北京病毒多樣性測序分析方法

A. 誰了解宏病毒組測序方法和原理

宏病毒組測序的原理：宏病毒組測序分析是對樣本中所有病毒的遺傳物質為研究對象，主要原理是通過富集病毒核酸，構建高質量的宏病毒組文庫並進行高通量測序提取流程如下：
1.樣本預處理
2.去除宿主並富集病毒顆粒
3.提取病毒核酸（DNA/RNA/總核酸）
4.核酸質量檢測

然後對核酸提取合格的樣品採用標准或者微量建庫的方法構建200-500bp的小片段文庫，並提供文庫質檢報告，文庫質檢合格的樣品進行雙端PE150測序。流程如下：
1.片段化（200-500bp）
2.末端修復、接頭鏈接
3.PCR擴增
4.文庫質檢
5.上機測序

最後再根據獲得的數據結果進行生物信息分析。
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B. 如何對流行病毒株的特定基因進行測序

Porcine circovirus type2(PCV2)不僅是引起仔豬斷奶多系統衰竭征的主要病原體，而且還與其它病症相關。PCV2的危害在於能夠使感染豬只的免疫功能受到損害，這種可導致機體免疫抑制的病毒，由於經常以亞臨床感染的形式出現，常易被忽視。因此應當進一步加強對PCV2感染的流行病學及分子病學研究。 本研究採用PCR診斷技術對所收集的73份疑似PCV2病的病料進行檢測，得到18份PCV2陽性病料。 採用反向PCR技術對陽性病料中的6株豬圓環病毒Ⅱ型(PCV2)進行全基因的擴增、克隆和測序，得到長度為1768或1767bp的目的基因片段。 應用DNAstar序列分析軟體對所測定的6株PCV2序列進行同源性分析。結果顯示，六株之間的核苷酸同源性為95.5％～100％。應用計算機分析兩個主要閱讀框ORF1和ORF2並推導其氨基酸序列，分離株ORF1的核苷酸及氨基酸之間的同源性分別為96.9％～100.0％和98.1％～100％，說明ORF1非常保守，這與其編碼蛋白的功能有關。分離株ORF2之間的核苷酸及氨基酸同源性分別為92.9％～100％和92.3％～100％，變異相對於ORF1較大，與國外已發表毒株的ORF2比較，發現變異主要發生在三個區域，其中兩個與病毒的抗原表位相對應，推測這些變異可能與PCV2抗原性及致病性的改變有關。 應用Mega和CLUSTAL分析軟體對分離株和國內外已發表的34株PCV2及2株PCV1序列進行比較，並建立了遺傳進化樹。該進化樹主要分為兩大群，兩個基因型遺傳距離上相對較遠，分為兩群。PCV2各分離株之間存在著某種地理區域上的相關性，分為兩大群，以美國和加拿大為代表的一群，以及以法國為代表的一群。本實驗分離株皆屬第二群，說明廣西株與法國株親緣關系較近。

C. 如何用PCR方法檢測基因的多樣性

多態性（polymorphism）是指處於隨機婚配的群體中，同一基因位點可存在2種以上的基因型。在人群中，個體間基因的核苷酸序列存在著差異性稱為基因（DNA）的多態性(gene polymorphism)。這種多態性可以分為兩類，即DNA位點多態性(site polymorphism)和長度多態性 (longth polymorphism)。

基因多態性的主要檢測方法簡述如下：
1．限制性片段長度多態性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：由DNA 的多態性，致使DNA 分子的限制酶切位點及數目發生改變，用限制酶切割基因組時，���鈉�問�亢兔扛銎�蔚某ざ染筒煌��此�降南拗菩雲�緯ざ榷嗵�裕�賈孿拗破�緯ざ確⑸�謀淶拿蓋形壞悖�殖莆�嗵�暈壞恪W鈐縭怯肧outhern Blot/RFLP方法檢測，後來採用聚合酶鏈反應（PCR）與限制酶酶切相結合的方法。現在多採用PCR-RFLP法進行研究基因的限制性片段長度多態性。

2．單鏈構象多態性（SSCP）：是一種基於單鏈DNA構象差別的點突變檢測方法。相同長度的單鏈DNA如果順序不同，甚至單個鹼基不同，就會形成不同的構象。在電泳時泳動的速度不同。將PCR產物經變性後，進行單鏈DNA凝膠電泳時，靶DNA中若發生單個鹼基替換等改變時，就會出現泳動變位（mobility shift），多用於鑒定是否存在突變及診斷未知突變。

3．PCR-ASO探針法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特異性寡核苷酸探針法。在PCR擴增DNA片段後，直接與相應的寡核苷酸探雜交，即可明確診斷是否有突變及突變是純合子還是雜合子。其原理是：用PCR擴增後，產物進行斑點雜交或狹縫雜交，針對每種突變分別合成一對寡核苷酸片段作為探針，其中一個具有正常序列，另一個則具有突變鹼基。突變鹼基及對應的正常鹼 基勻位於寡核苷酸片段的中央，嚴格控制雜交及洗脫條件，使只有與探針序列完全互補的等位基因片段才顯示雜交信號，而與探針中央鹼基不同的等位基因片段不顯示雜交信號，如果正常和突變探針都可雜交，說明突變基因是雜合子，如只有突變探針可以雜交，說明突變基因為純合子，若不能與含有突變序列的寡核苷探針雜交，但能與相應的正常的寡核苷探針雜交，則表示受檢者不存在這種突變基因。若與已知的突變基因的寡核苷探針勻不能雜交，提示可能為一種新的突變類型。

4. PCR-SSO法：SSO技術即是順序特異寡核苷酸法（Sequence Specific Oligonucleotide, SSO）。原理是PCR基因片段擴增後利用序列特異性寡核苷酸探針，通過雜交的方法進行擴增片段的分析鑒定。探針與PCR產物在一定條件下雜交具有高度的特異性，嚴格遵循鹼基互補的原則。探針可用放射性同位素標記，通過放射自顯影的方法檢測，也可以用非放射性標記如地高辛、生物素、過氧化物酶等進行相應的標記物檢測。

