tcr擴增產物的分析方法主要有

『壹』 目前的定量pcr方法基本上可歸為哪幾種

1、外參法+終產物分析。外參法是指樣本與陽性參照在兩個反應容器內反應。
2、內參法+終產物分析。謂「內參法」是指樣本與陽性參照在一個反應容器內反應。
3、外標法+過程監測。這種類型監測擴增效率，陽性樣本定量准，但是無法排除假陰結果。
4、內參法+過程監測。由於樣本與陽性參照在一個容器內反應，用同樣的Taq酶和反應參與物，存在竟爭性抑制。
5、外標法+過程監測+內對照。這種類型監測擴增效率，陽性樣本定量准，同時排除假陰結果。上述是定量pcr方法的五種類型。

『貳』 介紹一下 PCR

聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優點；能在一個試管內將所要研究 的目的基因或某一DNA片段於數小時內擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研 究和檢測鑒定。過去幾天幾星期才能做到的事情，用PCR幾小時便可完成。PCR技術是生物醫學領域中的一項革命性創舉和里程碑。

PCR技術簡史
PCR的最早設想 核酸研究已有100多年的歷史，本世紀60年代末、70年代初人們致力於研究基因的體外分離技術，Korana於1971年最早提出核酸體外擴增的設想：「經過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，並不斷重復該過程便可克隆tRNA基因」。
PCR的實現 1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應。其原理類似於DNA的體內復制，只是在試管中給 DNA的體外合成提供以致一種合適的條件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復性及延伸的溫度與時間。
PCR的改進與完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的 Klenow片段，其缺點是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會變性失活，每次循環都要重新加。②引物鏈延伸反應在37℃下進行，容易發生模板和引物之 間的鹼基錯配，其PCR產物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術雖較傳統的基因擴增具備許多突出的優點，但由於 Klenow酶不耐熱，在DNA模板進行熱變性時，會導致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個擴增反應周期，給PCR技術操作程序添了不少困難。這使得 PCR技術在一段時間內沒能引起生物醫學界的足夠重視。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進行PCR，其擴增的DNA片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點：①耐高溫，在70℃下反應2h後其殘留活性大於原來的90%，在93℃下反應2h後其殘留活性是原來的 60%，在95℃下反應2h後其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應後再加新酶。③大大提高了擴增片段特異性和擴增效 率，增加了擴增長度(2.0Kb)。由於提高了擴增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發現使PCR廣泛的被應用。

PCR技術基本原理
PCR技術的基本原理 類似於DNA的 天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加 熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引 物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的「半保留復制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需 2～4分鍾，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平台期(Plateau)所需循環次數取決於樣品中模板的拷貝。
PCR的反應動力學 PCR的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數上升。反應最終的DNA 擴增量可用Y＝(1＋X)n計算。Y代表DNA片段擴增後的拷貝數，X表示平(Y)均每次的擴增效率，n代表循環次數。平均擴增效率的理論值為100%， 但在實際反應中平均效率達不到理論值。反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數形式，隨著PCR產物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數增加，而進 入線性增長期或靜止期，即出現「停滯效應」，這種效應稱平台期數、PCR擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產物的竟爭等因素。大多數情 況下，平台期的到來是不可避免的。
PCR擴增產物 可分為長產物片段和短產物片段兩部分。短產物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5』端之間，是需要擴增的特定片段。短產物片段和長產物片段是由於引物所 結合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應周期中，以兩條互補的DNA為模板，引物是從3』端開始延伸，其5』端是固定的，3』端則沒 有固定的止點，長短不一，這就是「長產物片段」。進入第二周期後，引物除與原始模板結合外，還要同新合成的鏈(即「長產物片段」)結合。引物在與新鏈結合 時，由於新鏈模板的5』端序列是固定的，這就等於這次延伸的片段3』端被固定了止點，保證了新片段的起點和止點都限定於引物擴增序列以內、形成長短一致的 「短產物片段」。不難看出「短產物片段」是按指數倍數增加，而「長產物片段」則以算術倍數增加，幾乎可以忽略不計， 這使得PCR的反應產物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。

