培養基的研究方法

① 微生物培養方法有哪些

常用的微生物實驗室接種方法有以下幾種：

1、液體接種：從固體培養基中將菌洗下，倒入液體培養基中，或者從液體培養物中，用移液管將菌液接至液體培養基中，或從液體培養物中將菌液移至固體培養基中，都可稱為液體接種。

2、穿刺接種：在保藏厭氧菌種或研究微生物的動力時常採用此法。做穿刺接種時，用的接種工具是接種針。用的培養基一般是半固體培養基。它的做法是：用接種針蘸取少量的菌種，沿半固體培養基中心向管底作直線穿刺，如某細菌具有鞭毛而能運動，則在穿刺線周圍能夠生長。

3、活體接種：活體接種是專門用於培養病毒或其它病原微生物的一種方法，因為病毒必須接種於活的生物體內才能生長繁殖。所用的活體可以是整個動物；也可以是某個離體活組織，例如猴腎等；也可以是發育的雞胚。接種的方式是注射，也可以是拌料喂養。

4、澆混接種：該法是將待接的微生物先放入培養皿中，然後再倒入冷卻至45°C左右的固體培養基，迅速輕輕搖勻，這樣菌液就達到稀釋的目的。待平板凝固之後，置合適溫度下培養，就可長出單個的微生物菌落。

5、劃線接種：即在固體培養基表面作來回直線形的移動，就可達到接種的作用。常用的接種工具有接種環，接種針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。

6、塗布接種：與澆混接種略有不同，就是先倒好平板，讓其凝固，然後再將菌液倒入平板上面，迅速用塗布棒在表面作來回左右的塗布，讓菌液均勻分布，就可長出單個的微生物的菌落。

7、三點接種：在研究黴菌形態時常用此法。此法即把少量的微生物接種在平板表面上，成等邊三角形的三點，讓它各自獨立形成菌落後，來觀察、研究它們的形態。除三點外，也有一點或多點進行接種的。

8、注射接種：該法是用注射的方法將待接的微生物轉接至活的生物體內，如人或其它動物中，常見的疫苗預防接種，就是用注射接種，接入人體，來預防某些疾病。

② 配製培養基的原則和方法是什麼

培養基有很多種，你要配製哪一種呢？

你要查清楚，你要配的培養基的成分有那些，然後把要用的東西找到。在配製之前你要把裝培養基的容器准備好，是用試管、平皿還是三角瓶。之後看要配的是固體培養基還是液體培養基，覺得是否放瓊脂或明膠。之後找來一個大燒杯，依次把要放的物質放入，要是配的是固體培養基要把加入瓊脂或明膠的培養基放在電爐上加熱，待瓊脂或明膠完全溶解後趁熱迅速分裝。之後把分裝好的培養基封口，之後選擇是干滅還是濕滅，等滅菌之後，配製培養基的工作就完成了。