5. PCR-SSP法：序列特異性引物分析即根據各等位基因的核苷酸序列，設計出一套針對每一等位基因特異性的（allele-specific）、或組特異性 (group-specific)的引物，此即為序列特異性引物（SSP）。SSP只能與某一等位基因特異性片段的鹼基序列互補性結合，通過PCR特異性地擴增該基因片段，從而達到分析基因多態性的目的。

6. PCR-熒光法：用熒游標記PCR引物的5』端，熒光染料FAM和JOE呈綠色熒光，TAMRA呈紅色熒光，COUM 呈蘭色熒光，不同熒游標記的多種引物同時參加反應，PCR擴增待檢測的DNA，合成的產物分別帶有引物5』端的染料，很容易發現目的基因存在與否。

7. PCR-DNA測序：是診斷未知突變基因最直接的方法，由於PCR技術的應用，使得DNA 測序技術從過去的分子克隆後測序進入PCR直接測序。PCR產物在自動測序儀上電泳後測序。常用方法有：Sanger雙脫氧末端終止法;Maxam-Gilbert化學裂解法；DNA測序的自動化。目前DNA順序全自動激光測定法是最先進的方法。

8. PCR指紋圖法（PCR-fingerprints）：實用於快速的同種異型DR/Dw配型。在DR/DW純合子及雜合子個體中，每種DR單倍型及每種單倍型組合所產生的單鏈環狀結構的大小、數目和位置各異，由於同質雙鏈和異質雙鏈之間的分子構象不同。因此，在非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳時，它們的遷移率各不相同，從而獲得單倍型特異的電泳帶格局即PCR指紋。也有人用人工合成的短寡核苷酸片段作為探針，同經過酶切的人體DNA作Southern blot，可以得出長度不等的雜交帶，雜交帶的數目和分子量的大小具有個體特異性，除非同卵雙生，幾乎沒有兩個人是完全相同的，就象人的 指紋一樣，人們把這種雜交帶圖形稱為基因指紋(gene finger-printing)。

9. 基因晶元法：又稱為DNA 微探針陣列（Micro array）。它是集成了大量的密集排列的大量已知的序列探針，通過與被標記的若干靶核酸序列互補匹配，與晶元特定位點上的探針雜交，利用基因晶元雜交圖象，確定雜交探針的位置，便可根據鹼基互補匹配的原理確定靶基因的序列。這一技術已用於基因多態性的檢測。對多態性和突變檢測型基因晶元採用多色熒光探針雜交技術可以大大提高晶元的准確性、定量及檢測范圍。應用高密度基因晶元檢測單鹼基多態性，為分析SNPs提供了便捷的方法。

10. AFLP（Amplication Fragment Length Polymorphism）法
AFLP技術是一項新的分子標記技術，是基於PCR技術擴增基因組DNA限制性片段，基因組DNA先用限制性內切酶切割，然後將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，接頭序列和相鄰的限制性位點序列，作為引物結合位點。限制性片段用二種酶切割產生，一種是罕見切割酶，一種是常用切割酶。它結合了RFLP和PCR技術特點，具有RFLP技術的可靠性和PCR技術的高效性。由於AFLP擴增可使某一品種出現特定的DNA譜帶，而在另一品種中可能無此譜帶產生，因此，這種通過引物誘導及DNA擴增後得到的DNA多態性可做為一種分子標記。AFLP可在一次單個反應中檢測到大量的片段。以說AFLP技術是一種新的而且有很大功能的DNA指紋技術。

11. DGGE（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE）法
變性梯度凝膠電泳法（） DGGE法分析PCR產物，如果突變發生在最先解鏈的DNA區域，檢出率可達100％，檢測片段可達1kb，最適圍為100bp-500bp。基本原理基於當雙鏈DNA在變性梯度凝膠中進行到與DNA變性濕度一致的凝膠位置時，DNA發生部分解鏈，電泳適移率下降，當解鏈的DNA鏈中有一個鹼基改變時，會在不同的時間發生解鏈，因影響電泳速度變化的程度而被分離。由於本法是利用溫度和梯度凝膠遷移率來檢測，需要一套專用的電泳裝置，合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夾，以利於檢測發生於高熔點區的突變。在DGGE的基礎上，又發展了用濕度梯度代替化學變性劑的TGGE法（溫度梯度凝膠電泳temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE）。DGGE和TGGE均有商品化的電泳裝置，該法一經建立，操作也較簡便，適合於大樣本的檢測篩選。
12. RAPD（Random amplified polymorphic DNA）法
運用隨機引物擴增尋找多態性DNA片段可作為分子標記。這種方法即為RAPD( Random amplified polymorphic DNA，隨機擴增的多態性DNA)。盡管RAPD技術誕生的時間很短, 但由於其獨特的檢測DNA多態性的方式以及快速、簡便的特點,使這個技術已滲透於基因組研究的各個方面。該RAPD技術建立於PCR技術基礎上,它是利用一系列(通常數百個)不同的隨機排列鹼基順序的寡聚核苷酸單鏈(通常為10聚體)為引物,對所研究基因組DNA進行PCR擴增.聚丙烯醯胺或瓊脂糖電泳分離,經EB染色或放射性自顯影來檢測擴增產物DNA片段的多態性,這些擴增產物DNA片段的多態性反映了基因組相應區域的DNA多態性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但對於任一特異的引物,它同基因組DNA序列有其特異的結合位點.這些特異的結合位點在基因組某些區域內的分布如符合PCR擴增反應的條件,即引物在模板的兩條鏈上有互補位置,且引物3'端相距在一定的長度范圍之內,就可擴增出DNA片段.因此如果基因組在這些區域發生DNA片段插入、缺失或鹼基突變就可能導致這些特定結合位點分布發生相應的變化,而使PCR產物增加、缺少或發生分子量的改變。通過對PCR產物檢測即可檢出基因組DNA的多態性。分析時可用的引物數很大,雖然對每一個引物而言其檢測基因組DNA多態性的區域是有限的,但是利用一系列引物則可以使檢測區域幾乎覆蓋整個基因組。因此RAPD可以對整個基因組DNA進行多態性檢測。另外，RAPD片段克隆後可作為RFLP的分子標記進行作圖分析。

