肝細胞原代培養方法研究進展論文

『壹』 肝細胞培養

膠原酶的化學名為膠原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理PH和溫度條件下特異性地水解天然膠原蛋白的三維螺旋結構，而不損傷其它蛋白質和組織。膠原酶的化學本質是一種蛋白質，因此，這對溫度、PH和導致蛋白質變性的各種因素均非常敏感，極易受到外界條件的影響而改變其本身的構象和性質。 膠原酶按其存在的方式不同可分為人體內源性膠原酶和葯用膠原酶兩種。人體內源性膠原酶是指人體內部本身所具有的膠原酶，如牙齦、觸膜等上皮組織和關節滑膜、椎間盤內都不同程度的存在著這種膠原酶，它在體內膠原蛋白的分解過程中發揮著不可或缺的作用。葯用膠原酶是指利用生物制葯的高科技手段從溶組織梭狀芽孢桿菌的發酵液中提取、純化並精製而得的白色或類白色無菌凍乾粉針生物制劑。 膠原酶（collagenase）是從溶組織梭狀細胞芽孢桿菌提取制備的，主要水解結締組織中膠原蛋白成分。當擬消化的組織較硬，內含較多結締組織或膠原成分時，用胰蛋白酶解離細胞的效果較差，這時可採用膠原酶解離細胞法。 膠原酶僅對細胞間質有消化作用而對上皮細胞影響不大。因此適於消化分離纖維性組織、上皮及癌組織，可使上皮細胞與膠原成分分離而不受損害。常用劑量為最終濃度200U/ml（約為1mg/mL）或0.03%~0.3%。膠原酶分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝細胞專用膠原酶，要根據所要分離消化的組織類型選擇膠原酶類型。 1、膠原酶Ⅰ用於上皮、肺，脂肪和腎上腺組織細胞的分離。用於消化組織中連接部分使其成為單個細 胞，用於哺乳動細胞的分離。 2、膠原酶Ⅳ包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它能消化多種組織。 3、膠原酶Ⅴ包含至少7種蛋白酶成分，分子量從68-130KD不等。它可用於胰腺小島組織的分離，將結締組織分離成單個細胞。 4、膠原酶Ⅱ適用於肝臟，骨，甲狀腺，心臟和唾液腺組織。 膠原酶的配置 膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配製、消毒滅菌和儲藏。 注意： 因為Ⅰ型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。 鈣、鎂離子和血清成分不會影響膠原酶的消化作用，因而可用BSS（如D-hanks或者PBS）或含血清的培養液配製。 膠原酶的使用 1.將漂洗、修剪干凈的組織剪成1~2mm3左右小塊 2.將組織塊放入離心管（三角燒瓶）中加入30~50倍體積的膠原酶溶液，旋緊蓋子（密封燒瓶）。 3.將燒瓶放入37℃水浴或者37℃孵箱內，每隔3min振搖一次，如能放在37℃的恆溫震盪水浴箱中則更好。 消化時間與組織的類別很有關系，對於某些腫瘤組織或其他較緻密結締組織，消化時間4~48h，對於容易消化的組織可以採用37℃震盪消化15~45min，也可以根據具體情況而定。如組織塊已分散而失去塊的形狀，一經搖動即成細胞團或單個細胞，可以認為已消化充分。上皮組織經膠原酶消化後，由於上皮細胞對此酶有耐受性，可能仍有一些細胞團未完全分散，但成團的上皮細胞比分散的單個上皮細胞更易生長，因此，如無特殊需要可以不必再進一步處理。 4.收集消化液（有時含個別組織塊及沒有充分消化的組織碎屑則需用100目不銹鋼網過濾），離心1000r/min，5min，去除上清，用Hanks液或者無血清培養液離心漂洗1~2次，去除上清，加培養液製成細胞懸液，接種培養瓶。

『貳』 原代肝細胞培養問題

原代肝細胞很容易貼壁生長，4小時肯定能貼壁。

「然後就有渾濁的沉澱，那個沉澱是肝細胞吧？」將此沉澱用培養液或pbs稀釋，加台盤藍染色，顯微鏡下觀察，若為活細胞，通常就是肝細胞了，要培養好，最好有大於85%以上的活性。

原代肝細胞最好生長在鼠尾膠原上，也就是用鼠尾膠原鋪板，然後再普細胞。

4小時後換液，然後每20小時左右換液，通常原代肝細胞難以增值，但是維持20天左右沒問題。

『叄』 幹細胞的研究進展

幹細胞是人體內最原始的細胞，它具有較強的再生能力，在幹細胞因子和多種白細胞介素的聯合作用下可擴增出各類的細胞。在99年末的年度世界十大科技成果評選中，"幹細胞研究的新發現"榮登榜首。幹細胞研究有不可估量的醫學價值。分離、保存並在體外人工大量培養使之成長為各種組織和器官成為幹細胞研究的首要課題。當前，對幹細胞的分離和培養技術獲得了重大進展，利用單克隆免疫吸附能識別細胞類型或細胞譜系的表面抗原，其分離純度和細胞活力都很高。99年以色列魏茨曼科學院將白介素-6與幹細胞內的受體分子合並研製出一種新分子，可使幹細胞在維持原本特性的基礎上進行自我增殖且細胞壽命也有所延長。在臨床運用中，造血幹細胞應用較早，在五十年代，臨床上就開始應用骨髓移植來治療血液系統疾病。到八十年代，外周血幹細胞移植技術逐漸推廣。美國StmlellsCsliifornia公司用血液幹細胞在小鼠體內培育出成熟的肝細胞。胚胎幹細胞目前許多研究工作都是以小鼠胚胎幹細胞為研究對象，神經幹細胞的研究仍處於初級階段。