培養基的配製與滅菌

1目的
1.1了解並掌握培養基的配製、分裝方法
1.2掌握各種實驗室滅菌方法及技術。
2原理
培養基是供微生物生長、繁殖、代謝的混合養料。由於微生物具有不同的營養類型，對營養物質的要求也各不相同，加之實驗和研究的目的不同，所以培養基的種類很多，使用的原料也各有差異，但從營養角度分析，培養基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、無機鹽、生長素以及水分等。另外，培養基還應具有適宜的pH值、一定的緩沖能力、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓。
瓊脂是從石花菜等海藻中提取的膠體物質，是應用最廣的凝固劑。加瓊脂製成的培養基在98～100℃下融化，於45℃以下凝固。但多次反復融化，其凝固性降低。
任何一種培養基一經製成就應及時徹底滅菌，以備純培養用。一般培養基的滅菌採用高壓蒸汽滅菌。
3材料
3.1器皿及材料
天平、稱量紙、牛角匙、精密pH試紙、量筒、刻度搪瓷杯、試管、三角瓶、漏斗、分裝架、移液管及移液管筒、培養皿及培養皿盒、玻璃棒、燒杯、試管架、鐵絲筐、剪刀、酒精燈、棉花、線繩、牛皮紙或報紙、紗布、乳膠管、電爐、滅菌鍋、乾燥箱。
3.2葯品試劑
蛋白腖、牛肉膏、NaCl、K2HPO4、瓊脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4、蔗糖、麥芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、土豆汁、豆芽計、磷酸銨、5%NaOH溶液、5%HCl溶液。
4流程
稱葯品→溶解→調pH值→融化瓊脂→過濾分裝→包紮標記→滅菌→擺斜面或倒平板。
5步驟
5.1培養基的制備
5.1.1稱量葯品
根據培養基配方依次准確稱取各種葯品，放入適當大小的燒杯中，瓊脂不要加入。蛋白腖極易吸潮，故稱量時要迅速。
5.1.2溶解
用量筒取一定量(約占總量的1/2)蒸餾水倒入燒杯中，在放有石棉網的電爐上小火加熱，並用玻棒攪拌，以防液體溢出。待各種葯品完全溶解後，停止加熱，補足水分。如果配方中有澱粉，則先將澱粉用少量冷水調成糊狀，並在火上加熱攪拌，然後加足水分及其它原料，待完全溶化後，補足水分。
5.1.3調節pH
根據培養基對pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液調至所需pH。測定pH可用pH試紙或酸度計等。
5.1.4溶化瓊脂
固體或半固體培養基須加入一定量瓊脂。瓊脂加入後，置電爐上一面攪拌一面加熱，直至瓊脂完全融化後才能停止攪拌，並補足水分(水需預熱)。注意控制火力不要使培養基溢出或燒焦。
5.1.5過濾分裝
先將過濾裝置安裝好（圖3-1）。如果是液體培養基，玻璃漏斗中放一層濾紙，如果是固體或半固體培養基，則需在漏斗中放多層紗布，或兩層紗布夾一層薄薄的脫脂棉趁熱進行過濾。過濾後立即進行分裝。分裝時注意不要使培養基沾染在管口或瓶口，以免浸濕棉塞， 引起污染。液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。固體分裝裝量為管高的1/5，半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜；分裝三角瓶，其裝量以不超過三角瓶容積的一半為宜。
5.1.6包紮標記
培養基分裝後加好棉塞或試管帽，再包上一層防潮紙，用棉繩系好。在包裝紙上標明培養基名稱，制備組別和姓名、日期等。
5.1.7滅菌
上述培養基應按培養基配方中規定的條件及時進行滅菌。普通培養基為121℃20min，以保證滅菌效果和不損傷培養基的有效成份。培養基經滅菌後，如需要作斜面固體培養基，則滅菌後立即擺放成斜面(圖3-2)，斜面長度一般以不超過試管長度的1/2為宜；半固體培養基滅菌後，垂直冷凝成半固體深層瓊脂。
5.1.8倒平板
將需倒平板的培養基，於水浴鍋中冷卻到45～50℃,立刻倒平板。
5.2滅菌方法
滅菌是指殺死或消滅一定環境中的所有微生物，滅菌的方法分物理和化學滅菌法兩大類。本實驗主要介紹物理方法的一種，即加熱滅菌。
加熱滅菌包括濕熱和乾熱滅菌兩種。通過加熱使菌體內蛋白質凝固變性，從而達到殺菌目的。蛋白質的凝固變性與其自身含水量有關，含水量越高，其凝固所需要的溫度越低。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比乾熱大，因為在濕熱情況下，菌體吸收水分，使蛋白質易於凝固；同時濕熱的穿透力強，可增加滅菌效力。
5.2.1.高壓蒸汽滅菌法
高壓蒸汽滅菌用途廣，效率高，是微生物學實驗中最常用的滅菌方法。這種滅菌方法是基於水的沸點隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理設計的。當蒸汽壓力達到1.05kg/cm2時，水蒸氣的溫度升高到121℃，經15～30min，可全部殺死鍋內物品上的各種微生物和它們的孢子或芽孢。一般培養基、玻璃器皿以及傳染性標本和工作服等都可應用此法滅菌（圖3-4）。
5.2.1.1操作方法和注意事項如下
加水
打開滅菌鍋蓋，向鍋內加水到水位線。立式消毒鍋最好用已煮開過的水，以便減少水垢在鍋內的積存。注意水要加夠，防止滅菌過程中干鍋。
裝料、加蓋
滅菌材料放好後，關閉滅菌器蓋，採用對角式均勻擰緊鍋蓋上的螺旋，使蒸汽鍋密閉，勿使漏氣。
排氣