D. DNA測序的測序技術

高通量測序技術（High-throughput sequencing）又稱「下一代」測序技術（Next-generation sequencing technology），以能一次並行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標志。
根據發展歷史、影響力、測序原理和技術不同等，主要有以下幾種：大規模平行簽名測序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆（Polony Sequencing）、454焦磷酸測序（454 pyrosequencing）、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、離子半導體測序（Ion semiconctor sequencing）、DNA 納米球測序 （DNA nanoball sequencing）等。 基因分析儀(即DNA測序儀)，採用毛細管電泳技術取代傳統的聚丙烯醯胺平板電泳，應用該公司專利的四色熒光染料標記的ddNTP(標記終止物法)，因此通過單引物PCR測序反應，生成的PCR產物則是相差1個鹼基的3'末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測序PCR產物可在一根毛細管內電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測序的精確度。由於分子大小不同，在毛細管電泳中的遷移率也不同，當其通過毛細管讀數窗口段時，激光檢測器窗口中的CCD(charge-coupled device)攝影機檢測器就可對熒光分子逐個進行檢測，激發的熒光經光柵分光，以區分代表不同鹼基信息的不同顏色的熒光，並在CCD攝影機上同步成像，分析軟體可自動將不同熒光轉變為DNA序列，從而達到DNA測序的目的。分析結果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或鹼基排列順序等多種形式輸出。
它是一台能自動灌膠、自動進樣、自動數據收集分析等全自動電腦控制的測定DNA片段的鹼基順序或大小和定量的高檔精密儀器。PE公司還提供凝膠高分子聚合物，包括DNA測序膠(POP 6)和GeneScan膠(POP 4)。這些凝膠顆粒孔徑均一，避免了配膠條件不一致對測序精度的影響。它主要由毛細管電泳裝置、Macintosh電腦、彩色列印機和電泳等附件組成。電腦中則包括資料收集，分析和儀器運行等軟體。它使用最新的CCD攝影機檢測器，使DNA測序縮短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析為10～40min。
由於該儀器具有DNA測序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可進行DNA測序、雜合子分析、單鏈構象多態性分析(SSCP)、微衛星序列分析、長片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，臨床上可除進行常規DNA測序外，還可進行單核苷酸多態性(SNP)分析、基因突變檢測、HLA配型、法醫學上的親子和個體鑒定、微生物與病毒的分型與鑒定等。
一、准備工作
1. BigDye測序反應試劑盒 主要試劑是BigDye Mix，內含PE專利四色熒游標記的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反應緩沖液等。
2. pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA對照模板 0.2 g/L，試劑盒配套試劑。
3. M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2 μmol/L，即3.2 pmol/μl，試劑盒配套試劑。
4. DNA測序模板 可以是PCR產物、單鏈DNA和質粒DNA等。模板濃度應調整在PCR反應時取量1 μl為宜。本實驗測定的質粒DNA，濃度為0.2 g/L，即200 ng/μl。
5. 引物需根據所要測定的DNA片段設計正向或反向引物，配製成3.2 μmol/L，即3.2 pmol/μl。如重組質粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。
6. 滅菌去離子水或三蒸水。
7. 0.2 ml或和0.5 ml的PCR管 蓋體分離。
8. 3 mol/L 醋酸鈉(pH5.2) 稱取40.8 g NaAc·3H2O溶於70 ml蒸餾水中，冰醋酸調pH至5.2，定容至100 ml，高壓滅菌後分裝。
9. 70%乙醇和無水乙醇。
10. NaAc/乙醇混合液 取37.5 ml無水乙醇和2.5 ml 3 mol/L NaAc混勻，室溫可保存1年。
11. POP 6測序膠 。
12. 模板抑制試劑(TSR) 。