我國現已掌握了臍血幹細胞分離、純化、冷凍保存以及復甦的一整套技術，並開始在上海籌建我國第一個臍血庫。在北京，北京醫科大學人民醫院細胞治療中心也正在籌建全世界最大的異基因臍帶血幹細胞庫，計劃到2002年完成冷凍5萬份異基因臍帶血幹細胞，為全世界華人患者提供臍帶血幹細胞做移植用。2000年初，我國東北地區首例臍血幹細胞移植成功。

我國在"治療性克隆"研究領域獲得重大突破，"治療性克隆"課題被列為國家級重點基礎研究項目。此課題分為上、中、下游三塊，上海市轉基因研究中心成國祥博士負責上游研究，上海第二醫科大學盛惠珍教授和曹誼林教授分別主持中、下游的研究工作。其整體目標是，用病人的體細胞移植到去核的卵母細胞內，經過一定的處理使其發育到囊胚，再利用囊胚建立胚胎幹細胞，在體外進行誘導分化成特定的組織或器官，如皮膚、軟骨、心臟、肝臟、腎臟、膀胱等，再將這些組織或器官移植到病人身上。利用這種方法，將從根本上解決同種異體器官移植過程中最難的免疫排斥反應，同時還使得組織或器官有了良好的、充分的來源。目前，由上海市轉基因研究中心負責的上游研究工作，即把病人的體細胞移到去核的卵母細胞並經一系列的處理發育至囊胚取得成功。這個中心創建的三種技術路線方法，即"體細胞克隆哺乳動物的制備方法"、"獲得治療性克隆植入前的制備方法"以及"用於治療性克隆的人體細胞組織器官保存方法"均已收到國家知識產權局同意專利申請的受理通知。
為了一個人的形成，單個受精卵將產生數以億計的細胞和250多種不同的細胞類型。幸而，直到最後一個細胞和器官發育形成之時，所有的一切仍未結束。貫穿於整個生命的，是大多數組織繼續產生新的細胞以替換損耗的老細胞或滿足新的生命活動的需要。比如，當運動員在高海拔地區進行訓練的時候，循環系統中血細胞的數量相應增加以滿足運輸更多氧氣的需要。很顯然，在諸如皮膚，毛發，骨骼，骨髓，腸這樣的組織中，細胞再生能力已得到證實；但這種現象很可能在所有器官中都不同程度地存在著，包括大腦在內，而慣常的觀點是，神經元是不可再生的。

組織更新和修補自身的能力來源於稱為幹細胞的小細胞團。幹細胞存在於生命的全過程，在體內微環境中被專門的「看護」細胞緊密包圍。「看護」細胞提供生長因子和信號分子保持幹細胞的特性――分化能力，以及在特定生命周期中分化為特化細胞的同時又能自我復制的能力。矛盾的是，幹細胞的自身分裂十分有限，而它們的子細胞在最終形成特化細胞的過程中，有非凡的繁殖力。

幹細胞以及他們能維持一定數量的能力一直深深吸引著生物學家們[1]，如今更為狂熱。由於人們意外的發現成熟組織中的幹細胞可以重新程序化，即使效率極低，但仍然可以分化為其他來源的細胞。[2]比如，在正常情況下，成年鼠的少數造血幹細胞可生成肌肉組織，神經系幹細胞可生成血液。這些報告使得將來受損組織用同一個體內其他組織的殘余幹細胞來修復成為可能。

懸而未決的問題

另外兩項研究也引起了科學界和公眾的廣泛關注。去年，有兩個研究小組宣布他們從人類胚胎和胎兒的生殖細胞中分離出了多能幹細胞(pluripotential)――可以分化為多種細胞類型的幹細胞。緊跟著，就是眾所周知的來自成熟體細胞的克隆羊多莉(dolly)及克隆鼠的誕生。

這些有著巨大新聞價值的研究層出不窮，引起了世界性的關於道德和倫理規范的討論風暴，而且到現在還在爭論。比如在美國，公眾的反對迫使NIH停止對人胚胎幹細胞的研究提供資助。這些爭論使許多研究人員開始意識到，他們必須就一些基本問題與迫切的公眾和立法者進行有效的交流，其中包括「人的生命何時開始？」「成為人意味著什麼？」「什麼是胚胎，它在什麼時候變成人？」。