PCR反應體系與反應條件
標準的PCR反應體系：
10×擴增緩沖液 10ul
4種dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加雙或三蒸水至 100ul
PCR反應五要素： 參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物： 引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決於引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。
設計引物應遵循以下原則：
①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。
②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。
③引物鹼基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3』端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。
⑤引物3』端的鹼基，特別是最末及倒數第二個鹼基，應嚴格要求配對，以避免因末端鹼基不配對而導致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應與核酸序列資料庫的其它序列無明顯同源性。

引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。
酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。
dNTP的質量與濃度 dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度後，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調節到7.0～7.5，小量分裝， -20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配製)，如其中任何一種濃度不同於其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。
模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環節之一，傳統的DNA純化方法通常採用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。 SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，並解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質結合而沉澱；蛋白酶K能水解消化蛋白質，特別是與DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉澱 核酸。提取的核酸即可作為模板用於PCR反應。一般臨床檢測標本，可採用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接 用於PCR擴增。RNA模板提取一般採用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產物減少。
PCR反應條件的選擇
PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。
溫度與時間的設置： 基於PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標准反應中採用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火並結合到靶序列上，然後快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對於較短靶基因(長度為100～300bp時)可採用二溫度點法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般採用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。
①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低於93℃則 需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性，就會導致PCR失敗。
②退火(復性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性後溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發生結合。由於模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高於模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決於引物的長度、鹼基組成及其濃度，還有靶基序列的長 度。對於20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：
Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)
復性溫度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允許范圍內， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合。
③延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高於90℃時， DNA合成幾乎不能進行。

PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利於引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間，可根據待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min是足夠 的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。
循環次數 循環次數決定PCR擴增程度。PCR循環次數主要取決於模板DNA的濃度。一般的循環次數選在30～40次之間，循環次數越多，非特異性產物的量亦隨之增多。

PCR反應特點
特異性強 PCR反應的特異性決定因素為：
①引物與模板DNA特異正確的結合；
②鹼基配對原則；
③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；
④靶基因的特異性與保守性。
其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循鹼基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合(復性)可以在較高的溫度下進行，結合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區，其特異性程度就更高。
靈敏度高 PCR產物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克(pg=10-12g)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=10-6g)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。
簡便、快速 PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應液加好後，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在2～4 小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。
對標本的純度要求低 不需要分離病毒或細菌及培養細胞，DNA 粗製品及總RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活組織等粗製的DNA擴增檢測。 PCR擴增產物分析
PCR產物是否為特異性擴增 ，其結果是否准確可靠，必須對其進行嚴格的分析與鑒定，才能得出正確的結論。PCR產物的分析，可依據研究對象和目的不同而採用不同的分析方法。
凝膠電泳分析：PCR產物電泳，EB溴乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產物的特異性。PCR產物片段的大小應與預計的一致，特別是多重PCR，應用多對引物，其產物片斷都應符合預訐的大小，這是起碼條件。
瓊脂糖凝膠電泳： 通常應用1～2%的瓊脂糖凝膠，供檢測用。
聚丙烯醯胺凝膠電泳：6～10%聚丙烯醯胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用於科研及檢測分析。
酶切分析：根據PCR產物中限制性內切酶的位點，用相應的酶切、電泳分離後，獲得符合理論的片段，此法既能進行產物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異性研究。
分子雜交：分子雜交是檢測PCR產物特異性的有力證據，也是檢測PCR 產物鹼基突變的有效方法。
Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內部寡核苷酸)標記後做探針，與PCR產物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測PCR產物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用於科研。
斑點雜交： 將PCR產物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內部寡核苷酸探針雜交，觀察有無著色斑點，主要用於PCR產物特異性鑒定及變異分析。
核酸序列分析：是檢測PCR產物特異性的最可