打開排氣口(也叫放氣閥)。用電爐加熱，待水煮沸後，水蒸氣和空氣一起從排氣孔排出，當有大量蒸汽排出時，維持5min，使鍋內冷空氣完全排凈。
升壓、保壓和降壓
當鍋內冷空氣排凈時，即可關閉排氣閥，壓力開始上升。當壓力上升至所需壓力時，控制電壓以維持恆溫，並開始計算滅菌時間，待時間達到要求（一般培養基和器皿滅菌控制在121℃，20min）後，停止加熱，待壓力降至接近「0」時，打開放氣閥。注意不能過早過急地排氣，否則會由於瓶內壓力下降的速度比鍋內慢而造成瓶內液體沖出容器之外。
滅菌後的培養基空白培養
滅菌後的培養基放於37℃培養箱中培養，經24h培養無菌生長，可保存備用；斜面培養基取出後，立即擺成斜面後空白培養；半固體的培養基垂直放置凝成半固體深層瓊脂後，空白培養。
5.2.2乾熱滅菌法
通過使用乾熱空氣殺滅微生物的方法叫乾熱滅菌。一般是把待滅菌的物品包裝就緒後，放入電烘箱中烘烤，即加熱至160～170℃維持1～2h。
乾熱滅菌法常用於空玻璃器皿、金屬器具的滅菌。凡帶有膠皮的物品，液體及固體培養基等都不能用此法滅菌。
5.2.2.1滅菌前的准備
玻璃器皿等在滅菌前必須經正確包裹和加塞，以保證玻璃器皿於滅菌後不被外界雜菌所污染。常用玻璃器皿的包紮和加塞方法如下：平皿用紙包紮或裝在金屬平皿筒內；三角瓶在棉塞與瓶口外再包以厚紙，用棉繩以活結扎緊，以防滅菌後瓶口被外部雜菌所污染；吸管以拉直的曲別針一端放在棉花的中心，輕輕捅入管口，松緊必須適中，管口外露的棉花纖維統一通過火焰燒去，滅菌時將吸管裝入金屬管筒內進行滅菌，也可用紙條斜著從吸管尖端包起，逐步向上卷，頭端的紙卷捏扁並擰幾下，再將包好的吸管集中滅菌。
5.2.2.2乾燥箱滅菌
將包紮好的物品放入乾燥烘箱內，注意不要擺放太密，以免妨礙空氣流通；不得使器皿與烘箱的內層底板直接接觸。將烘箱的溫度升至160～170℃並恆溫1～2h，注意勿使溫度過高，超過170℃，器皿外包裹的紙張、棉花會被烤焦燃燒。如果是為了烤乾玻璃器皿，溫度為120℃持續30分鍾即可。溫度降至60～70℃時方可打開箱門，取出物品，否則玻璃器皿會因驟冷而爆裂。
用此法滅菌時，絕不能用油、蠟紙包紮物品。
5.2.2.3火焰滅菌
直接用火焰灼燒滅菌，迅速徹底。對於接種環，接種針或其它金屬用具，可直接在酒精燈火焰上燒至紅熱進行滅菌。此外，在接種過程中，試管或三角瓶口，也採用通過火焰而達到滅菌的目的。
6結果
6.1記錄各種不同物品所用的滅菌方法及滅菌條件（溫度、壓力等）。
6.2試述高壓蒸汽滅菌的過程及注意事項。
7思考
7.1制備培養基的一般程序是什麼？
7.2做過本次實驗後，你認為在制備培養基時要注意些什麼問題？
7.3滅菌在微生物學實驗操作中有何重要意義？
4試述高壓蒸汽滅菌的操作方法和原理。
5高壓蒸汽滅菌時應注意哪些事項？