科學家們是否能回答這些復雜的問題還有爭執，這里我不打算繼續深入討論。我只想確定這個事實：在回答另一個更重要的基本問題「我們怎樣才可能把幹細胞用於醫葯領域？」之前，我們的確還需要更多的信息。

採取哪種方法？

最基本的，我們必須進一步研究人體所有組織的幹細胞。第一步，我們需要確定分子標記，它們能將寥寥無幾的幹細胞從他們龐大的子細胞中區分開來。此外，還需了解幹細胞與所處的微環境之間的相互作用，以及微環境如何對機體的需求作出反應。我們僅對骨髓中的造血幹細胞的相關信息有一定了解，這將有助於在臨床治療中增加受損組織中殘留的幹細胞的數量。現在，我們已經能夠培養少量造血幹細胞以重建人的血液系統。

設定一個最壞的狀況，一個慢性病患者失去了某種組織的大部分幹細胞，必須要用替代療法才能生存。如今，最可行的方案是採用另一個體相應組織的幹細胞來補充。但是，這種方案也相當危險，由於捐獻者與患者沒有遺傳上的相容性，移植很快因免疫排斥而失敗。

一種改進方案是用所謂「自體同源幹細胞(autologous stem cells)」的幹細胞來進行治療，這種幹細胞與患者的基因型完全相同。雖然目前還不可行，但是我們已經有了一定的設想。一種方案是分離、培養患者的另一組織的幹細胞，比如骨髓或皮膚的，再把這些成熟幹細胞在體外重新程序化。為了了解怎樣才能重新程序化幹細胞，我們需要一系列的實驗，來研究沉默基因的重新激活，以及激活基因被關閉的機制。例如「早期胚胎細胞分化為不同細胞系的機制研究」就會給我們相當的啟示。如果我們理解了遺傳基因控制正常發育的實現過程，我們將更容易地在實驗室里進行有目的地控制基因表達和細胞分化的方向。

另一種方法是用來源於囊胚期的胚胎的多能幹細胞。囊胚期是指卵子剛剛受精但尚未種植到子宮的階段，此時胚胎稱為胚泡。胚泡大約由100個細胞組成，其中包含一些特化性較少的幹細胞，可在培養中不確定地誘導分化為多種細胞形式（如圖）。最早的人類多能幹細胞是從體外受精的臨床病例中得來的多餘胚泡。這個里程碑式的事件是James Thomson領導的University of Wisconsin, Madison的實驗室在1998年的成果。另一個在澳大利亞的Monash University的實驗室最近宣布了相似的實驗結果。現在這兩個小組正在進一步研究這些多能幹細胞和子細胞的特徵。

這些工作為人類胚胎早期發育中基因功能研究提供無價的數據資料。不幸的是直到現在，我們對這一領域知之甚少，部分由於聯邦經費對胚胎研究的限制。盡管胚胎發育在進化中高度保守，但是脊椎動物胚胎發育中一些細節上的差異，足以證明鼠和人之間並不是所有的基因都具有相同功能。因此，在模式動物研究中得來的信息不能充分體現出我們在人類幹細胞中研究中的問題。

公眾眼中的幹細胞

用人類多能幹細胞進行研究引起爭議是由於他們來自人類的受精卵，在某些人認為人的生命始於受精。那麼在理論上，用體細胞核轉移的方法生成自體同源幹細胞引起的爭議會少一些。這種方法是把成熟細胞的細胞核轉入一個去核的未受精卵細胞中，在實驗室里，這個卵細胞發育成胚泡，研究人員可從中分離培養多能幹細胞系。最近，Monash University的研究人員用這項技術在小鼠上取得了成功。他們在1000多個轉移基因標記的細胞核的去核卵細胞中，獲得一個胚胎幹細胞系。如果這種「治療性克隆」能夠在效率上更提高一些，那麼這對人類幹細胞的研究同樣有意義。

既然實驗用的卵細胞是去核和未受精的，無不同個體的遺傳物質融合，從而未發生受精過程，所以用這種方法製造的幹細胞在道德和倫理上將更容易被人們所接受。此外，由於胚胎幹細胞不能獨立發育成胎兒，所以他們不是胚胎。然而，從理論上講，體細胞核轉移產生的胚泡不僅只用於幹細胞的產生，把這樣的胚泡移植到婦女子宮中也有可能克隆人。嘗試此類研究與現行道德准相駁，也是違法行為。另外，這樣的行為會使許多不負責任的人們有所企圖，無法控制倫理道德標准，而且有可能使人為的和有目的地製造畸形嬰兒成為可能。

這些爭議對一些更極端的反對者來說還不是關鍵，他們認為只有對於一個已經去世的人，體細胞核轉移技術才可以接受。往往在聯邦經費資助人類幹細胞的科學研究之前，一個基於相互尊重的信仰的公眾討論就已經開始，無論這種研究是以治療人類疾病為目的還是以基礎研究為目的。

可以認為這種爭論本身，是一個好的事情，因為它激發了公眾對生物學和復制的興趣及關注，這些內容以往在學校里不能有效的傳授給學生。（克隆青蛙往往不能象克隆人類自己那樣使高中的學生們產生興趣，而且人類肢體再生的案例就可以引導學生展開有關人類肢體的形成和哪些基因產生手臂而不產生腿之類的討論，象這樣的說法未免太牽強了一點。）