『叄』 pcr要加入什麼原料 是否需要RNA引物

無明顯同源性.
引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol,以最低引物量產生所需要的結果為好,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會.
酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應, 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,另一種為大腸菌合成的基因工程酶.催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100ul時),濃度過高可引起非特異性擴增,濃度過低則合成產物量減少.
dNTP的質量與濃度 dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系,dNTP粉呈顆粒狀,如保存不當易變性失去生物學活性.dNTP溶液呈酸性,使用時應配成高濃度後,以1M NaOH或1M Tris.HCL的緩沖液將其PH調節到7.0～7.5,小量分裝, -20℃冰凍保存.多次凍融會使dNTP降解.在PCR反應中,dNTP應為50～200umol/L,尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配製),如其中任何一種濃度不同於其它幾種時(偏高或偏低),就會引起錯配.濃度過低又會降低PCR產物的產量.dNTP能與Mg2+結合,使游離的Mg2+濃度降低.
模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度,是PCR成敗與否的關鍵環節之一,傳統的DNA純化方法通常採用SDS和蛋白酶K來消化處理標本. SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質,因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜,並解離細胞中的核蛋白,SDS 還能與蛋白質結合而沉澱；蛋白酶K能水解消化蛋白質,特別是與DNA結合的組蛋白,再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份,用乙醇或異丙醇沉澱 核酸.提取的核酸即可作為模板用於PCR反應.一般臨床檢測標本,可採用快速簡便的方法溶解細胞,裂解病原體,消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離,直接 用於PCR擴增.RNA模板提取一般採用異硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA.
Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響,在一般的PCR反應中,各種dNTP濃度為200umol/L時,Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜.Mg2+濃度過高,反應特異性降低,出現非特異擴增,濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性,使反應產物減少.
PCR反應條件的選擇
PCR反應條件為溫度、時間和循環次數.
溫度與時間的設置： 基於PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點.在標准反應中採用三溫度點法,雙鏈DNA在90～95℃變性,再迅速冷卻至40 ～60℃,引物退火並結合到靶序列上,然後快速升溫至70～75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸.對於較短靶基因(長度為100～300bp時)可採用二溫度點法, 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般採用94℃變性,65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性).
①變性溫度與時間：變性溫度低,解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因.一般情況下,93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性,若低於93℃則 需延長時間,但溫度不能過高,因為高溫環境對酶的活性有影響.此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性,就會導致PCR失敗.
②退火(復性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素.變性後溫度快速冷卻至40℃～60℃,可使引物和模板發生結合.由於模板DNA 比引物復雜得多,引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高於模板互補鏈之間的碰撞.退火溫度與時間,取決於引物的長度、鹼基組成及其濃度,還有靶基序列的長 度.對於20個核苷酸,G+C含量約50%的引物,55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想.引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：
Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)
復性溫度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允許范圍內, 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合,提高PCR反應的特異性.復性時間一般為30～60sec,足以使引物與模板之間完全結合.
③延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高於90℃時, DNA合成幾乎不能進行.
PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間,常用溫度為72℃,過高的延伸溫度不利於引物和模板的結合.PCR延伸反應的時間,可根據待擴增片段的長度而定,一般1Kb以內的DNA片段,延伸時間1min是足夠 的.3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min.延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現.對低濃度模板的擴增,延伸時間要稍長些.
循環次數 循環次數決定PCR擴增程度.PCR循環次數主要取決於模板DNA的濃度.一般的循環次數選在30～40次之間,循環次數越多,非特異性產物的量亦隨之增多.
PCR反應特點
特異性強 PCR反應的特異性決定因素為：
①引物與模板DNA特異正確的結合；
②鹼基配對原則；
③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；
④靶基因的特異性與保守性.
其中引物與模板的正確結合是關鍵.引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循鹼基配對原則的.聚合酶合成反應的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性,使反應中模板與引物的結合(復性)可以在較高的溫度下進行,結合的特異性大大增加,被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度.再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區,其特異性程度就更高.
靈敏度高 PCR產物的生成量是以指數方式增加的,能將皮克(pg=10-12g)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=10-6g)水平.能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中,PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學中最小檢出率為3個細菌.
簡便、快速 PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶,一次性地將反應液加好後,即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應,一般在2～4 小時完成擴增反應.擴增產物一般用電泳分析,不一定要用同位素,無放射性污染、易推廣.
對標本的純度要求低 不需要分離病毒或細菌及培養細胞,DNA 粗製品及總RNA均可作為擴增模板.可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活組織等粗製的DNA擴增檢測. PCR擴增產物分析
PCR產物是否為特異性擴增 ,其結果是否准確可靠,必須對其進行嚴格的分析與鑒定,才能得出正確的結論.PCR產物的分析,可依據研究對象和目的不同而採用不同的分析方法.
凝膠電泳分析：PCR產物電泳,EB溴乙錠染色紫外儀下觀察,初步判斷產物的特異性.PCR產物片段的大小應與預計的一致,特別是多重PCR,應用多對引物,其產物片斷都應符合預訐的大小,這是起碼條件.
瓊脂糖凝膠電泳： 通常應用1～2%的瓊脂糖凝膠,供檢測用.
聚丙烯醯胺凝膠電泳：6～10%聚丙烯醯胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好,條帶比較集中,可用於科研及檢測分析.
酶切分析：根據PCR產物中限制性內切酶的位點,用相應的酶切、電泳分離後,獲得符合理論的片段,此法既能進行產物的鑒定,又能對靶基因分型,還能進行變異性研究.
分子雜交：分子雜交是檢測PCR產物特異性的有力證據,也是檢測PCR 產物鹼基突變的有效方法.
Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內部寡核苷酸)標記後做探針,與PCR產物雜交.此法既可作特異性鑒定,又可以提高檢測PCR產物的靈敏度,還可知其分子量及條帶形狀,主要用於科研.
斑點雜交： 將PCR產物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上,再用內部寡核苷酸探針雜交,觀察有無著色斑點,主要用於PCR產物特異性鑒定及變異分析.
核酸序列分析：是檢測PCR產物特異性的最可

