有32P標記的磷酸的核苷酸。
同時又利用該酶的聚酶活性，使互補32P標記的核苷酸補入缺口，DNA聚合酶Ⅰ的這兩種活性的交替作用，使缺口不斷向的方向移動。
最後，實驗結果為DNA鏈上的核苷酸不斷為32P標記的核苷酸所取代。

F. ITS序列分析的應用原理和主要步驟有哪些

聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，為最常用的分子生物學技術之一。典型的PCR由（1）高溫變性模板；（2）引物與模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反應組成一個循環，通過多次循環反應，使目的DNA得以迅速擴增。其主要步驟是：將待擴增的模板DNA置高溫下（通常為93℃-94℃）使其變性解成單鏈；人工合成的兩個寡核苷酸引物在其合適的復性溫度下分別與目的基因兩側的兩條單鏈互補結合，兩個引物在模板上結合的位置決定了擴增片段的長短；耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃將單核苷酸從引物的3』端開始摻入，以目的基因為模板從5』→3』方向延伸，合成DNA的新互補鏈。 PCR能快速特異擴增任何已知目的基因或DNA片段，並能輕易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因擴增達到納克、微克、毫克級的特異性DNA片段。因此，PCR技術一經問世就被迅速而廣泛地用於分子生物學的各個領域。它不僅可以用於基因的分離、克隆和核苷酸序列分析，還可以用於突變體和重組體的構建，基因表達調控的研究，基因多態性的分析，遺傳病和傳染病的診斷，腫瘤機制的探索，法醫鑒定等諸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有著以下多種用途： (1) 生成雙鏈DNA中的特異序列作為探針； (2) 由少量mRNA生成 cDNA文庫； (3) 從cDNA中克隆某些基因； (4) 生成大量DNA以進行序列測定； (5) 突變的分析； (6) 染色體步移； (7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多態性分析等。

G. sanger加減法核酸序列分析的原理

DNA序列測定技術（雙脫氧末端終止法）使用須知
(張宏、李振甫)