無論怎樣，幹細胞研究的前提是將會得到新的實質意義上的治療方法。因此，科學家們必須十分謹慎，避免媒體對基因治療過分誇大的報道，否則會失去公眾的信任和信心。在應用人多能幹細胞時，也必須十分留心。就像我們看到的那樣，對公眾中的某些人來說，這些細胞的來源相當於破壞人的生命。事實是在我們確切知道幹細胞治療的實際用途之前，還有許多障礙要跨越。當我們向前繼續探索的每時每刻，我們必須誠實.

http://www.39.net/nursing/03gxb/hgyzw/21352.html

『肆』 求教肝細胞原代培養

肝臟是體內功能最多、最復雜的臟器，是一個物質合成、代謝與代謝 調節的場所，是生理和病理狀態下，能量代謝、毒素的生物轉化以及血漿蛋白質合成的中心器官，是機體最重要的器官之一。肝臟作為機體重要的代謝器官，一直倍 受關注，但由於體內研究受眾多因素的影響，因而肝細胞培養作為一種體外研究手段，越來越多地被應用。由於肝細胞是一種分化程度很高的細胞，一旦失去體內生 存環境，則很快失去分化再生的能力，它的一些生化功能也很快喪失。

『伍』 小鼠肝臟原代細胞肝竇內皮細胞的怎麼培養

小鼠肝臟原代細胞肝竇內皮細胞的怎麼培養
肝臟是人體中最大的實質性器官，主要負責著體內脂類、糖類、蛋白質、和維生素等眾多物質的代謝，是人體中的代謝工廠。此外，肝臟在體內還發揮著解毒、免疫、存儲糖原和維生素、合成膽汁以及造血等功能，被稱之為體內最繁忙的器官。肝臟的復雜功能的發揮依賴於組成肝臟的各種類型的細胞，肝臟細胞主要分成兩類：肝實質細胞（HC）和非實質細胞（NPC）。前者是肝臟中最主要的細胞類型，占據肝臟體積約80%，發揮著肝臟中的絕大部分功能。非實質細胞主要包括肝竇內皮細胞（LSEC）、枯否細胞（KC）、肝星狀細胞（HSC）以及其他一些免疫細胞等。目前，對肝臟細胞的研究往往集中於某一種類型的細胞。本研究同時構建了多種類型細胞的基因表達譜，通過肝臟細胞水平表達譜的全面解析，系統地發現肝臟細胞中表達的新基因或新亞型，深入地了解肝臟不同類型細胞的共性與特性，全新地認識細胞在肝臟器官中的分工與協作。 轉錄組和蛋白質組作為基因組後繼補充研究對象，分別擔當傳遞遺傳信息和功能最終執行的角色。而蛋白質組鑒定覆蓋度的范圍往往是參照編碼基因的數目，因此可尋求轉錄組水平的mRNA鑒定輔助蛋白質組的深度覆蓋。除了覆蓋度的優勢以外，轉錄組水平在靈敏度和准確性方面具有無可比擬的優勢，還可以更精確地鑒定到基因的可變剪接、RNA編輯等信息。目前，轉錄組測序（RNA-Seq）作為一項新一代測序技術，能在全基因組范圍內以單鹼基解析度檢測並定量轉錄片段，成為研究轉錄組表達譜的重要方法。 首先，我們首次構建了肝臟細胞水平的轉錄組表達譜。以C57BL/6小鼠動物為模型，採用流式細胞術完成肝臟3種類型細胞（HC、LSEC和KC）的分選，確保各類細胞純度和活性分別達到95%和85%以上。對細胞提取的RNA，利用新一代測序RNA-Seq技術，每種類型細胞得到3G以上的數據量，滿足深度測序目的。

『陸』 肝癌細胞原代培養

最好是及時分離培養,泡在生理鹽水中四度或冰上短暫保存也可，但最好不要超過4-6小時，時間越長細胞狀態越差，越難養活。希望對你有幫助，祝實驗順利！

『柒』 原代肝細胞中分離死細胞和活細胞

其實很簡單，對於成年大鼠而言，注意下面幾項即可：

1.兩部灌流法的灌流液，ph值，氧氣等因素，以及灌流時間很重要

2.如果血細胞去的非常干凈，可以不用percoll分離

3，用低速離心（50g2min），死細胞在上層。

4.台盼藍檢測後基本95%以上活性。我分離的通常在99%以上活性。成鼠肝細胞元代培養很難增值，但是維持1個月沒問題。

我曾給你回復過一次，你沒反應。這是最後一次。看看我培養的大鼠原代細胞圖片（48小時後），是不是比文獻上發表的都漂亮。

哈哈

祝實驗順利！

『捌』 請教大鼠原代肝細胞的分離和培養的問題

我記得好像有這一方面的的論文，題目都一樣的《大鼠原代肝細胞的分離與培養》是徐麗娜 鞠雷 顧憲銳 張恆 馬玉忠 河北農業大學動物科技學院的
http://www.cqvip.com/qk/96216X/200712/26163977.html
你下載來看就行了（不過下載要錢）

