實時定量pcr技術有幾種分析方法

⑴ 實時熒光定量PCR技術原理是什麼

聚合酶鏈式反應 ( PCR) 可對特定核苷酸片斷進行指數級的擴增 .在擴增反應結束之後,我們可以通過凝膠電泳的方法對擴增產物進行定性的分析,也可以通過 放射性核素摻入標記後的光密度掃描來進行定量的分析 .無論定性還是定量分析,分析的都是 PCR 終產物.但是在許多情況下,我們所感興趣的是未經 PCR 信號放大之前的起始模板量.例如我們想知道某一轉基因動植物轉基因的拷貝數或者某一特定基因在特定組織中的表達量.在這種需求下熒光定量 PCR 技術應運而生.所謂的實時熒光定量 PCR 就是 通過對 PCR 擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析.在實時熒光定量 PCR 反應中,引入了一種熒光化學物質,隨著 PCR 反應的進行,PCR 反應產物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加.每經過一個循環,收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖.

⑵ 如何對某個微生物菌種進行實時定量pcr

Real2time PCR)技術 ,是在 PCR反應體系中加入熒光基團 ,利用熒光信號累積實時監測整個 PCR進程 ,最後通過標准曲線對未知模板進行定量分析的方法。該技術於 1996年由美國 AppliedBiosystems公司推出 ,通過對 PCR過程的實時監控 ,可專一、 靈敏、 快速、 可重復地精確定量起始模板濃度 ,真正實現了 PCR從定性到定量的飛躍。熒光定量 PCR技術以其獨特的優勢得到快速發展 ,這項技術已經廣泛應用於臨床和生命科學研究的各個領域。現就其在臨床微生物檢測方面作一概述。1 熒光定量 PCR在檢測和鑒定中的應用1 . 1 在病毒檢測和鑒定中的應用目前 ,熒光定量 PCR已用於多種病毒的檢測。Malmstrom等術對 185份不同基因型混合到一起的 B型肝炎病毒樣本進行檢測 ,能檢測到所有的基因型 ,以此證明該方法的高精確度。OkamotoTaqMan技術平台。雷永良等對 172例臨床診斷手足口病患者的 324份標本進行人腸道病毒、 柯薩奇病毒 A組 16型和腸道病毒 EV71型核酸特異性的反轉錄檢測 ,同時進行熒光定量 PCR和 EL ISA法平行檢測 ,熒光定量 PCR方法的結果與反轉錄檢測一致 ,兩者的靈敏度均高於 EL ISA法 ,與傳統的 RT2PCR和 EL ISA相比 ,實時熒光定量 PCR檢測標本快捷 ,特異性強、 靈敏度高 ,檢測手足口病腸道病毒准確高效 ,值得推廣。秦萌等定量 RT2PCR 檢測方法 ,實現了同時檢測新甲型[1]採用四重 TaqMan熒光定量 PCR技[2]建立了風疹病毒的[3 ]設計的一種四重熒光 2011年 第 2期李春娟等 :熒光定量 PCR技術在臨床微生物檢測中的應用H1N1流感病毒、 人季節性 H1N1流感病毒和人季節性 H3N2流感病毒 ,該方法特異性強 ,靈敏度高 ,最低可檢測至 20個拷貝的 RNA。譚耀駒等[4]以人 3型腺病毒感染的細胞和常見的呼吸道消化道感染的病原體為研究對象 ,建立了人 3型腺病毒 TaqMan熒光定量 PCR檢測方法 , TCI D50細胞培養液中病毒核酸最低檢出稀釋度是 1026,且呼吸道和消化道感染常見的病原體未出現交叉反應。白志軍登革熱病毒 (DV) 1型 5′設計一套特異性引物和 TaqMan探針進行熒光定量PCR快速監測並應用於臨床診斷 ,在登革熱的早期診斷中有較高的敏感性、 特異性和重復性 ,可作為DV1的快速診斷方法。其他病毒如 A /C/E型肝炎病毒 DNA[2]、 EB 病毒[13 ]等熒光定量方法均有報道和建立。WHO 於2009年 4月 28日起草了 CDC protocol of Real2timeRT2PCR for influenza A (H1N1) ,詳細介紹了 TaqMan技術進行豬流感病毒檢測和分型的操作規程1 . 2 在細菌檢測和鑒定中的應用近年來 ,由於傳統方法鑒別細菌的種種不足 ,Real2time PCR 技術已應用於多種細菌的檢測。Chandran等了檢測結合分枝桿菌的方法 ,與傳統的塗片染色法和培養法相比 , 其靈敏度為 97. 2% , 特異性達100% ,均高於兩種傳統方法。Tatavarthy等沙門氏菌的 ompF基因進行 Real2time PCR技術檢測 ,此方法能檢測沙門氏菌屬的所有種型 ,特異性為100%。