一、背景介紹
目前最常用的手工DNA序列測定技術，仍然是Sanger等(1977)提出的酶法，也稱雙脫氧末端終止法。這種方法生成相互獨立的若干組帶放射性標記的寡核苷酸，每組核苷酸都有共同的起點，卻隨機終止於一種(或多種)特定的殘基,形成一系列以某一特定核苷酸為末端的長度，各不相同的寡核苷酸混合物，這些寡核苷酸的長度由這個特定鹼基，在待測DNA片段上的位置所決定。然後通過高解析度的變性聚丙烯醯胺凝膠電泳，經放射自顯影後,從放射自顯影膠片上，直接讀出待測DNA上的核苷酸順序。
高解析度變性聚丙烯醯胺凝膠電泳，亦是DNA序列測定技術的重要基礎，可分離僅差一個核苷酸、長度達300-500個核苷酸的單鏈DNA分子。DNA序列測定的簡便方法，為詳細分析大量基因組的結構和功能奠定了基礎，時至今日，絕大多數蛋白質氨基酸序列都是根據基因或cDNA的核苷酸序列推導出來的。
除傳統的雙脫氧鏈終止法外，自動化測序實際上已成為當今DNA序列分析的主流。此外,新的測序方法亦在不斷出現,如上世紀90年代提出的雜交測序法等。
二、雙脫氧末端終止法測序步驟
(一)制備模板
有兩種類型的DNA可以作為Sanger法測序的模板,即純化的單鏈DNA和經熱變性或鹼變性的雙鏈DNA。
1、單鏈DNA模板 在一般情況下,可將靶DNA片段克隆於M13mp載體中,從M13mp系列噬菌體顆粒中分離得到的單鏈DNA模板效果最佳，只要細心掌握模板與引物的最佳比例,有經驗的測序人員通過一次末端終止反應,能讀取300-500個核苷酸序列。
2、經熱變性或鹼變性的雙鏈DNA模板 利用雙鏈質粒模板測序,其中有兩個至關重要的因素,即模板的質量和聚合酶的種類。用小量制備的質粒DNA來測定未知序列的DNA克隆,往往因為有污染而並不可取。高純度的質粒最好採用氯化銫-溴乙錠梯度平衡超速離心法制備。其次是應採用高質量的聚合酶。一次末端終止反應亦可能讀出300核苷酸序列。
(二)引物
酶法測序反應中都有一個與模板鏈特定序列互補的寡核苷酸作為DNA合成的引物。不管是單鏈DNA作模板,還是用變性雙鏈DNA作模板,都有通用引物可用,而不必另行設計與未知DNA序列互補的引物。通用引物可直接從廠商購買。
（三）DNA測序酶
該酶是一種經過化學修飾的T7噬菌體DNA聚合酶，是測定較長DNA的首選酶。市售的各種以該酶為基礎的測序試劑盒，效果甚佳。
(四)放射性標記
傳統的DNA測序方法都採用α-32P-dNTP作為放射性標記物,但由於32p發射的高能β射線，常會引起二個問題：首先是放射自顯影圖譜條帶擴散、解析度低，限制了識讀序列的數量和准確性；其次是32P衰變會導致DNA樣品分解，通常都應在測序反應後24小時內進行電泳,否則無法獲得好的結果。
近年來α-35S-dNTP被廣泛採用，是由於35S產生較弱的射線,克服了32P的二大缺點。放射自顯影圖譜具有較高的解析度和較低的本底，測序反應產物可在-20℃保存一周，而解析度並不下降。
（五）測序膠的准備及電泳
1、硅化玻璃板
2、配置電泳試劑和緩沖液
3、凝膠液的配置
4、電泳
5、電泳後凝膠的處理
(六)DNA序列的識讀
DNA序列的識讀: ①在顯影前後一定要注意標明模板名稱、日期和測序人等,並標明各套反應位置；②識讀時從顯而易見的特徵序列開始，如連續的同聚核昔酸(如TTTTT、AAAAA)或交替出現的嘌呤和嘧啶(如GTGTGTGT),一旦找到這種序列，便可較快地確定目的序列的位置。
三、注意事項
盡管核酸序列測定方法越來越成熟、簡便並且可以自動化，但事實上,對於一個片段較長、序列未知的待測核酸而言,仍然是一件耗時且繁瑣的工作。對於一個待測DNA分子,要制定一個能夠簡捷准確的測定方案，一般可以從以下幾個方面考慮：
1、DNA片段大小。
2、背景資料：是否清楚DNA限制性酶切圖譜,是否有一段已知序列,是否具有重復序列等。
3、測序目的: ①測定未知序列；②確定重組DNA的方向與結構；③對突變(如點突變)進行定位和鑒定；④比較性研究，如比較同種病毒不同株系之間的基因差異。後3種測序目的稱為確證性測序。
4、實驗條件：如手工測序還是自動化測序,合成引物費用等。
由於單套測序反應所能准確測定的DNA序列最長一般僅300-400bp。因此，在進行序列測定之前，必須首先考慮待測DNA分子的大小，其次是所要測定的序列范圍以及要求的序列精確程度等，再結合實驗室的條件選擇切實可行的克隆及測序方案。

DNA序列如何測定

一、常規DNA測序的原理

製作物理圖譜的過程是一個逐步精細的過程。第一步把每條染色體分成平均長度在400kb的長片段，每段克隆到一個YAC上，所有YAC克隆都按照其在染色體上的實際位置進行排序，我們就得到了一個能夠覆蓋整個染色體的YAC文庫。

把每一個YAC克隆攜帶的染色體片段經部分酶切形成一系列有重疊區域的40kb左右的片段克隆到粘粒上，得到粘粒文庫。每個粘粒上的染色體片段再經酶切形成4kb左右的片段克隆到測序專用的質粒載體上。測序質粒上攜帶的4kb的片段就可以用現在常規測序的方法進行測序了。把所有質粒克隆的DNA片段序列讀出，再按照各個片段在染色體上的實際位置進行排列，最後就可以得到染色體的全部核苷酸鹼基對序列。染色體的DNA鹼基序列是基因組物理圖譜的最精細形式。