下面我給你，我做的一個過程（僅做參考）
我做的就是大鼠原代肝細胞，養了一段時間了，下面是我的實驗步驟，希望對你有所幫助。
1）3-5天乳鼠，斷頭處死，75%酒精浸泡3-5分鍾。
2）移入超凈台內，無菌取下肝臟，放入冷PBS內，撕下被膜等。
3）移入25ml燒杯內，剪成1mm3左右大小，PBS清洗至上清無色。
4）移入三角瓶內，加5倍量0.05%胰酶37度消化20分鍾。
5）終止消化，靜置，棄上清。加0.05%膠原酶消化20分鍾。
6）100目過濾。離心，800，3分鍾。
7）計數，調整濃度，接種。24小時第一次換液，以後沒兩天換一次液，4、5天可以鋪滿。

二、方法

1．傳統門靜脈灌流消化法（傳統門脈灌流法）：參照鄒氏等文獻方法[3,4,5]。

2．低濃度膠原酶原位循環灌流法：

2.1取Wistar大鼠，用2%戊巴比妥鈉10mg/100g體重、肝素20 u/100g體重分別腹腔注射以麻醉和抗凝。

2.2 10-15分鍾後固定大鼠，75%酒精消毒，紫外燈照射15-30分鍾。腹部再次75%酒精消毒後正中切開打開腹腔並更換器械。

2.3顯露肝門部門靜脈並游離2-3cm；顯露游離肝下下腔靜脈2-3cm，各置一結扎線，暫不結扎。

2.4穿刺針插入門靜脈後立即結扎固定，盡快接通硅膠管並啟動蠕動泵（無泵時，輸液器亦可），同時剪斷肝下下腔靜脈遠端。

2.5用D-Hanks液20-30ml/min快速灌注清除肝內血液，1分鍾內即可見肝臟顏色變淺，持續灌注10分鍾至肝臟呈米黃色。同時切開胸腔結扎肝上下腔靜脈。

2.6插另一硅膠管入肝下下腔靜脈並結扎固定，換D-Hanks液為膠原酶消化液(370C預熱)循環灌注消化，灌流速度為10-20ml/min，持續時間10-20分鍾至肝質變軟，壓之凹陷不易恢復。

2.7停止灌注，小心剪取各肝葉置入消毒平皿內，加入適量肝細胞洗滌液（4oC預冷），撕碎肝臟並祛除纖維結締組織，製成混合肝臟細胞懸液。

2.8 100目篩網過濾入50ml離心管，500rpm離心1-2分鍾。去上清，沉澱加入RPMI 1640 （4oC預冷）20-30ml洗滌3次。

2.9肝細胞沉澱加入肝細胞培養液重懸為10ml，取適量計數並用0.4%台盼藍染色判斷存活率。後即可按實驗設計接種培養

我們目前正在做大鼠肝臟細胞的分離培養（原位循環灌注法），我把大體步驟和大家交流一下。
1，動物稱重，戊巴比妥麻醉。
2，固定，消毒，腹部正中十字切口，或者「U」型切口進腹。
3，分離門靜脈和肝下下腔靜脈，分別插管，從門靜脈注入肝素，使大鼠全身肝素化。
4，阻斷肝上下腔靜脈（位置較深，分離結扎有難度，可用哈巴狗血管夾夾住，亦可用消毒棉簽壓迫）
5，從門靜脈內注入D-HANKS，直至肝下下腔靜脈插管內流出來的液體中不含或含少量紅細胞，肝臟呈米黃色。
6，此時接上自製的膠原酶循環灌注裝置（循環通路：門--肝--肝下下腔--蠕動泵--門），灌注15分鍾左右，到肝臟表面呈顆粒狀為止。
7，取下肝臟，剪碎，去結締組織，放入含有膠原酶的三角瓶中繼續水浴消化10分鍾後加入HANKS 或者1640終止消化。
8，將3角瓶帶入超凈台內，在超凈台內完成以下步驟。
9，50目篩網，200目篩網，1640兩次吹打過濾。獲得細胞懸液。
10，1640洗滌離心3次，收集細胞，製成一定濃度的懸液。
11，計數，調整濃度，培養。

（大體步驟，太多細節不贅述，我們曾用此方法分離乳豬，大鼠的肝細胞，結果令人滿意）

注意點：
1，腹部切口位置要合適，避免誤入胸腔導致大鼠死亡。
2，插管要固定，避免滑脫。
3，阻斷肝上下腔可以用小哈巴狗，但我們實際發現用下毒棉簽壓迫更為簡單，效果也令人滿意。
4，所有灌流液均要預熱。
5，肝臟消化完畢後，立即拿到超凈台內操作，注意無菌觀念。
6，消化時間8宜過長。
7，組織塊比較大，通過50目篩網有困難時，可用消毒注射器活塞輕輕擠壓組織塊，勿研磨！