③ 培養基的配製

培養基的配製：

1、稱量和熬煮

按培養基配方逐一稱取去皮土豆。土豆切成小塊放入鍋中，加水1000ml，在加熱器上加熱至沸騰，維持20-30min，用可用2層紗布趁熱在量杯上過濾，濾渣棄取。

2、加熱溶解

把濾液放入鍋中，加入葡萄糖20g，瓊脂15～20g(提前搞碎)，然後放在石棉網上，小火加熱，並用玻棒不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，待瓊脂完全溶解後，再補充水分至所需量。

3、分裝

按實訓要求，將配製的培養基分裝入試管或500ml三角瓶內。分裝時可用三角漏斗以免使培養基沾在管口或瓶口上造成污染。

4、加棉塞

培養基分裝完畢後，在試管口或三角燒瓶口上塞上棉塞(或泡沫塑料塞或試管帽等)，以阻止外界微生物進入培養基內造成污染，並保證有良好的通氣性能。

5、包紮

加塞後，將全部試管用麻繩或橡皮筋捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道線繩或橡皮筋紮好，用記號筆註明培養基名稱、組別、配製日期。

培養基配製注意事項：

1、培養基經滅菌後，必須放在37C溫箱培養24h，無菌生長者方可使用。

2、PDA培養基一般不需要調pH。對於要調節pH的培養基，一般用pH試紙測定其pH。如果培養基偏酸或偏鹼時，可用lmol/LNaOH或lmol/LHCL溶液進行調節。

3、調節時應逐滴加入NaOH或HCl溶液，防止局部過酸或過鹼破壞培養基成分。

4、培養基在使用時也可以做成不含瓊脂的液體培養基，用於菌類的震盪培養。

5、培養基也可以加入氯黴素或土黴素，加入量為0.2g/L培養基，主要是為了抑制細菌的生長，減少干擾性。

(3)培養基的研究方法擴展閱讀

培養基，是指供給微生物、植物或動物（或組織）生長繁殖的，由不同營養物質組合配製而成的營養基質。

一般都含有碳水化合物、含氮物質、無機鹽（包括微量元素）、維生素和水等幾大類物質。培養基既是提供細胞營養和促使細胞增殖的基礎物質，也是細胞生長和繁殖的生存環境。

培養基種類很多，根據配製原料的來源可分為自然培養基、合成培養基、半合成培養基。

根據物理狀態可分為固體培養基、液體培養基、半固體培養基；根據培養功能可分為基礎培養基、選擇培養基、加富培養基、鑒別培養基等。

根據使用范圍可分為細菌培養基、放線菌培養基、酵母菌培養基、真菌培養基等。培養基配成後一般需測試並調節pH，還須進行滅菌，通常有高溫滅菌和過濾滅菌。

培養基由於富含營養物質，易被污染或變質。配好後不宜久置，最好現配現用。

④ 設計培養基

為了使食用菌能正常生長發育，培養基除了必須有足夠的碳、氮營養外，還應注意碳與氮的比例（碳氮比，C/N）。這樣既能保證營養生長階段對營養的需要，也能保證生殖生長的順利進行。例如，巴西蘑菇培養料適宜的碳氮比（C/N）為28～30∶1，含氮量1.4%～1.6%，投料量30～35千克/米2。我們可以按照培養料主要物料的碳氮比（詳見附錄4）設計配方。

⑤ 固體培養基的制備及細菌的培養注意事項

根據不同種類微生物的要求,應將培養基調節到一定的pH范圍,如,細菌培養基中性偏鹼、放線菌培養基偏鹼、黴菌、酵母菌培養基偏酸。 根據研究的不同,可以將培養基製成不同的，過濾除菌要注意各部件滅菌,壓濾時,壓力要適當,不可太大