『肆』 PCR的擴增產物是什麼 是如何擴增出來的

產物是目的基因
就是先把目的基因的兩條鏈用加熱的方式解開使之成為單鏈
加入的引物（一小段DNA）通過DNA聚合酶和目的基因連接並擴展出另一條鏈
反復幾次就完了

『伍』 PCR產物的檢測方法有哪些都有什麼原理

1.瓊脂糖凝膠電泳
同時點分子量marker，根據marker條帶判斷產物分子量大小，從而大致判斷是不是你要的
2.酶切
已知你產物的序列，看上面有什麼酶切位點，用一個酶或者兩個酶切斷，看與理論預測的條帶數目和大小是否一致。一般檢測有以上兩步就行了，如果需要知道確切的需要進行3
3.測序
連接到pMD-18t
載體上，轉到大腸桿菌中。拿到公司去測序，測序結果通過gene
bank比對看與哪個基因一致，這種方法最准確
4.表達
pcr產物連到真核或者原核表達載體上，適宜條件表達出來以後的蛋白做質譜分析，看與理論產物表達的蛋白是否有一致的片段

『陸』 PCR擴增後的片段 用什麼方法檢測

聚合酶鏈式擴增反應。

通過電泳進行產物定量只是相對的大概估算，一般的marker都有這樣的功能，比如你的產物小於2000bp的話，你在泳道加入5ul 的TAKARA的DL2000marker，其中最亮的一條帶750bp含量約為150ng，其他的條帶約為50ng，根據你的條帶的明暗和marker進行比較，即可粗略的估算你的產物的量。

『柒』 pcr擴增的原理和步驟

實驗方法原理

①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至94℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做准備；

②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。

重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的「半保留復制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鍾， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

典型的PCR包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三個步驟，通過將這一套過程不斷循環，使DNA得以成百萬倍的擴增。

(7)tcr擴增產物的分析方法主要有擴展閱讀

PCR技術，即聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）是由美國PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年獲諾貝爾化學獎）建立的。

這項技術可在試管內的經數小時反應就將特定的DNA片段擴增數百萬倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術在分子生物學研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動了生命科學的研究進展。

它不僅是DNA分析最常用的技術，而且在DNA重組與表達、基因結構分析和功能檢測中具有重要的應用價值。

PCR可以被認為是與發生在細胞內的DNA復制過程相似的技術，其結果都是以原來的DNA為模板產生新的互補DNA片段。細胞中DNA的復制是一個非常復雜的過程。參與復制的有多種因素。PCR是在試管中進行的DNA復制反應，基本原理與細胞內DNA復制相似，但反應體系相對較簡單。

PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至94℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做准備；

②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。

重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的「半保留復制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鍾， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

『捌』 舉出至少4中PCR技術的原理及應用~

PCR技術的基本原理 類似於DNA的天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的「半保留復制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鍾， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