優點：
1，消化充分，且節約膠原酶。膠原酶比較昂貴 ：）
2，在肝臟離體之前大鼠保持呼吸心跳，從而最大限度的保持了細胞的活力。
缺點：
需要一定的手術技巧，了解肝臟循環結構，且血管插管有一定難度。

『玖』 乳鼠肝臟細胞原代培養如何進行求具體的方法步驟

博凌科為生物科技-為你解答：一周齡大鼠，斷頸處死，活力碘消毒,無菌取出肝臟，於無菌維持液中漂洗，用眼科剪仔細清除肝包膜,韌帶,沿肝邊緣剪切肝尖組織(繞開肝蒂等)轉入青 黴素小瓶中，用眼科剪絞碎,剪成0.1-1.0mm3大小的碎片，加入5倍體積無菌維持液,用滴管輕輕吹打,吸出上層血細胞再用無菌維持液反復清洗3~5次，加入10倍體積無菌胰蛋白酶消化液,37℃消化，消化過程中不斷震盪，至組織塊邊緣變薄(鏡下觀),離心 (1000rpm,10分鍾)棄去上面酶液，用無菌維持液將組織塊清洗2~3次，加入新鮮無菌胰蛋白酶消化液重復上述步驟。此時組織塊邊緣模糊，1000rpm離心10分鍾，取沉澱即為消化下的細胞，重新用無菌維持液懸浮，離心，洗1~2次，用20%生長液懸浮即得細胞 懸液；將消化過的組織塊重復消化5~6次至組織塊消化完全，重復以上操作，合並幾次所得細胞懸液，計數，調整細胞濃度為210 5 個 細胞/mL，將細胞懸液接種於塑料培養瓶中，置於37℃，5%CO2，飽和濕度培養箱中培養。培養48小時後，換新鮮配置的培養液培養5小時，可除去絕大部分血細胞及雜細胞，37℃，5%CO2，飽和濕度培養箱中培養，每隔3天換培養液，獲 得單層肝細胞。