所謂「常規測序方法」的基本特點有兩個：第一，把待測序的DNA分子進行處理，得到每個只差1個核苷酸的一系列逐步縮短的DNA分子的混合物；第二，通過凝膠電泳把這些DNA分子分離開來，形成階梯狀排列的條帶，然後逐個讀出DNA的鹼基序列。

二、化學法測序

得到長度只差一個鹼基的DNA分子的方法主要有兩種。一種是用化學方法把待測序的DNA片段在每個鹼基處切斷一次。這是由Maxam和Gilbert發明的方法。具體做法是把待測序的DNA分子成單鏈分子，其5』端用32p進行放射性標記。然後把這些單鏈DNA分於分成4份，每份用一種化學試劑處理DNA片段，每種試劑可使DNA分子在一種鹼基的5』端的磷酸二酯鍵處發生斷裂。例如，試劑一可使單鏈DNA分子在A鹼基處斷裂，試劑二可使單鏈DNA分子在T鹼基處斷裂，依此類推。把反應條件控制好，使每個DNA分子只發生一次斷裂，這樣，我們就得到4種反應產物，每種由在一種鹼基處發生斷裂形成的DNA片段組成。

把這4種反應產物用聚丙烯凝膠電泳進行分離，兩個DNA片段只要相差1個鹼基，就可以在這種凝膠中被分成兩個條帶。電泳完成後，用X光膠片進行曝光，最後得到一張由不同條帶組成的序列圖。從這張圖上就可以讀出待測DNA片段的鹼基序列。5』端的第一個鹼基G讀不出來，可以通過測定互補鏈的序列測出這個鹼基。

三、酸法測序與測序的自動化

另外一種得到長度只差一個鹼基的DNA分子的方法是英國科學家桑格發明的，這種方法利用DNA聚合酶以待測序的DNA單鏈分子為模版合成互補的新鏈。在合成新鏈時，合成原料除了4種脫氧核糖核苷酸外還加入一種2』和3』位上的羥基都脫除的核苷酸。由於缺少3』羥基，當這種核苷酸被結合到鏈上後，它的後面不能再結合其他核苷酸，鏈的合成就此終止。與化學法測序類似，我們可以准備4種反應物，加入的核苷酸類似物分別攜帶A，G，C，T鹼基，每種反應物里包含在一種鹼基處終止鏈延伸的長短不同的DNA片段。這些DNA片段也要用放射性標記，經過凝膠電泳和放射自顯影，得到DNA條帶圖譜，根據圖譜可以讀出DNA的鹼基序列。

這種方法比化學法簡單，條件易於控制。用4種不同的熒光化合物分別標記4種反應的產物，就可以做到把4種反應物混合在一起進行電泳，可以提高電泳分析的效率。這種方法利用現代精密儀器和機器人技術可以實現DNA測序的高度自動化。目前市場上已經有各種型號的DNA自動測序儀可供選購。

根據最新計劃，到2000年人類基因組的「草稿」要出來。這個「草稿」包含了90％的人類基因組的序列，每個區域測定5次左右。到2003年完整的人類基因組序列測定可以完成，這個序列可以作為「參考基因組」或者「標准基因組」用於生物醫學研究。測定這個「標准基因組」所用的DNA是由10到20位志願者提供的，用男性的精子DNA和女性的血液DNA作為樣品構建了人的基因組文庫，因此，「標准基因組」序列不是哪一個具體的人的序列，而是幾十位志願者的序列的綜合體現。

四、單分子熒光測序

單分於熒光測序是一種快速DNA測序法，這是利用單分子操作技術直接讀取DNA的鹼基序列的方法，與傳統的熒光測序法相比，這種方法可大大提高速度。用桑格測序方法現在每天可以解讀上萬個鹼基序列，但是如果單分子熒光測序取得成功，它可以在兩分鍾內完成傳統方法一天的工作。