⑶ 實時定量pcr原理

實時定量pcr原理通常指實時熒光定量PCR原理，即：在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的變化，實時檢測PCR擴增反應中每次循環擴增產物量的變化，通過循環閾值和標准曲線的分析對標本中起始模板拷貝數進行定量分析。
Real-timePCR是在PCR擴增過程中，通過熒光信號，對PCR進程進行實時檢測。由於在PCR擴增的指數時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關系，所以成為定量的依據。

⑷ 目前的定量pcr方法基本上可歸為哪幾種

1、外參法+終產物分析。外參法是指樣本與陽性參照在兩個反應容器內反應。
2、內參法+終產物分析。謂「內參法」是指樣本與陽性參照在一個反應容器內反應。
3、外標法+過程監測。這種類型監測擴增效率，陽性樣本定量准，但是無法排除假陰結果。
4、內參法+過程監測。由於樣本與陽性參照在一個容器內反應，用同樣的Taq酶和反應參與物，存在竟爭性抑制。
5、外標法+過程監測+內對照。這種類型監測擴增效率，陽性樣本定量准，同時排除假陰結果。上述是定量pcr方法的五種類型。

⑸ 實時定量PCR的結果是怎樣分析的

1、如果有標准曲線，按照標准曲線計算。

2、一般都是相對量，則用delta delta CT方法來計算。

3、舉例如下：對照組基因A的CT值為20， 內參（比如βactin)CT值15。實驗組基因A CT值18，內參CT值14。

4、首先算加樣量：delta CT=15-14=1。2的1次方是2。也就是說實驗組的加樣量是對照組的2倍。基因A: delta CT=20-18=2。2的2次方是4。也就是說基因A的量在實驗組是對照組的4倍。但是由於加樣量是2倍，所以4處以2=2，最後的相對量是2倍。

5、幾點注意：必須確定擴增的特異性，只有相同目標的CT值才能相減（擴增效率有可能不同），2的某次方只是理論值，實際擴增效率低於2，最好不用Syber Green。

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PCR原理：

1、PCR技術的基本原理類似於DNA的天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

2、PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：

①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

②模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模板-引物結合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。每完成一個循環需2～4分鍾，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

參考資料來源：網路--PCR反應

⑹ 實時熒光定量PCR的結果該怎樣分析

1、如果有標准曲線，按照標准曲線計算；

2、一般都是相對量，則用delta delta CT方法來計算；

3、引物或探針降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性；

4、模板量不足：對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起；

5、看CT值是分析熒光定量PCR最直觀的一個數據，CT值一般在35左右就失去參考價值了，平時我們實驗室用BIODAI-PCR熒光定量法測得的擴增曲線的起跳值基本在30左右。

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PVR的循環參數：

1、預變性；

模板DNA完全變性與PCR酶的完全激活對PCR能否成功至關重要，加熱時間參考試劑說明書。

2、變性步驟；

循環中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性，可能的情況下可縮短該步驟時間。變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴增失敗。

3、引物退火；

退火溫度需要從多方面去決定，一般根據引物的Tm值為參考，根據擴增的長度適當下調作為退火溫度。然後在此次實驗基礎上做出預估。退火溫度對PCR的特異性有較大影響。

4、引物延伸；

引物延伸一般在72℃進行（Taq酶最適溫度）。但在擴增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略延伸時間隨擴增片段長短而定，一般推薦在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設定為1min/kbp。

5、循環數；

大多數PCR含25-35循環，過多易產生非特異擴增。

6、最後延伸；

在最後一個循環後，反應在72℃維持10-30分鍾．使引物延伸完全，並使單鏈產物退火成雙鏈。

⑺ 實時熒光定量PCR——RT-QPCR

目前實時熒光定量PCR已得到廣泛應用，如：擴增特異性分析、基因定量分析、基因分型、SNP分析等......熒光定量PCR最常用的方法是DNA結合染料SYBR Green I 的非特異性方法和Taqman水解探針的特異性方法

SYBR Green I 的非特異性方法(試劑盒：LightCycler 480 SYBR Green I Master）

SYBR Green I是一種結合於所有dsDNA 雙螺旋 小溝區域的具有綠色 激發波長 的染料。在游離狀態下，SYBR Green I發出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結合後，熒光大大增強。因此，SYBR Green I的熒光信號強度與雙鏈DNA的數量相關，可以根據熒光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數量。

一、實驗前准備：

實驗試劑及耗材：

試劑：特異性PCR引物，新鮮提取備用的總RNA

試劑盒:Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、LightCycler 480 SYBR Green I Master