『拾』 原代培養在生命科學研究中有什麼應用其優勢是什麼

原代培養（primary culture）又名初代培養，是從供體取得組織細胞後的首次培養。其特點是細胞或組織剛離開機體，生物性狀尚未發生很大的改變，一定程度上反映了它們在體內的狀態，表現出原組織或細胞的特性。對於葯物實驗研究，原代培養是一種很好的實驗技術。由於原代培養的組織含有多種細胞成分，即使生長出同一種類型的細胞，細胞間也存在很大差異。如果供體不同，即使組織的類型、部位相同，個體差別也可以在細胞上反映出來。因此原代培養細胞的部分生物學特徵尚不夠穩定，在進行較為嚴格的對比性實驗研究時，還需先對細胞進行短期傳代。近年來，原代培養技術已被廣泛應用於中醫葯研究尤其是中葯研究之中。1 原代培養技術1.1 組織塊培養法 組織塊培養法即將組織剪切成小塊後接種於培養瓶，簡便易行且成功率較高。但由於反復剪切和接種過程對組織塊易造成損傷，因此並不是每個小塊都能長出細胞。此法適於細胞數量較少的原代培養，如牙髓細胞培養等。1.2 消化培養法 用酶制劑（最常用的是胰蛋白酶）處理組織塊，除去細胞間質，使細胞相互分離形成單細胞懸液，大多形成單層細胞生長方式。本法的優點在於單層細胞更易攝取營養及排出代謝產物，因此生長較快。但操作不慎易於造成污染，且消化處理須恰到好處，否則會對細胞產生一定的損傷。隨著實驗技術水平的提高，目前此方法已被較多地應用於研究之中［1］。2 原代培養技術在中醫葯研究中的應用 綜合近十年來的文獻報道，體細胞、血細胞和腫瘤細胞的原代培養技術較為成熟，已被應用於中醫葯的研究之中，尤其是肝細胞和神經細胞的原代培養，其應用更為廣泛。2.1 用於中葯葯理學研究 中葯葯理學研究是目前應用原代培養技術最廣泛的領域，被稱為中葯的生物學效應研究，用以了解中葯的細胞葯理與毒理作用。與體內整體實驗相比，體外實驗具有簡便迅速、條件易控制、葯理靶點與環節較為清楚等優點。2.1.1 用於葯效學研究 利用原代培養技術研究中葯有效成分和復方的作用效果和機制，是從分子水平研究葯效的重要手段。 朱陵群等［2］研究發現：原代培養的大鼠海馬神經細胞缺氧、缺糖5 h後再給氧，可誘導神經細胞凋亡和細胞壞死，並顯著增加細胞內Ca2＋濃度和乳酸脫氫酶的釋放，且隨再給氧時間的延長而增加；三七總皂苷能降低神經細胞凋亡及壞死的百分率，降低細胞內Ca2＋濃度，減少乳酸脫氫酶的釋放，且其作用隨劑量增加而增強。Shih等［3］發現，川芎提取物川芎嗪可以保護原代培養的大鼠海馬神經元線粒體，減少自由基的產生並幫助清除自由基，從而對紅藻氨酸所致的細胞損傷起到保護作用。劉曉玲等［4］原代培養大鼠滑膜細胞，發現青藤鹼可以通過抑制滑膜細胞惡性增殖及白細胞介素6 mRNA基因的表達來阻斷滑膜炎的進程。林愛華等［5］報道，粉防己鹼可以明顯抑制氣道平滑肌細胞的增殖活性。粉防己鹼對組胺激發的［Ca2＋］ i升高表現出明顯的抑制效應，推測粉防己鹼抑制培養的氣道平滑肌細胞增殖活性的作用可能是通過阻斷細胞膜Ca2+通道而降低［Ca2＋］ i實現的。Bickmeyer等［6］研究報道，粉防己鹼可以阻滯原代培養的牛嗜鉻細胞電壓依賴式鈣離子通道，促進兒茶酚胺釋放，增加細胞內鈣離子的水平。崔雲華等［7］原代培養大鼠肝星狀細胞，發現丹參酸乙可降低活化的以及經丙二醛刺激後的肝星狀細胞內的氧化程度、抑制增殖細胞核抗原的表達量，在抗氧化和抗增殖作用之間可能存在一定的聯系。Li等［8］原代培養中腦神經元及神經膠質細胞，發現雷公藤提取物雷公藤內酯可以對抗脂多糖所致的多巴胺吸收減少和細胞中酪氨酸羥化酶免疫活性的丟失、抑制小神經膠質細胞的活動和腫瘤壞死因子α及一氧化氮的過度生成。雷公藤內酯還可保護脂多糖所致的多巴胺能神經元的損傷，其機制可能是抑制小神經膠質細胞的活動。Kamei等［9］採用原代培養技術培養大鼠脂肪細胞和心肌細胞，首次證實中葯提取物紫草素在體外實驗中具有胰島素樣作用。Hsu等［10］採用原代培養技術培養嗜中性粒細胞，發現靈芝多糖可促進嗜中性粒細胞的移動，增強蛋白激酶C、絲裂酶原激活蛋白激酶和酪氨酸激酶的活性，從而增強嗜中性粒細胞的趨化性和吞噬作用。Wang等［11］報道，從白術中提取的有效成分蒼術酮對原代培養的人白血病單核細胞有一定的細胞毒性。 萬文成等［12］發現清開靈能減少谷氨酸所致的原代培養大鼠大腦皮層神經細胞內乳酸脫氫酶的漏出量、減輕細胞的形態學改變，表明清開靈能夠對抗谷氨酸介導的興奮性毒性，對培養的大鼠皮層腦細胞具有保護作用。李彧等［13］原代培養大鼠系膜細胞，經脂多糖刺激10 h後，核轉錄因子-κB的活性達到最高峰，且最高熒光強度位於細胞核內；大劑量溫脾湯葯物血清可明顯抑制核轉錄因子-κB的活性；大劑量葯物血清能明顯抑制核轉錄因子-κB抑制劑IκB的降解。李彤等［14］採用血清葯理學方法及原代培養心肌細胞技術，發現在通脈湯含葯血清干預下，缺氧心肌細胞游離鈣離子的濃度明顯下降，同時細胞膜L型鈣離子通道的表達在缺氧條件下亦明顯下降，表明通脈湯可以減輕缺氧心肌細胞鈣的超負荷。尤紅等［15］的實驗結果顯示，一定濃度的復方861（由丹參、黃芪等十味中葯組成）可以促進體外分離培養的大鼠肝細胞DNA的合成，對肝細胞的凋亡則無明顯影響。