13. 10×電泳緩沖液 。
14. 全自動DNA測序儀。
15. PCR儀。
16. 台式冷凍高速離心機。
17. 台式高速離心機或袖珍離心機。
二、PCR測序反應
1. 取0.2 ml的PCR管，用記號筆編號，將管插在顆粒冰中，按下表加試劑：
所加試劑 測定模板管 標准對照管
BigDye Mix 1 μl 1 μl
待測的質粒DNA 1 μl －
pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA － 1 μl
待測DNA的正向引物 1 μl －
M13(-21)引物 － 1 μl
滅菌去離子水 2 μl 2 μl
總反應體積5 μl，不加輕礦物油或石蠟油，蓋緊PCR管，用手指彈管混勻，稍離心。
2. 將PCR管置於9600或2400型PCR儀上進行擴增。98℃變性2 min後進行PCR循環，PCR循環參數為96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃4 min，25個循環，擴增結束後設置4℃保溫。
三、醋酸鈉/乙醇法純化PCR產物
1. 將混合物離心，將擴增產物轉移到1.5 ml EP管中。
2. 加入25 μl醋酸鈉/乙醇混合液，充分振盪，置冰上10 min以沉澱DNA。12 000 r/min於4℃離心30 min，小心棄上清。
3. 加70%(V/V)的乙醇50 μl洗滌沉澱2次。12 000 r/min於4℃離心5 min，小心棄上清和管壁的液珠，真空乾燥沉澱10～15 min。
四、電泳前測序PCR產物的處理
1. 加入12 μl的TSR於離心管中，劇烈振盪，讓其充分溶解DNA沉澱，稍離心。
2. 將溶液轉移至蓋體分離的0.2 ml PCR管中，稍離心。
3. 在PCR儀上進行熱變性(95℃ 2 min)，冰中驟冷，待上機。
五、上機操作 1. 按儀器操作說明書安裝毛細管，進行毛細管位置的校正，人工手動灌膠和建立運行的測序順序文件。2. 儀器將自動灌膠至毛細管，1.2 kV預電泳5 min，按編程次序自動進樣，再預電泳(1.2 kV，20 min)，在7.5 kV下電泳2 h。3. 電泳結束後儀器會自動清洗，灌膠，進下一樣品，預電泳和電泳。4. 每一個樣品電泳總時間為2.5 h。5. 電泳結束後儀器會自動分析或列印出彩色測序圖譜。
六、序列分析 儀器將自動進行序列分析，並可根據用戶要求進行序列比較。如測序序列已知，可通過序列比較以星號標出差異鹼基處，提高工作效率。
七、儀器清洗 測序完畢按儀器操作規程進行儀器清洗與保養。
八、計算
1. 測序反應精確度計算公式：100%－差異鹼基數(不包括N數)/650×100%。
2. 差異鹼基即測定的DNA序列與已知標准DNA序列比較不同的鹼基，N為儀器不能辨讀的鹼基。 SILVER SEQUENCETM DNA測序系統是一種無放射性的序列分析系統，它通過靈敏的銀染方法檢測凝膠中的條帶。 銀染提供了一種對於放射性或熒光法來說更加快速，廉價的替代方法。測序結果可以在同一天內得到；電泳完成後經90分鍾就可讀序，這是常規的放射性測序法做不到的。 此外，SILVER SEQUENCETM系統用未修飾的5'OH寡聚核苷酸作為引物，減少了特殊修飾寡聚核苷酸的花費。該系統不需要放射性方法中對同位素的謹慎操作，也不需要熒光法或化學發光技術的昂貴試劑。另外，也不需要象大多數熒光法那樣用儀器來檢測序列條帶。
Taq DNA聚合酶在95℃時極強的熱穩定性。本系統利用的測序級Taq DNA聚合酶是一種Taq DNA聚合酶的修飾產品，對於雙鏈DNA模板有非常好的效果，具有高度的准確性，能產生均一的條帶，且背景低。
SILVER SEQUENCETM系統包含被修飾的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP（7-deaza dGTP，或dITP）替代dGTP可清除由GC豐富區域所引起的條帶壓縮現象。
退火溫度是熱循環測序中最重要的因素。高退火溫度可減少模板二級結構。提高引物結合模板配對的嚴謹性。鏈重退火和模板二級結構則限制了小片斷PCR產物（<500bp）得到清楚的序列數據的能力。引物延伸起始於每個循環的退火階段。在較低溫度時，聚合酶可能會遇到堅固的二級結構區域，它可導致聚合酶解離。則在四個電泳道中均有同一相對位置的條帶。因為這些原因，應該使用盡可能高的退火溫度。對於有牢固二級結構的模板建議使用95℃變性、70℃退火/延伸的循環模式。一般來說，較長的引物及GC含量高的引物能得到較強的信號。實驗結果表明，>24mer的GC含量約為50%的引物可得到最佳結果。
由於本系統採用熱循環裝置, 與常規的測序方法相比具有如下幾點好處：(1).本方法線性擴增模板DNA產生足夠的產物使銀染技術能夠檢測序列條帶，測序反應需要0.03～2pmol模板DNA，隨模板種類而定。(2). 在每一個變性循環中的高溫可以取代對雙鏈DNA（dsDNA）模板的鹼變性及乙醇沉澱過程，變性循環也有助於消除由於線性dsDNA模板（如PCR反應產物）快速重退火所引起的問題。(3). 高溫聚合酶反應減弱了DNA模板的二級結構，允許聚合酶穿過高度二級結構化的區域。