⑥ 細菌分離培養的基本要領和常用方法有哪些

一、基本要領

菌種分離主要在培養皿上進行，常用的方法是稀釋法和劃線法。

菌種分離的目的是是微生物的一個個體通過繁殖，在固體培養基上長出肉眼能見的群體，然後根據培養特徵，用接種針調取所需菌種並在顯微鏡下檢查，證明為單一形狀的菌體。

改變培養基條件也有助於菌種分離。沒有一種培養基或一種培養條件能夠滿足一切微生物生長的需要，在一定程度上所有的培養基都是選擇性的。

如果某種微生物的生長需要是已知的，也可以設計特定環境使之適合這種微生物的生長，因而能夠從混雜的微生物群體中把這種微生物選擇培養出來，盡管在混雜的微生物群體中這種微生物可能只佔少數。

二、方法

1、稀釋倒平板法

首先把微生物懸液作一系列的稀釋（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然後分別取不同稀釋液少許，與已熔化並冷卻至50℃左右的瓊脂培養基混合，搖勻後，傾入滅過菌的培養皿中，待瓊脂凝固後，製成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養一定時間即可出現菌落。

如果稀釋得當，在平板表面或瓊脂培養基中就可出現分散的單個菌落，這個菌落可能就是由一個細菌細胞繁殖形成的。隨後挑取該單個菌落，或重復以上操作數次，便可得到純培養。

2、塗布平板法

因為將微生物懸液先加到較燙的培養基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡，且採用稀釋倒平板法也會使一些嚴格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響其生長，因此在微生物學研究中常用的純種分離方法是塗布平板法。

其做法是先將已熔化的培養基倒入無菌平皿，製成無菌平板，冷卻凝固後，將一定量的微生物懸液滴加在平板表面，再用無菌玻璃塗棒將菌液均勻分散至整個平板表面，經培養後挑取單個菌落。

3、平板劃線法

最簡單的分離微生物的方法是平板劃線法，即用接種環以無菌操作沾取少許待分離的材料，在無菌平板表面進行連續劃線，微生物細胞數量將隨著劃線次數的增加而減少，並逐步分散開來，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經培養後，可在平板表面得到單菌落。

有時這種單菌落並非都由單個細胞繁殖而來的，故必須反復分離多次才可得到純種。其原理是將微生物樣品在固體培養基表面多次作「由點到線」稀釋而達到分離目的的。劃線的方法很多，常見的比較容易出現單個菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。

4、 稀釋搖管法

用固體培養基分離嚴格厭氧菌有特殊性，如果該微生物暴露於空氣中不立即死亡，可以採用通常的方法制備平板，然後置放在封閉的容器中培養，容器中的氧氣可採用化學、物理或生物的方法清除。

對於那些對氧氣更為敏感的厭氧性微生物，純培養的分離則可採用稀釋搖管培養法進行，它是稀釋倒平板法的一種變通形式。

先將一系列盛無菌瓊脂培養基的試管加熱使瓊脂熔化後冷卻並保持在50℃左右，將待分離的材料用這些試管進行梯度稀釋，試管迅速搖動均勻，冷凝後，在瓊脂柱表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物，將培養基和空氣隔開。

培養後，菌落形成在瓊脂柱的中間。進行單菌落的挑取和移植，需先用一隻滅菌針將液體石蠟--石蠟蓋取出，再用一隻毛細管插入瓊脂和管壁之間，吹入無菌無氧氣體，將瓊脂柱吸出，置放在培養皿中，用無菌刀將瓊脂柱切成薄片進行觀察和菌落的移植。

(6)培養基的研究方法擴展閱讀

在以上介紹的幾種方法中，平板分離法普遍用於實驗室微生物的分離與純化，稀釋法是液體培養基分離純化常用的方法。

一般情況下可以通過適當改善培養基的條件來培養特點菌種。

如為了得到嗜熱微生物，可在50℃~60℃下進行培養。有時投加相應的抑制劑也能提高菌種分離效果，如在土壤樣品的懸浮液中投加10%的苯酚數滴，可以抑制黴菌和細菌的生長，而有利於放線菌的分離。在培養基中投加一定量的青黴素或鏈黴素能抑制細菌的生長，而有利於黴菌的分離。