單分於熒光測序的主要過程如下。第一步，取一條大約有5萬個鹼基那麼長的單鏈DNA分子，把它的一端用化學方法連接在一個非常微小的塑料球上，DNA分子就會纏繞在塑料球上。第二步，在一張類似激光唱片的圓盤上鋪一層很薄的液體薄膜，然後用激光光鉗把塑料球放在這張光碟的液體膜上進行移動，DNA分子就會在後面被拖著展開，就好像一隻船拖著一條繩子快速前進，把繩子拉展一樣。第三步，讓拉展的的DNA分子與一種核酸外切酶結合。這種核酸外切酶可以和DNA的游離的末端結合，然後逐個把DNA的鹼基切割下來。第四步，用單分子光譜技術逐個識別並且讀出鹼基即達到了測序的目的。

目前，單分子熒光測序技術還沒有完全成熟。主要問題是用於識別單個鹼基的單分子光譜技術還沒有過關。利用隧道掃描顯微鏡和原子力顯微鏡直接讀取DNA分子鹼基序列的研究也正在進行之中，近期內有可能取得突破。

五、DNA晶元與雜交測序

DNA晶元是一種通過雜交測定未知DNA序列的新技術。在一個玻璃或矽片上合成大量的寡聚核苷酸片段，例如可以合成8個鹼基長的全部可能的寡聚核苷酸片段（48＝65，536種）。這些探針一頭固定在固體基質上，另外一端是游離的。它們在矽片上有規律地排列著，每個特定位置上探針的序列都是已知的。

假如有一個DNA片段需要測序，我們可以把它的單鏈形式用熒光進行標記，然後與矽片上的6萬多種探針進行分子雜交，在熒光顯微鏡下觀察雜交結果。如果某個探針與持測DNA的某個部分的序列是完全互補的，待測DNA分子就被結合到矽片上，這個探針所在的位置就會發出熒光。這種包含大量的生物遺傳信息的寡聚核著酸陣列就叫DNA晶元，也叫基因晶元。

DNA晶元的制備要利用微電子晶元生產中的光刻技術以及在位組合化學技術。DNA晶元的閱讀要使用顯微術，信息的解讀要利用計算機技術。因此，DNA晶元是多學科交叉的產物。
參考資料：http://www.wsjk.com.cn/gb/paper124/1/class012400001/hwz92638.htm