一、試劑准備
1. SILVER SEQUENCETM DNA測序試劑盒。
2. 丙烯醯胺和甲叉雙丙烯醯胺儲備液（38%丙烯醯胺 W/V，2%甲叉雙丙烯醯胺 W/V）：95 g丙烯醯胺，5 g甲叉雙丙烯醯胺溶於140 ml 雙蒸水中，定容至250 ml，0.45 mm過濾器過濾後，貯於棕色瓶中，置於4℃冰箱可保存2周。
3. 10%過硫酸銨，0.5 g過硫酸銨溶於4 ml水中，定容至5 ml，應新配新用。
4. 10×TBE緩沖液（1 mol/L Tris， 0.83mol/L 硼酸，10 mmol/L EDTA）： 121.1 g Tris，51.35 g硼酸，3.72 g Na2EDTA ·2H2O，溶於雙蒸水中定容至1升，置於4℃下可貯存2周，其pH約為8.3。
5. TBE電極緩沖液：10×TBE 緩沖液稀釋至1×TBE備用。
6. TEMED
7. 固定/停止溶液：10%冰醋酸（V/V）配製2升備用。
8. 染色溶液：硝酸銀2 g，甲醛3 ml，溶於2升超純水中備用。
9. 顯影溶液：60 g碳酸鈉（Na2CO3)溶於2升超純水中，使用前加3 ml 37%甲醛和40 ml硫代硫酸鈉溶液（10 mg/ml）。
10. 95%乙醇。
11. 0.5%冰乙酸。
12. Sigmacote （Sigma CAT. #SL-2）。
二、測序反應
1. 對於每組測序反應，標記四個0.5 ml eppendorf管（G、A、T、C）。每管加入2 ml適當的d/ddNTP混合物（d/ddNTP Mix）。各加入1滴（約20 μl）礦物油，蓋上蓋子保存於冰上或4℃備用。
2. 對於每組四個測序反應，在一個eppendorf管中混合以下試劑：
（1） 樣品反應：
質粒模板DNA ：2.1 pmol
5×測序緩沖液 ： 5 ml
引物： 4.5 pmol
無菌ddH2O 至終體積16 ml
（2）對照反應
pGEM-3Zf（+）對照DNA（4 mg） ：4.0 ml
5×測序緩沖液： 5 ml
pUC/M13正向引物（4.5 pmol） ：3.6 ml
3. 在引物/模板混合物（以上第2步）中加入1.0 ml測序級Taq DNA聚合酶（5 μ/ml）。用吸液器吸動幾次混勻。
4. 從第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4 ml加入每一個d/ddNTP混合物的管內。
5. 在微量離心機中離心一下，使所有的溶液位於eppendorf管底部。
6. 把反應管放入預熱至95℃的熱循環儀，以【注意】中循環模式為基準，開始循環程序。對於每個引物/模板組合都必須選擇最佳退火溫度。下列程序一般能讀出從引物開始350鹼基的長度。
7. 熱循環程序完成後，在每個小管內加入3 μlDNA測序終止溶液，在微量離心機中略一旋轉，終止反應。
【注意】
（1）測序所用模板DNA的量一般按下面要求加入：
模板種類/長度 模板量
200 bp（PCR產物）：16 ng（120 fmol）
3000～5 000 bp（超螺旋質粒DNA）： 4 mg（2 pmol）
48 000 bp（λ,粘粒DNA）： 1 mg（31 fmol）
由於超螺旋質粒產生的信號比鬆弛的線性雙鏈DNA弱，因此使用超螺旋質粒作為模板時其用量要比其它模板大一些。
（2）計算與4.5 pmol相當的引物納克數可用以下一般公式：
4.5 pmol=1.5 ng×n，其中n為引物鹼基數
計算與1p mol相當的引物微克數可用以下一般公式：
dsDNA：1 pmol=（6.6×10mg）×n，其中n為模板鹼基對數
ssDNA：1pmol=（3.3×10mg）×n，其中n為模板鹼基數
（3）為阻止Taq DNA聚合酶延伸非特異性退火引物， 熱循環儀必須預熱至95℃。溫度變換應越快越好。下面的循環時間不包括變溫時間。如果你無法確定使用何種模式，建議從模式1開始。
模式1：適用於引物<24鹼基或GC含量<50%
95℃ 2分鍾，然後： 95℃ 30秒（變性），42℃ 30秒（退火），70℃ 1分鍾（延伸）。
模式2：適用於≥24鹼基或略短的GC含量≥50%的引物。
95℃ 2分鍾，然後：95℃ 30秒（變性），70℃ 30秒（退火/延伸）。
（4）在加入終止溶液之後樣品可在4℃保存過夜。
三、測序凝膠板的制備
1. 玻璃板的處理
銀染測序的玻璃板一定要非常清潔，一般先用溫水和去污劑洗滌，再用去離子水沖洗玻璃板，除去殘留的去污劑，最後用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遺留的去污劑微膜可能導致凝膠染色時背景偏高（棕色）。短玻璃板經粘合溶液處理可將凝膠化學交聯於玻璃板上。這一步對於在銀染操作過程中防止凝膠撕裂至關重要。
（1）短玻璃板的處理
① 在1 ml95%乙醇，0.5%冰乙酸中加入5 ml粘合硅烷（Bind Silane），配成新鮮的粘合溶液。