張斌等［16］觀察抗纖復方對大鼠纖維化肝原代培養貯脂細胞自分泌的影響，結果表明抗纖復方葯物血清能明顯抑制貯脂細胞產生轉化生長因子β1，阻斷肝纖維化時貯脂細胞的自分泌。Imanishi等［17］採用原代培養技術培養肝星狀細胞，並用硫代乙醯胺造成肝纖維化模型。結果表明，茵陳蒿湯主要是通過抑制血小板源生長因子b受體的磷酸化及下行信號傳導通路來抑制DNA的合成與轉錄，可能是茵陳蒿湯治療肝纖維化的機制。Zhang等［18］原代培養胎鼠皮層神經細胞，用谷氨酸鹽造成細胞損傷，使細胞中膽鹼酯酶和鏈親合素標記的過氧化物酶活性降低、乳酸脫氫酶釋放增加。加入清腦益智方葯物血清後，上述酶的活性可恢復至正常水平，一氧化氮的生成及細胞凋亡亦受到抑制。2.1.2 用於方劑配伍機制的研究 劉成海等［19］將扶正化瘀319方進行拆方，各自製備葯物血清並作用於原代培養肝細胞。結果顯示，各葯物血清對細胞形態無明顯影響，對肝細胞白蛋白分泌及其前白蛋白原mRNA表達則有不同程度的促進作用，其中尤以扶正化瘀319方全方的作用最為顯著。2.2 用於針灸學研究 梁希彬等［20］觀察電針後大鼠中腦腹側部粗提液對體外培養多巴胺能神經元表達數目、神經元胞體直徑及神經突起長度的影響。實驗證實，電針後大鼠中腦腹側部粗提液能夠促進多巴胺能神經元胞體的發育和突起的生長，但對多巴胺能神經元表達數目則無明顯影響。2.3 用於中醫證候本質的研究 陳雲波等［21］採用血瘀證兔模型血管內皮細胞直接培養以及血瘀證兔模型血清培養血管內皮細胞兩種方法，建立血瘀證細胞損傷模型。原代培養的血管內皮細胞出現了病理性損傷及內分泌功能的改變。此外，模型組原代細胞培養液中一氧化氮的含量比對照組明顯減少，而內皮素含量則有上升趨勢。證明實驗建立的細胞損傷模型從功能和結構上能反映血瘀證整體動物模型及部分臨床病人的病理特徵，可用於血瘀證實質和活血化瘀作用機制的研究。3 原代培養技術應用於中醫葯研究存在的問題及前景3.1 加強相關的基礎研究 原代培養經首次傳代成功即成細胞系，通過選擇法或克隆形成法從原代培養物或細胞系中獲得的具有特殊性質或標志的培養物稱為細胞株。各種已被命名和經過細胞生物學鑒定的細胞系或細胞株，都是一些形態比較均一、生長增殖比較穩定、生物性狀較為明確的細胞群。細胞系分裂繁殖過程中形成單層有利於培養，細胞亦可凍存，以備以後的培養。一般來說，細胞系優於原代培養。細胞系在中醫葯研究中已被廣泛應用，如各種腫瘤細胞、肝星狀細胞系、巨嗜細胞系、經乙肝病毒基因轉染的肝細胞等，主要用於中葯的葯效學研究。但畢竟還有許多細胞尚無法獲得細胞系（株），尤其在現階段的中國，穩定的細胞系、細胞株不易獲得，原代培養細胞至少提供了體外細胞水平實驗的工具。因此，須加強細胞培養的基礎研究，將更多的細胞系（株）應用於中醫葯研究領域，使中醫葯研究在細胞水平上有所提高。 目前，國內外已有許多取材於人的細胞培養研究，其細胞多取材於器官捐獻者。國內在此方面的研究工作開展較少，在中醫葯領域中的研究才剛剛開始。由於存在倫理學等方面因素的制約，其應用范圍仍然較窄，目前主要用於一些比較容易獲得的細胞，如子宮內膜細胞、人牙髓細胞、角質細胞（來源於手術切除的包皮）、血細胞及血管內皮細胞（來源於臍帶）等，還有一些來源於手術切除的細胞，如腫瘤細胞及腹主動脈瘤血管平滑肌細胞等。 細胞培養技術研究中葯時的一個關鍵技術是中葯的給葯方法，關於這方面的基礎研究正日益受到重視。目前在中葯葯效學研究中主要存在兩種給葯方式：（1）直接添加法。將中葯復方以水煎醇提等方法進行粗提，直接添加於培養體系，或將粗提物冷凍乾燥，再用培養液稀釋後添加於培養體系。該方法簡便，但易受制劑的雜質、pH值、滲透壓、電解質等因素影響。國內外相關研究中已有使用中葯有效成分進行直接添加的實驗報道。（2）間接添加法（血清葯理學方法）。給予動物復方灌胃給葯，收集服葯後的動物血清，將含葯血清添加於培養細胞。該法避免了體外用葯的一些干擾因素，但起步較晚，尚有待進一步完善。3.2 用於中醫理論的研究 細胞培養技術在中醫葯研究中主要用於中葯尤其是葯效學的研究，並已取得不少成果。迄今為止，研究目的多限於驗證臨床有效復方或探索其可能的作用機制，但這顯然是不夠的。應充分發揮體外實驗的優勢，深入研究中葯復方在組方、劑量、辨證論治上的奧妙，進而推陳出新，給臨床以啟示或指導［22］，這對於開發中葯、推進中醫葯走向世界有重要意義。 此外，運用細胞培養技術闡明中醫理論的實質亦是值得探索的領域。如吳正正等［23］提出中醫「證」（虛證和部分實證）的本質是細胞內基因誘生性表達的細胞因子。中醫「證」發生的分子機制是由於細胞因子網路自穩態平衡破壞的結果。陰虛證的本質可能是由於白細胞介素1和腫瘤壞死因子基因表達增強、生物學活性相對升高，引起細胞因子網路自穩態平衡失調的結果。現已有一些研究證候實質的實驗，如血瘀證血管內皮細胞病理模型的建立及其相關研究。鄭愛華等［24］探討了肝鬱證、脾虛證模型動物干擾素γ及白細胞介素4 mRNA表達的變化。由於傳統中醫理論比較重視整體而忽視微觀的原因，因而從細胞、分子水平來研究中醫基礎理論的工作目前還相對較少，利用細胞培養技術深入進行這方面的研究，可以促進中醫基礎理論研究的進一步發展。