H. 基因測序的步驟是什麼

PCR產物直接測序技術現已成為分子生物學和基因組學研究中的一個重要技術,廣泛用於基因突變檢測、遺傳性疾病診斷、單核苷酸多態性研究、基因組重疊序列群等.與傳統克隆測序技術相比較,直接對PCR擴增的DNA進行測序,省去了耗時的克隆步驟,避免了傳統的細菌培養,模板提取等重復性操作,可以從少量的原始樣品中得到正確的DNA序列信息.PCR產物直接測序技術具有快速、簡便、穩定經濟的優點.
試驗試劑
PCR擴增的雙鏈DNA模板
長約20個核苷酸的DNA引物
DNA聚合酶
測序膠
0.1mol/L DDT
α-32P-dATP
dNTP/ddNTP混合物(80μmol/L/8μmol/L)
dNTP(dCTP、dGTP 、dTTP 各0.75μmol/L)
測序反應緩沖液：40mmol/L Tris-HCl(pH7.5),20mmol/L MgCl2,50mmol/L NaCl
終止緩沖液：95% 甲醯胺,20mmol/L EDTA,0.05% 溴酚藍,0.05% 二甲苯腈
試驗步驟：
1、 4個微量離心管中各加入dNTP/ddNTP混合物2.5μl,混合物37OC溫浴5min,備用.
2、 在一個空的微量離心管中加入1pmol的PCR擴增雙鏈DNA,10pmol測序引物,2μl 5×測序緩沖液,加雙蒸水至總體積10μl,96OC加熱8min,冰浴泠卻1min,4OC 10000g離心10s.
3、 加入2μl預冷的標記混合物(dCTP、dGTP 、dTTP 各0.75μmol/L),α-32P-dATP 5μCi,1μl 0.1mol/L DDT,測序酶2U,加水至15μl,混勻後置冰上2min,標記新合成的DNA鏈.
4、 在第1步驟的4個管中各加入3.5μl標記反應混合物,37OC溫浴5min.每管各加入4μl終止液.
5、 樣品在80OC的水浴中熱變性5min,每一泳道加2μl 加到測序膠上,電泳分離這些片段.
注意事項：
1.?PCR產物要有一定的長度(>200bp),因為測序結果兩端20-30bp的電泳峰圖的准確性較低.
2.?純化PCR產物可通過離子交換層析使擴增的DNA段與反應剩餘的dNTP及引物分離；也可通過瓊脂糖凝膠電泳,將PCR產物與非特異性擴增產物和引物分離開來；如果擴增的特異性較高時,可直接通過酚：氯仿抽提,乙醇沉澱的方法來純化.
3.?測序引物設計原則類似於PCR引物設計,可在DNA合成儀上合成20個左右的核苷酸作為引物,經過高壓液相層析或聚丙烯醯胺凝膠電泳純化後,即可用作測序引物.
PCR循環測序法
PCR循環測序法是將PCR擴增和核酸序列分析技術相結合,從而形成的一種測定核苷酸序列的研究方法,也稱作線性擴增測序.該方法採用PCR儀加熱使DNA模板變性,在TaqDNA聚合酶作用下,以溫度循環模式在模板上進行多輪的雙脫氧核苷酸測序反應,線性擴增標記的DNA分子.
PCR循環測序法與以往的測序方法相比,其優點在於：大大減少所需的模板量；能提高測序反應產生的信號,降低了操作的復雜性,且聚合酶的用量減少；可在小量制備的模板上進行篩選反應；高溫下進行的測序反應使DNA聚合酶催化的聚合反應能夠通過模板二級結構的區域；雙鏈閉環DNA可以直接作為反應模板應用,不用作預先鹼變性處理.由於PCR循環測序法能夠簡單、快速地檢測特定序列,因此, PCR循環測序法在核酸序列分析研究中受到廣泛的重視.
試驗試劑：
DNA測序試劑盒
dNTP
ddNTP
丙烯醯胺
雙丙烯醯胺
尿素
TEMED(N,N,N『,N』-四甲基乙二胺)
過硫酸銨
6%測序膠：6%丙烯醯胺,7mmol/L 尿素,1×TBE.
10×測序緩沖液：100mmol/L Tris-HCl(pH8.8),500mmol/L KCl,40mmol/L MgCl2,0.01%明膠,20μmol/L dATP,50μmol/L dCTP,50μmol/L dGTP,50μmol/L dTTP
終止混合液：ddATP (600μmol/L),ddCTP (600μmol/L),ddGTP (100μmol/L),ddTTP(1000μmol/L)
終止緩沖液：95%甲醯胺,20mmol/L EDTA,0.05%溴酚藍,0.05%二甲苯腈
試驗步驟
1、 4個小離心管,每個小管加入3μl的終止混合液,將管子放在冰上.
2、 在DNA模板中加入引物(4pmol), 4μl 10×測序緩沖液, 10μlα-32P-dATP, 2U TaqDNA聚合酶,加雙蒸水到30μl徹底混勻,每管7μl加入上面4個小管中.
3、 反應液上加30μl的石蠟油.
4、 95OC 30S,50OC 30S,72OC 60S共30個循環,可根據具體的情況進行適當的調整循環條件及循環次數.
5、 反應結束後在油層下加入5μl的終止緩沖液並用加樣槍混勻.
6、 上樣前將樣品在大於80OC的水浴中熱變性5min,每一道加2μl加到測序膠上,電泳分離這些片段.
注意事項：
1、 制備測序模板：PCR 擴增的產物可以經過低熔點的瓊脂糖凝膠電泳純化回收後,用於序列分析；可經過柱層析純化,去除PCR 反應後剩餘的dNTP和引物後,用於序列分析.PCR 產物也可不經純化直接用於測序,但是這種測序產生的結果較差,建議測序之前應進行PCR產物的純化.各種標準的質粒制備方法所純化出的質粒均可作為測序模板使用.用標准方法制備的M13噬菌體、粘粒、λDNA都適合用作測序模板用.但要注意的是反應體系中不應有與引物互補的非目的基因序列,否則將會導致測序實驗的失敗.
2、 測序引物：測序引物是指合成的與測序模板鏈特異性互補的寡核苷酸序列.可用α-32P-dATP和T4多聚核苷酸激酶對引物的5『端進行標記,反應體系中引物、激酶和α-32P-dATP要保持在最佳的比例,以得到高比活性的標記引物；也可用α-32P-dATP標記新合成的DNA鏈.引物的濃度不宜高,否則容易形成引物二聚體,或產生非特異性的擴增引物.
3、 酶：各種缺乏3『—5『端外切活性的耐熱DNA聚合酶都可以用於循環測序,其中TaqDNA聚合酶在DNA測序中最為常用.雖然應用PCR循環測序法能夠簡單、快速的進行基因序列的測定,但仍未能適應大規模DNA序列測定的需要,而PCR循環測序法、熒游標記和自動測序儀的聯合使用成為大規模基因組測序的主要技術.該技術是採用熒游標記引物或雙脫氧核苷三磷酸,反應產物經聚丙烯醯胺凝膠電泳後,經特定的DNA序列分析儀和分析系統處理待測的DNA序列.它的應用減輕了DNA序列測定的工作量,提高了測序的效率.