⑦ 培養基的配製原理是什麼啊！

按照微生物生長的營養需求及其相互比例配製的。

一般都含有碳水化合物、含氮物質、無機鹽（包括微量元素）、維生素和水等幾大類物質，培養基既是提供細胞營養和促使細胞增殖的基礎物質，也是細胞生長和繁殖的生存環境，培養基種類很多。

根據配製原料的來源可分為自然培養基、合成培養基、半合成培養基；根據物理狀態可分為固體培養基、液體培養基、半固體培養基；根據培養功能可分為基礎培養基、選擇培養基、加富培養基、鑒別培養基等。

(7)培養基的研究方法擴展閱讀：

總體而言，所有微生物生長繁殖均需要培養基含有碳源、氮源、生長因子、水及能源，但由於微生物營養類型復雜，不同微生物對營養物質的需求是不一樣的，因此首先要根據不同微生物的營養需求配製針對性強的培養基。

自養型微生物能從簡單的無機物合成自身需要的糖類、脂類、蛋白質、核酸、維生素等復雜的有機物，因此培養自養型微生物的培養基完全可以由簡單的無機物組成。

例如，培養化能自養型的氧化硫硫桿菌，在該培養基配製過程中並未專門加入其他碳源物質，而是依靠空氣中和溶於水中的CO2為氧化硫硫桿菌提供碳源。

⑧ 培養基母液配製的方法如何

配製培養基是花卉組織培養的首要環節。培養基的成分隨著花卉的種類、不同的外植體、不同的培養階段應當有所不同。一般來說，各種培養基都有大量元素、微量元素、維生素、激素、糖和瓊脂等物質，有時還要在培養基里添加有機附加物，如活性炭、香蕉汁、椰子汁等。在生產上，首先選用已有的培養基配方，它是前人研究的成果，又是經過生產實踐驗證的。現在幾乎各種花卉用的營養基配方都有，可以免去您再研究的麻煩，當然在生產實踐中，也可適當改進。如果您找不到合適的配方，可先試用MS培養基，MS是Murashige和Skoog的縮寫，他們二人於1962年研究出來了這種培養基。下面以MS培養基為例，介紹怎樣配製。
（1）配製母液。把培養基中的必需元素按原配方量的50倍、100倍或1000倍稱量後製成一種濃溶液，這種濃溶液叫母液。在配製培養基時按比例分別量取母液稀釋到所需的濃度即可。母液配好後貼上標簽，放在0～4℃的冰箱中，可使用半年到1年，這樣做可節省許多時間。可能產生化學反應的或溶解後產生沉澱的，不能放在同一個容器中。配製母液要用重蒸餾水。葯物要使用分析純或等級較高的化學純。葯物的稱量和葯液的定容都要准確。
母液①：硫酸鎂18.5克，硝酸銨82.5克，硝酸鉀95.0克。加水定容到1000毫升，濃度為培養基的50倍，配1升培養基時量取20毫升母液。
母液②：氯化鈣22.0克。加水定容到500毫升，濃度為培養基的100倍，配1升培養基時量取10毫升母液。
母液③：磷酸二氫鉀8.5克。加水定容到500毫升，濃度為培養基的100倍，配1升培養基時量取10毫升母液。
母液④：乙二胺四乙酸二鈉3.73克，硫酸亞鐵2.78克。加水定容到1000毫升，濃度為培養基的100倍，配1升培養基時量取10毫升母液。
母液⑤：硼酸620毫克，硫酸錳2230毫克，硫酸鋅860毫克，硫酸銅2.5毫克，碘化鉀83毫克，鉬酸鈉25毫克，氯化鈷2.5毫克。加水定容到1000毫升，濃度為培養基的100倍，配1升培養基時量取10毫升母液。
母液⑥：肌醇5克，甘氨酸100毫克，煙酸25毫克，鹽酸吡哆醇25毫克，鹽酸硫胺素5毫克。加水定容到500毫升，濃度為培養基的100倍，配1升培養基時量取10毫升母液。
（2）配製培養基。配製每1000毫升培養基，稱取6～10克瓊脂作凝固劑，具體按配方要求稱量，放在水浴鍋上慢慢溶解。先在量筒內放入一定量的水，按照母液順序和規定量，量取母液。當母液加完後，根據需要每升培養基再加入生長調節物質如吲哚乙酸或萘乙酸等，細胞分裂素類0.04～10毫克，細胞分裂素應用最多的是6-苄基腺嘌呤，加完後倒入已熔化的瓊脂中。每1000毫升培養基加入蔗糖30克或根據要求確定，定容到所需的體積。繼續加溫，直到瓊脂完全熔解。用鹽酸或氫氧化鈉對培養基的pH進行調節，多數培養基的pH在5.4～6.0之間，MS培養基的pH為5.7。
將配好的培養基趁熱倒入培養容器中，培養基占容器體積的1/3～1/4。不要將培養基沾到容器壁上，否則容易被雜菌感染。然後及時加蓋，進行高壓滅菌，滅菌時要按高壓滅菌鍋的操作規程使用。在121℃、壓力111千帕下維持15～20分鍾，溫度和時間都要嚴格控制。到時間後立即切斷電源，當高壓鍋內壓力降到常壓後，開啟放氣閥，打開鍋蓋，取出滅菌好的培養基，放在接種室中培養3天，沒被感染後才能用來組織培養。