(Plateau)。 到達平台期所需循環次數取決於樣品中模板的拷貝

PCR的反應動力學 PCR的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數上升。反應最終的DNA 擴增量可用Y＝(1＋X)n計算。Y代表DNA片段擴增後的拷貝數，X表示平(Y)均每次的擴增效率，n代表循環次數。平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應中平均效率達不到理論值。 反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數形式，隨著PCR產物的逐漸積累，被擴增的DNA 片段不再呈指數增加，而進入線性增長期或靜止期， 即出現「停滯效應」 ，這種效應稱平台期數、PCR 擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產物的竟爭等因素。大多數情況下，平台期的到來是不可避免的。

PCR擴增產物 可分為長產物片段和短產物片段兩部分。短產物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5''端之間，是需要擴增的特定片段。短產物片段和長產物片段是由於引物所結合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應周期中， 以兩條互補的DNA為模板，引物是從3''端開始延伸， 其5''端是固定的，3'' 端則沒有固定的止點，長短不一，這就是「長產物片段」。進入第二周期後，引物除與原始模板結合外，還要同新合成的鏈(即「長產物片段」)結合。引物在與新鏈結合時， 由於新鏈模板的5''端序列是固定的， 這就等於這次延伸的片段3''端被固定了止點， 保證了新片段的起點和止點都限定於引物擴增序列以內、形成長短一致的「短產物片段」。不難看出「短產物片段」是按指數倍數增加， 而「長產物片段」則以算術倍數增加， 幾乎可以忽略不計， 這使得PCR的反應產物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。

PCR反應體系與反應條件

標準的PCR反應體系：

10×擴增緩沖液 10ul
4種dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加雙或三蒸水至 100ul

PCR反應五要素： 參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物： 引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決於引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。

設計引物應遵循以下原則：

①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。
②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。
③引物鹼基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3''端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。
⑤引物3''端的鹼基，特別是最末及倒數第二個鹼基，應嚴格要求配對，以避免因末端鹼基不配對而導致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應與核酸序列資料庫的其它序列無明顯同源性。

引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。

酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2。5U(指總反應體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。

dNTP的質量與濃度 dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度後，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調節到7.0～7.5，小量分裝， -20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配製)，如其中任何一種濃度不同於其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。

模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環節之一，傳統的DNA純化方法通常採用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，並解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質結合而沉澱； 蛋白酶K能水解消化蛋白質，特別是與DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉澱核酸。提取的核酸即可作為模板用於PCR反應。一般臨床檢測標本，可採用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接用於PCR擴增。RNA模板提取一般採用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產物減少。

PCR反應條件的選擇

PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。

溫度與時間的設置： 基於PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標准反應中採用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火並結合到靶序列上，然後快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對於較短靶基因(長度為100～300bp時)可採用二溫度點法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般採用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。

①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低於93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性，就會導致PCR失敗。

②退火(復性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性後溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發生結合。由於模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高於模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決於引物的長度、鹼基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對於20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：
Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)
復性溫度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允許范圍內， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合， 提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合。

③延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高於90℃時， DNA合成幾乎不能進行。

PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利於引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間，可根據待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min是足夠 的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。

循環次數 循環次數決定PCR擴增程度。PCR循環次數主要取決於模板DNA的濃度。一般的循環次數選在30～40次之間，循環次數越多，非特異性產物的量亦隨之增多。

PCR反應特點

特異性強：

PCR反應的特異性決定因素為：
①引物與模板DNA特異正確的結合；
②鹼基配對原則；
③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；
④靶基因的特異性與保守性。

其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循鹼基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合(復性)可以在較高的溫度下進行，結合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區，其特異性程度就更高。

靈敏度高：

PCR產物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克(pg=10- 12)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=-6)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。

簡便、快速：

PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應液加好後，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在2～4 小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。

對標本的純度要求低：

不需要分離病毒或細菌及培養細胞，DNA 粗製品及總RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活組織等粗製的DNA擴增檢測。

PCR擴增產物的分析

PCR產物是否為特異性擴增 ，其結果是否准確可靠，必須對其進行嚴格的分析與鑒定，才能得出正確的結論。PCR產物的分析，可依據研究對象和目的不同而採用不同的分析方法。

凝膠電泳分析：PCR產物電泳，EB溴乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產物的特異性。PCR產物片段的大小應與預計的一致，特別是多重PCR，應用多對引物，其產物片斷都應符合預訐的大小，這是起碼條件。

瓊脂糖凝膠電泳： 通常應用1～2%的瓊脂糖凝膠， 供檢測用。

聚丙烯醯胺凝膠電泳：6～10%聚丙烯醯胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用於科研及檢測分析。