I. 基因工程中轉化的方法有哪些什麼是載體轉化法

通過轉化將載體DNA導入受體菌繼而得到含有目的DNA插入的轉化菌株是構建DNA文庫最為關鍵的一步。
化學法(化學葯物如氯化鈣等)轉化
氯化鈣法轉化細胞 細菌處於0℃及CaCl2低滲溶液中時，菌細胞膨脹成球形。轉化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物粘附於細胞表面，經42℃短時間熱擊處理促進細胞吸收DNA復合物。

直接分離基因最常用的方法是「鳥槍法」，又叫「散彈射擊法」。具體做法：用限制酶將供體細胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運載體，然後通過運載體分別載人不同的受體細胞，讓供體細胞所提供的DNA（外源DNA）的所有片段分別在各個受體細胞中大量復制（在遺傳學中叫擴增），從中找出含有目的基因的細胞，再用一定的方法把帶有目的基因的DNA片段分離出來。但這種方法工作量大，具有一定的盲目性。20世紀80年代以後，隨著DNA核苷酸序列分析技術的發展，人們已經可以通過DNA序列自動測序儀對提取出的基因進行核苷酸序列分析，並且通過一種擴增DNA的新技術（也叫PCR技術），使目的基因片段在短時間內成百萬倍地擴增。上述新技術的出現大大簡化了基因工程的操作技術。

J. 說明酶法測核酸序列的原理

• 利用大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ，以單鏈DNA為模板，並以與模板事先結合的寡聚核苷酸為引物，根據鹼基配對原則將脫氧核苷三磷酸（dNTP）底物的5′-磷酸基團與引物的3′-OH末端生成3′,5′-磷酸二酯鍵。通過這種磷酸二酯鍵的不斷形成，新的互補DNA得以從5′→3′延伸。Sanger引入了雙脫氧核苷三磷酸（ddTNP）作為鏈終止劑。ddTNP比普通的dNTP在3′位置缺少一個羥基（2′,3′-ddNTP）（圖7-4-1），可以通過其5′三磷酸基團摻入到正在增長的DNA鏈中，但由於缺少3′-OH，不能同後續的dNTP形成3′,5′-磷酸二酯鍵。因此，正在增長的DNA鏈不再延伸，使這條鏈的延伸終止於這個異常的核苷酸處。這樣，在4組獨立的酶反應體系中，在4種dNTP混合底物中分別加入4種ddNTP中的一種後，鏈的持續延伸將與隨機發生卻十分特異的鏈終止展開競爭，在摻入ddTNP的位置鏈延伸終止。結果產生4組分別終止於模板鏈的每一個A、每一個C、每個G和每一個T位置上的一系列長度的核苷酸鏈。通過高解析度變性聚丙烯醯胺凝膠電泳，從放射自顯影膠片上直接讀出DNA上的核苷酸順序。