⑨ 細胞培養的具體步驟和要求以及注意事項

一、細胞復甦

將凍存細胞從液氮中取出後，在37℃水浴鍋內不斷搖動促進其融化。移人15ml離心管中，加入10ml預熱的DMEM完全培養基，輕輕吹勻，離心，2000rpmX2min，棄上清液。

加入10ml DMEM培養基清洗，棄上清液。加入10ml DMEM完全培養基，輕輕吹打，接種於10cm盤中，在含5%CO2的細胞培養箱中培養。

二、細胞傳代

細胞密度達到80%~90%時．去培養基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶，放人細胞培養箱3min。加人1ml DMEM完全培養基終止胰酶消化，轉移至15ml離心管。

加入10ml PBS清洗細胞培養盤，轉移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。再加入10ml PBS（經高壓滅菌，保存於40C），吹勻，吸取10微升進行計數，按照1×106/盤接種，在含5%CO2的細胞培養箱繼續培養。

三、細胞凍存

細胞密度達到80%～90%時，去培養基，10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶，放人細胞培養箱3min。加入lmlDMEM完全培養基終止胰酶消化，轉移至15ml離心管。加入10ml PBS清洗細胞培養盤，轉移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。

加入lml凍存液（90%血清，10%DMSO），放入凍存盒內（盒內有異丙醇，以保證溫度降低的速度），立即放入一80℃冰箱內，過夜，第二天放入液氮中，可以保存至少兩年，如不放人液氮，可以保存三個月。

凍存液的配製：70%的完全培養基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖。

注意事項

（1）進入細胞間開始細胞培養時，必須嚴格按照下列步驟操作：

①確定所有的細胞操作用的溶液和耗材都已經消毒並檢測沒有問題，不確定的溶液和耗材請勿使用，除非特殊情況，不要借用別人的溶液。

②確定衣服的袖口已經捲起或者白大褂的袖口已經扎緊。

③確定酒精燈內的酒精量，需要的話及時進行補充。

④確定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。為了方便單手開啟瓶蓋，實驗開始前可以把所有瓶蓋旋松。

⑤盡量不要直接傾倒溶液，除非瓶口沒有被燒壞。如果傾倒失敗，溶液粘在瓶口，請用噴過75%酒精的紙巾仔細清潔瓶口周圍（不要接觸到瓶口）後在火焰上簡單燒灼。

⑥操作時如果不能肯定所用的耗材是潔凈的，必須及時更換。

⑦實驗完畢及時收拾，保持工作區域清潔整齊，最後用75%酒精清潔檯面。

（2）細胞污染的預防

①實驗用品防止污染。細胞培養所用試劑、耗材、器材的清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌要仔細，並在無菌實驗檢測陰性後才能使用。操作室及剩餘的無菌器材要定期清潔、消毒、滅菌。