② 用經浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉紙擦拭仔細清洗過並已經自然乾燥的玻璃板，整個板面都必須擦拭。
③ 4～5分鍾後，用95%乙醇單向擦玻璃板，然後略用力沿垂直方向擦拭。重復三次這一清洗過程，每次均須換用干凈的紙，除去多餘的粘合溶液。
【注意】
① 在95%乙醇單向擦玻璃板時過度用力會帶走過多的粘合硅烷，使凝膠不能很好地粘附。
② 准備長玻璃板之前要更換手套，防止粘染粘合硅烷。
③ 防止粘合溶液沾染在長玻璃板上是很重要的，否則將導致凝膠撕裂。
（2）長玻璃板的處理：
① 用浸透Sigmacote溶液的棉紙擦拭清洗過的長玻璃板。
② 5～10分鍾後用吸水棉紙擦拭玻璃板以除去多餘的Sigmacote溶液。
【注意】
① 用過的凝膠可在水中浸泡後用剃須刀片或塑料刮刀颳去。玻璃板須用去污劑完全清洗。或者凝膠用10%NaOH浸泡後除去。為防止交叉污染，用於清洗短玻璃板的工具必須與清洗長玻璃板的工具分開，如果出現交叉污染，以後制備的凝膠可能撕裂或變得鬆弛。
2. 凝膠的制備
（1）玻璃板經粘合硅膠和Sigmacote處理後，即可固定玻璃板。該方法是用0.2 mm或0.4 mm厚的邊條置於玻璃板左右兩側，將另一塊玻璃板壓於其上。在長玻璃板的一側插入鯊魚齒梳平的一面邊緣，用夾子固定住。
（2）根據所需要的凝膠濃度，按下表制備測序凝膠，一般6%～8%的膠濃度可獲得較好的結果。配製過程中，先用適量雙蒸水溶解尿素，再加入Acr&Bis和10×TBE緩沖液，再用雙蒸水調終體積至99.2 ml，並用0.45 mm的濾膜過濾，然後加過硫酸銨和TEMED。溶解尿素時不必加熱。如果確需加熱則應等溶液完全冷卻後，方可加入TEMED和過硫酸銨。一般在膠灌制後4～6分鍾，即開始聚合，如果聚合不好，則應使用高濃度的TEMED和過硫酸銨。
（3）膠配製好後，即可灌制膠板。一般是將凝膠沿著壓條邊緣緩慢地倒入玻璃板的槽中，倒完後，靜止放置使之聚合完全。
【注意】
① 使用夾子固定玻璃板時，最好夾子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌膠的過程中出現漏膠液現象。
② 灌制凝膠的過程中要嚴防產生氣泡，否則影響測序的結果。
四、電泳
1. 預電泳
（1）當凝膠聚合完全後，撥出鯊魚齒梳，將該梳子反過來，把有齒的一頭插入凝膠中，形成加樣孔。
（2）立即將膠板固定在測序凝膠槽中，一般測序凝膠槽的上下槽是分開的，因而只有在固定好凝膠板後，方能加入TBE緩沖液。
（3）稀釋10×TBE緩沖液至1×TBE，將該緩沖液加入上下二個電泳槽中，去除產生的氣泡，接上電源准備預電泳。
（4）有些電泳槽，如LKB的Macrophor等是使用水浴加熱的，則應先將水浴加熱至55℃後進行預電泳。有的不使用水浴加熱，依靠電泳過程中自身產生的熱進行保溫，如上海求精有機玻璃儀器生產的測序電泳槽，這種槽需夾上二塊散熱鋁板，使整個凝膠板的溫度一致。
（5）按30 V/cm的電壓預電泳20～30分鍾。預電泳的過程是去除凝膠的雜質離子，同時使凝膠板達到所需的溫度。高溫電泳可防止GC豐富區形成的發夾狀結構，影響測序的結果。
【注意】
① 用鯊魚齒梳製作加樣孔時，應注意將齒尖插入膠中0.5mm左右，千萬注意不能使加樣孔滲漏，否則得不到正確的結果。
② 應時刻注意上面電泳槽中的緩沖液是否滲漏，否則極易造成短路而損壞電泳儀。
2. 樣品的制備
當在預電泳時，即可進行樣品的制備，將反應完畢的樣品在沸水浴中加熱1～3分鍾，立即置於冰上即可。如果樣品長時間不用，則應重新處理。可使用4～6%聚丙烯醯胺凝膠，膠厚0.4 mm。厚度小於0.4 mm的膠可能導致信號太弱。加樣時不必吸去上層覆蓋的礦物油，但要小心地吸取礦物油下的藍色樣品。
3. 上樣及電泳
關閉電泳儀，用移液槍吸緩沖液清洗樣品孔，去除在預電泳時擴散出來的尿素，然後立即用毛細管進樣器吸取樣品，加入樣品孔中。上樣順序一般為G、A、T、C。加樣完畢後，立即電泳。開始可用30 V/cm進行電泳，5分鍾後可提高至40～60 V/cm，並保持恆壓狀態。一般來說，一個55 cm長，0.2 mm厚的凝膠板，在2500 V恆壓狀態下電泳2小時即可走到底部，同時在電泳過程中，電流可穩定地從28 mA降至25 mA。為了能讀到更長的序列，可採用兩輪或多輪上樣。
【注意】
① 上樣電泳時，一定要注意凝膠板的溫度是否達到55℃左右，如果還沒有達到，則應等溫度達到後才能上樣電泳。
② 一般來說電泳時，不宜使用太高的電壓，因為太高的電壓會使凝膠的解析度降低，並且使帶擴散。電泳中可進行恆功率電泳。
五、測序凝膠的銀染
染色過程要求凝膠浸在塑料盤中。因而至少使用兩個盤子，大小與玻璃板類似。在盤中加入新鮮溶液之前須用高質量的水洗滌盤子。
1. 電泳完畢後用一個塑料片子小心地分開兩板，凝膠應該牢固地附著在短玻璃板上。
2. 固定凝膠：將凝膠（連玻璃板）放入塑料盤，用固定/停止溶液浸沒，充分振盪20分鍾或直至樣品中染料完全消失，膠可在固定/停止溶液中保存過夜（不振盪）。保留固定/停止溶液，用於終止顯影反應。