酶切分析：根據PCR產物中限制性內切酶的位點，用相應的酶切、電泳分離後，獲得符合理論的片段，此法既能進行產物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異性研究。

分子雜交：分子雜交是檢測PCR產物特異性的有力證據，也是檢測PCR 產物鹼基突變的有效方法。

Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內部寡核苷酸)標記後做探針，與PCR產物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測PCR產物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用於科研。

斑點雜交： 將PCR產物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內部寡核苷酸探針雜交，觀察有無著色斑點，主要用於PCR產物特異性鑒定及變異分析。

核酸序列分析：是檢測PCR產物特異性的最可靠方法。

『玖』 實時定量PCR的結果是怎樣分析的

1、如果有標准曲線，按照標准曲線計算。

2、一般都是相對量，則用delta delta CT方法來計算。

3、舉例如下：對照組基因A的CT值為20， 內參（比如βactin)CT值15。實驗組基因A CT值18，內參CT值14。

4、首先算加樣量：delta CT=15-14=1。2的1次方是2。也就是說實驗組的加樣量是對照組的2倍。基因A: delta CT=20-18=2。2的2次方是4。也就是說基因A的量在實驗組是對照組的4倍。但是由於加樣量是2倍，所以4處以2=2，最後的相對量是2倍。

5、幾點注意：必須確定擴增的特異性，只有相同目標的CT值才能相減（擴增效率有可能不同），2的某次方只是理論值，實際擴增效率低於2，最好不用Syber Green。

(9)tcr擴增產物的分析方法主要有擴展閱讀：

PCR原理：

1、PCR技術的基本原理類似於DNA的天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

2、PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：

①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

②模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模板-引物結合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。每完成一個循環需2～4分鍾，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

參考資料來源：網路--PCR反應

『拾』 核糖核酸檢測步驟

1、核酸提取使用硅膠柱離心、磁性硅膠顆粒分離方法以及自動化儀器等商品化試劑或設備並按說明書操作。提取RNA時應注意防止RNA降解。DNA應置於-20℃保存，RNA和需長期保存的DNA應置於-80℃保存。
2、逆轉錄合成cDNA。逆轉錄cDNA合成反應需使用逆轉錄引物、dNTPs、逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、DTT、緩沖液和適量無RNA/DNA酶的超純水以及RNA模板。在擴增儀或水浴箱中，在規定的溫度和時間下進行逆轉錄反應。
3、PCR擴增反應PCR反應需使用引物、dNTPs、DNA聚合酶、緩沖液、和適量無RNA/DNA酶超純水、以及模板。在擴增儀中，按照設定的程序進行擴增。使用二次擴增的套式PCR擴增方法。
4、擴增產物定性分析；擴增產物常用分析方法是瓊脂糖凝膠電泳法，與分子量標准比較，判斷擴增片段是否在預期的分子量范圍內。其它擴增產物分析方法還有限制性內切酶酶切分析、特異性探針雜交分析以及DNA序列分析等。
5、結果判定和完成報告單：每一次檢測需同時做兩個陽性對照、兩個陰性對照，只有陽性對照擴增出預期的片段、陰性對照沒有擴增出任何片段、雙份平行樣品結果一致的情況下實驗才成立，可以作出核酸陽性或陰性反應結果的判定。
(10)tcr擴增產物的分析方法主要有擴展閱讀：
檢測新型冠狀病毒特異序列的方法最常見的是熒光定量PCR。因PCR反應模板僅為DNA，因此在進行PCR反應前，應將新型冠狀病毒核酸逆轉錄為DNA。在PCR反應體系中，
包含一對特異性引物以及一個Taqman探針，該探針為一段特異性寡核苷酸序列，兩端分別標記了報告熒光基團和淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；
如反應體系存在靶序列，PCR反應時探針與模板結合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性將探針酶切降解，報告基團與淬滅基團分離，發出熒光。
每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子產生。熒光定量PCR儀能夠監測出熒光到達預先設定閾值的循環數與病毒核酸濃度有關，病毒核酸濃度越高， Ct值越小。不同生產企業的產品會依據自身產品的性能確定本產品的陽性判斷值。
參考資料：網路——核酸檢測法