②操作過程防止污染。

③穿著容易起靜電或吸附灰塵的衣物必須更換為白大褂後才能進入細胞間。

④實驗開始前需要確定戴的手套沒有問題，只要接觸過生物安全櫃之外的物品，必須及時對手套進行消毒。

⑤進入細胞培養間後關好門，坐下來盡量少走動以免影響生物安全櫃的風簾。工作開始前要先用75%酒精棉球擦手和瓶蓋。事先要嚴格檢查所用的器材、溶液和細胞，不要把污染品或未經消毒的物品帶入無菌室內，更不能隨便使用，以免造成大規模污染。

⑥細胞操作時動作要輕，必須在火焰周圍無菌區內打開瓶口，並將瓶口放在火焰周圍簡單轉動燒灼，注意不要讓火焰把塑料瓶口燒化。

⑦實驗操作時生物安全櫃的隔板要盡可能放低，盡量減少談話，打噴嚏或咳嗽時絕對不能對著工作區，以免造成不必要的污染。

⑧瓶蓋應當倒放在遠離自己的地方，以避免瓶蓋被誤操作所污染。

⑨不要從敞開的容器口上方經過，以避免衣服上掉落不明物體對細胞的污染。

⑩實驗操作時要注意及時更換巴斯德吸管、移液槍槍頭和移液管，切勿一根管子做到底。一旦發現接觸了非潔凈或者無法確定潔凈的物品必須直接丟棄。實驗完畢應及時收拾，保持實驗室清潔整齊，最後用75%酒精清潔檯面。

（3）防止細胞交叉污染

①在進行多種細胞培養操作時，所用器具要嚴格區分，最好作上標記便於辨別。按順序進行操作，一次只處理一種細胞，多種細胞多種操作一起進行時易發生t昆亂。

②在進行換液或傳代操作時，粘有細胞的移液槍頭和移液管不要觸及試劑瓶瓶口，以免把細胞帶到培養基中污染其他細胞。

③所有細胞一旦購置，或從別處引入，或自己建立，必須及時保種凍存，一旦發生污染可重新復甦細胞，繼續培養。

(9)培養基的研究方法擴展閱讀：

細胞培養（cell culture）是指在體外模擬體內環境（無菌、適宜溫度、酸鹼度和一定營養條件等），使之生存、生長、繁殖並維持主要結構和功能的一種方法。細胞培養也叫細胞克隆技術，在生物學中的正規名詞為細胞培養技術。

不論對於整個生物工程技術，還是其中之一的生物克隆技術來說，細胞培養都是一個必不可少的過程，細胞培養本身就是細胞的大規模克隆。細胞培養技術可以由一個細胞經過大量培養成為簡單的單細胞或極少分化的多細胞，這是克隆技術必不可少的環節，而且細胞培養本身就是細胞的克隆。

細胞培養技術是細胞生物學研究方法中重要和常用技術，通過細胞培養既可以獲得大量細胞，又可以藉此研究細胞的信號轉導、細胞的合成代謝、細胞的生長增殖等。

⑩ 怎樣分析培養基配方

你是說分析製成品培養基的配方嗎？涉及別個的商業機密，而且現有的微生物培養基基本都是一些天然成分的混合物，能夠滿足某一種或者某一類微生物的生長需要即可，在發展初期是經驗選擇的，現在隨著專業化研究的發展與深入，配方培養基越來越多，但是仍然有些添加成分是天然的混合物，比如牛肉膏、蛋白腖、維生素這類，所以基本不可能完全搞清楚其配方成分。實在需要分析的話，那就要採用較為精密的化學分析方法了，可能會用到色譜分析法等。
研究工作中試制培養基的基本原則一般是，利用基本培養基加入你所研究的目的菌株所需要的特殊添加物質。例如在基本培養基的基礎上添加較多的鹽分，可以選擇並培養耐高鹽的微生物，此類方法一般也需要大量、系統化的實驗。屬於經驗性的探索准備試驗。