3. 洗膠：用超純水振盪洗膠3次，每次2分鍾。從水中取出，當轉移至下一溶液時拿著膠板邊沿靜止10～20秒，使水流盡。
4. 凝膠染色：把凝膠移至染色溶液充分搖動30分鍾。
5. 凝膠顯影
（1）在顯影溶液中加入甲醛（3 ml）和硫代硫酸鈉溶液（400 μl）以完成顯影液的配製。
（2）從染色溶液中取出凝膠放入裝有超純水的盤中浸洗5～10秒。注意，把凝膠從超純水轉移到顯影溶液的總時間不能長於5～10秒。浸泡時間過長則導致信號微弱或喪失信號。若浸泡時間過長，可重復第五步用染色液浸泡。
（3）立刻將凝膠轉移至1升（總量的一半）預冷的顯影液充分振盪直至模板帶開始顯現或開始出現第一批條帶，把凝膠移入剩下的1升顯影液中繼續顯影2～3分鍾或直至所有條帶出現。
6. 固定凝膠：在顯影液中直接加入等體積的固定/停止溶液。停止顯影反應，固定凝膠。
7. 在超純水中浸洗凝膠兩次，每次2分鍾，注意在本操作中戴手套拿著膠板邊緣避免在膠上印上指紋。
8. 將凝膠置於室溫乾燥或用抽氣加熱法乾燥。在可見光燈箱或亮白，黃色背景（如紙）上觀察凝膠，若需永久保存的記錄, 則可用EDF膠片保留實驗結果。
【注意】
測序產物的銀染是顯現序列信息的一種新方法，本系統的成敗受幾個因素的影響
① 水的質量對於染色的成功極其重要。超純水（NANOpureR或Milli-QR的水）或雙蒸水可獲得較好的效果，如果水中有雜質，則低分子量條帶可能無法出現。
② 碳酸鈉也非常重要。使用新鮮的，美國化學學會級碳酸鈉較好，如Fisher和Kodak ACS試劑級碳酸鈉（Fisher Cat #S263-500或S262-3，或Kodak Cat #109-1990），一般可獲得較好的結果。
③ 色後的洗滌步驟是非常關鍵的。如果凝膠洗滌時間太長，銀顆粒會脫離DNA，產生很少或沒有序列信號。如果洗滌時間過長，染色步驟可以重新進行。
④ 如果凝膠厚度超過0.4 mm或丙烯醯胺濃度高於4～6%，則有必要延長固定和染色的時間。如果凝膠比0.4 mm薄，染色反應後的洗滌必須縮短至不超過5秒。
⑤ 在室溫下進行所有步驟，顯影反應除外。顯影溶液必須預冷至10～12℃以減小背景雜色。注意：臨用前在顯影溶液中加入甲醛和硫代硫酸鈉。用新配的染色及顯影溶液。不要重復使用任何溶液。
六、EDF膠片顯影
使用EDF膠片可增強測序條帶的對比度，如果測序膠上條帶很淡，我們建議把數據轉移至EDF膠片，銀染膠在其影像轉移至EDF膠片之後可增強條帶可讀性。
1. 在暗室內，將染色過的粘於玻璃板的凝膠（膠面向上）置於熒光燈箱上。如有合適的漫射板，亦可用白燈箱，為確保曝光時間，用一小條EDF膠片曝光不同時間，檢查不同的曝光強度，一般曝光20～40秒可得較好結果。
2. 在紅燈下找到EDF膠片有缺刻的一角，然後把膠片置於凝膠上，使缺口位於左上角。由於EDF膠片是單面的，因此必須確保缺口在左上角。
3. 在EDF膠片上放置一干凈、乾燥的玻璃板，開亮燈箱約20秒。
4. 用沖顯放射自顯影膠片的步驟手工顯影EDF膠片，可使用下列操作過程：
（1） 在Kodak GBX顯影液中顯影1～5分鍾；
（2） 水洗1分鍾；
（3）在Kodak GBX定影液中定影3分鍾；
（4）水洗1分鍾。
【注意】
① 進行EDF膠片顯影之前凝膠必須完全乾燥。戴手套進行操作，以免印上指紋。同時注意EDF膠片不能用自動膠片處理器。
② 對於不同的光源最佳曝光時間可能不同，通過對一小條EDF膠片曝光不同時間以選擇你所用光源的最佳曝光時間，參閱膠片說明書。
③ 曝光時間短則EDF膠片影像較深，曝光時間長則有助於減弱背景。 「鳥槍法」是一種由生物基因組提取目的基因的方法。首先利用物理方法(如剪切力、超聲波等)或酶化學方法(如限制性內切核酸酶)將生物細胞染色體DNA切割成為基因水平的許多片段，繼而將這些片段與適當的載體結合，將重組DNA轉入受體菌擴增，獲得無性繁殖的基因文庫，再結合篩選方法，從眾多的轉化子菌株中選出含有某一基因的菌株，從中將重組的DNA分離、回收。
這種方法也就是應用基因工程技術分離目的基因，其特點是繞過直接分離基因的難關，在基因組DNA文庫中篩選出目的基因。可以說這是利用「溜散彈射擊」原理去「命中」某個基因。由於目的基因在整個基因組中太少太小，在相當程度上還得靠「碰運氣」，所以人們稱這個方法為「鳥槍法」或「散彈槍」實驗法。
一、用限制酶切下目的片段的大片段InsertDNA，並用Agarose凝膠電泳進行回收。
二、對回收的大片段DNA用物理方法（如超聲波等）進行切斷處理，然後用T4DNAPolymerase對小片段DNA進行末端平滑化。
三、進行Agarose電泳，切膠回收1kbp～2kbp的小片段DNA。然後用BcaBestDNAPolymerase在DNA的3'端加上一個A鹼基。
四、把加上A-tail的DNA片段連入T-Vector中，然後轉化，挑選克隆。
五、對陽性克隆（含1kbp～2kbpInsert）進行DNA測序。
六、對數據進行編輯，最後連成一條大片段的DNA序列。

E. 怎樣進行PCR進行病毒的核酸檢測和基因測序，全基因測序

一種全新的DNA甲基化研究方法——Pyrosequencing技術 DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，它是由DNA甲基轉移酶（DNA methyl-transferase, Dnmt）催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉變為5-甲基胞嘧啶（mC）的一種反應，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化學性修飾鹼基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位點，它在基因組中呈不均勻分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的區域，在哺乳動物中mC約佔C總量的2－7％。一般說來，DNA的甲基化會抑制基因的表達。DNA的甲基化對維持染色體的結構、X染色體的失活、基因印記和腫瘤的發生發展都起重要的作用。 CpG雙核苷酸在人類基因組中的分布很不均一，而在基因組的某些區段，CpG保持或高於正常概率，這些區段被稱作CpG島。CpG島主要位於基因的啟動子和第一外顯子區域，約有60％以上基因的啟動子含有CpG島。 CpG甲基化的研究在腫瘤的研究中有著非常主要的地位。通過基因啟動子區及附近區域CpG島胞嘧啶的甲基化可以在轉錄水平調節基因的表達，從而引起相應基因沉默，去甲基化又可恢復其表達。DNA甲基化在生理情況下就參與了控制基因的時空表達，在腫瘤發生時，腫瘤細胞全基因組低甲基化是一個重要特徵。腫瘤細胞基因組甲基化的程度與正常細胞相比僅為20-60% , 同時伴有局部區域基因的高甲基化,包括腫瘤抑制基因、抑制腫瘤轉移和浸潤的基因、細胞周期調節基因、DNA修復基因、血管形成抑制基因等。但是目前研究手段的局限，限制了DNA甲基化的廣泛研究。 近年來，研究者不斷探索定性及定量檢測單個或多個甲基化位點的方法，但由於甲基化多態性區域存在的密度很高，所以對於延伸反應其引物的位置很難設計。Pyrosequencing技術作為一種新的序列分析技術，能夠快速地檢測甲基化的頻率，對樣品中的甲基化位點進行定性及定量檢測，為甲基化研究提供了新的途徑。 從原理上來看，Pyrosequencing是一種通過合成方法進行序列分析的方法，它通過核苷酸和模板結合後釋放的焦磷酸引發酶級聯反應，促使熒光素發光並進行檢測。這項技術曾經被用作單核苷酸多態性（SNP）的基因型和單倍型的檢測，以及細菌和病毒的鑒定和分型研究。這項技術的一個主要特點是在Pyrogarm™軟體上顯示的峰值高度來自於序列分析的原始數據，通過峰值的高度可以精確的檢測混合DNA模板中等位基因的頻率。 目前甲基化研究方面，很多甲基化定量分析的報道採用亞硫酸氫鹽處理甲基化樣本，並用混合的PCR產物 作為校正。其主要原理是：亞硫酸氫鹽可以將沒有甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶，而在適當的實驗條件下甲基化的胞嘧啶保持不變。因而，用它處理樣本後，再進行PCR擴增，甲基化的位點可以被當作一個C/T的SNP來處理，它的基因頻率為0－100％。在此，我們給大家介紹一個研究人員使用Pyrosequencing技術分析並精確定量DNA甲基化水平的例子。 研究者在一個Pyrosequencing反應中同時檢測了6個甲基化位點。這種方法同樣可以用於石蠟包埋的組織，並且具有較高的重復性和精確性。實驗選擇谷胱甘肽-S-轉移酶π（GSTP1）轉錄啟動位點的CpG島進行檢測。這些位點在正常前列腺組織中是非甲基化的，而在腫瘤樣本中高甲基化。通過PCR擴增一個包含17個甲基化多態位點140bp的片段，並用4個測序引物研究其中15個位點（Table 1）。使用在線的SNP測序引物設計軟體（Pyrosequencing AB）設計測序引物，其中一些甲基化多態性位點用最可能的鹼基所代替，以減少計算的數量。再通過人工檢測測序引物可能存在的錯配。此外，同時在PSQ 96MA DNA分析儀上運行空白對照，扣除由測序引物、生物素標記的引物或是模板引起的背景。 PCR引物設計完全與模板相匹配，不覆蓋任何甲基化多態性區域。使用10ng亞硫酸氫鹽轉化的DNA樣本或是10 fmol純化的PCR產物，10 pmol 正向（5』-GTGATTTAGTATTGG-3』）和反向（5』-biotin-AACTCTAAACCCCATC-3』）引物擴增GSTP1轉錄啟動位點的基因片段，擴增片段長度為144bp。反應體系為60 mM Tris-SO4, pH 8.9, 18 mM (NH4)2SO4, 1 mM MgSO4, 200 μM dNTPs，以及3 U Platinum Taq DNA高保真聚合酶，終體積為50μL。PCR循環設置：首先在95℃下變性4分鍾，然後在95℃ 30S，50℃ 45S以及72℃ 20S條件下重復50個循環，最後一步延伸步驟在72℃下4分鍾，中止反應。PCR反應在Eppendorf的Mastercycler 96 哺乳動物基因組中，DNA甲基化是指CpG二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子被甲基化. DNA甲基化是一種基因外修飾，不改變DNA的一級結構; 他在細胞正常發育、基因表達模式以及基因組穩定性中起著至關重要的作用. 全基因組低甲基化，維持甲基化模式酶的調節失控和正常非甲基化CpG島的高甲基化是人類腫瘤中普遍存在的現象. DNA高甲基化是導致抑癌基因失活的又一個機制.

F. 迄今為止，我國檢測新冠病毒有哪些方法

1、熒光PCR法。PCR法指的是聚合酶鏈式反應，能將微量的DNA大幅增加。熒光PCR檢測的原理為——隨著PCR的進行，反應產物不斷累積，熒光信號強度也等比例增加。最後通過熒光強度變化監測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。
2、聯合探針錨定聚合測序法。這種檢測主要是用專門的儀器檢測測序載片上DNA納米球攜帶的基因序列。這種檢測的靈敏度高，不容易漏診，但結果也容易受多種因素的影響而不準。
3、恆溫擴增晶元法。檢測原理是基於核酸之間的互補結合特性開發的一種檢測方式，能夠用於定性或定量測量存在於生物體內的核酸。
4、病毒抗體檢測。抗體檢測試劑是檢測血清中由病毒進入人體後刺激人體產生的IgM或IgG抗體，IgM抗體出現較早，IgG抗體出現較晚。
5、膠體金法。膠體金法是用膠體金試紙進行檢測，也就是常說的快速檢測試紙。這種試紙經過特殊標記，上面有孔，用於滴入受檢者的血清樣本。
6、磁微粒化學發光法。化學發光法是一種高度敏感的免疫檢測，凡具有抗原性的物質都可以用這種方法測定。

G. 如何破解新冠病毒基因組全長序列

正如如大家所知，高通量測序在新冠病毒的鑒定及診斷中可以和RT-PCR法形成互補，這樣不僅能夠提高陽性檢出率，而且還能進行並發檢測，以提供更多的可能感染的病原信息。其中更為重要的是，高通量測序還可以對病毒的序列進行組裝，以獲得病毒的全長基因組信息，這樣為追溯病毒的來源、監測病毒的變異趨勢以及探究致病機理提供了研究基礎。

通過病原鑒定系統對COVID-19序列進行數據分析並採用IDBA的方法完成基因的拼接。

H. 目前商業化應用的常見核酸測序方法有哪些

鼻咽拭子檢測、口咽拭子檢測和、下呼吸道分泌物檢測。
1、鼻咽拭子檢測、口咽拭子檢測和、下呼吸道分泌物檢測是截止2022年5月26日我國國家確認的最常見的商業化的核酸測序方法。
2、鼻咽拭子檢測是將采樣工具通過鼻腔進入，採集鼻咽部的標本進行核酸病毒檢測，采樣工具可在葯店買到。
3、口咽拭子檢測則是通過口腔進入的方法採集口咽部的標本，采樣工具可在葯店買到。
4、呼吸道分泌物檢測是通過採集患者的痰液或通過支氣管鏡採集患者下呼吸道分泌物標本進行核酸病毒檢測，其陽性檢出率要高於鼻咽拭子檢測和口咽拭子檢測方法。

I. 如何有效地對病毒宏基因組測序的數據進行分析

得出數據之後。
用dps 或者excel載入宏都可以進行分析
你們統計學的上機操作應該學過，再翻翻
那本教材