1號管包含：

熱啟動Taq DNA Polymerase、反應緩沖液、dNTP mix、SYBR Green I染料、MgCI2

儀器及耗材：

羅氏LightCycler 480全自動實時定量PCR儀以及配套使用的48或96孔板；Thermo Scientific Arktik PCR儀、F1單道移液器、冰盒、QSP盒裝吸頭等

正式實驗開始前，冰上解凍各個試劑【注意：SYBR Green I Master 需要避光放置】

二、反轉錄

實驗操作時注意：所有RNA相關的操作均需要佩戴手套，防止RNase污染。嚴格按照試劑盒使用說明進行相關操作。

按照體系配方在冰上的Rnasefree的滅菌PCR管中配置Templateprimer mix，總體系13ul。本實驗是聯合使用anchored oligo dT引物和隨機六聚體引物進行的反轉錄。

(1)配製NTC對照：（總13ul）

水——10ul

oligo dT引物 ——1ul

隨機六聚體引物——2ul

混勻

（2）配製1、2、3、4號管：（總13ul）

總RNA（s1、s2、s3、s4）——1ul

oligo dT引物——1ul

隨機六聚體引物——2ul

水——9ul

混勻

【Note：可將總RNA的模板量適當調整至10ng—5ug，mRNA調整至1—100ng。若RNA樣品濃度較低，則可加入10ug/ml的MS2 RNA 來穩定模板RNA】

（3）將配好的反應mix在PCR儀中65℃變性10min，可有效減少RNA的二級結構。加熱後，迅速置於冰上製冷，放置5min

（4）在反應Templateprimer mix中分別加入以下試劑：

配製總mix（除了RNA模板和引物）

5X反轉錄酶buffer——24ul（4ulX6管）

dNTP mix ——12ul（2ulX6管）

40U/ul RNase抑制劑——3ul（0.5ulX6管）

20U/ul反轉錄酶——3ul（0.5ulX6管）

mix總體積——42ul（7ulX6管）

若樣品數量多，先配製反應mix再分裝到各個反應管，小心吹打混勻，切勿渦旋震盪。混勻後於微型離心機上離心，使樣品和離心管落至管底。

將離心管放置PCR儀中，根據使用的引物和目標RNA的長度進行程序設置：

25℃ 10min

55℃ 30min

85℃ 5min

最後置於冰上停止反應。

此反應產物可於2℃—8℃存放1—2h，或在﹣15℃至﹣25℃下存放更長時間。cDNA產物無需進行純化即可用於後續的PCR反應。20ul的PCR反應體系可取2—5ulcDNA反應產物進行擴增。此試劑盒中的反轉錄酶具有RNase H 活性，可以在cDNA合成之後去除RNA模板，減少其對後續PCR的影響

SYBR Green 反應體系的配製：

使用LightCycler 480 SYBR Green I Master使用進行基礎的絕對定量分析。

實驗設計：5個標准樣品（包含1個空白對照）

                    5個反轉錄樣品（包含1個NTC對照【Negative Template Control縮寫】）

由於樣本數較多，如下配置：

不含模板的總體系（594ul）—分裝為10管（每管55ul）—每管加入各自的模板（6ul）—每個樣分裝為3個復管（每管20ul）

按照體系配方配製：

2x Master mix （綠色蓋）——330ul（10ulX33）

10x Primer mix  —— 66ul（2ulX33）

PCR級別水（無色蓋）——198ul（6ulX33 ）

總體積 ——594ul

用移液槍輕柔吹打混勻，然後分裝為10管，每管55ul。

標准對照組:在各個管中分別加入各個樣品對應的調整好濃度的cDNA，空白對照加入6ul水代替模板，其餘加入6ul已經逐級稀釋好的標量模板。

反轉錄樣品組:分別加入6ul濃度調整好的模板DNA，包含NTC。

混勻後將每個樣按照20ul/孔分裝至96孔板中，用封口膜蓋好96孔板。將多孔板置於合適的離心機中室溫1500g配平離心2min，然後將准備好的96孔板放入羅氏LightCycler 480中

PCR程序設置與運行：

（1）雙擊打開LightCycler 480 Software release1.5.0SP4中登錄，自動進入軟體界面。

（2）點擊New Experiment

（3）設置反應體積（對於96孔板，反應體積為10ul—100ul）此次設置20ul

（4）在Program中輸入反應名稱preincubation，預備性設置一個循環，無需進行熒光收集

（5）點擊增加按鈕，輸入amplification，定義擴增循環的次數為445次，選擇熒光的收集功能Quantification

（6）設定PCR擴增循環的溫度與時間為95℃10s

（7）點擊增加按鈕，設定退火溫度為60℃10s

【6.7兩步 Analysis Mode默認None】

（8）設置延伸溫度和時間為72℃20s Acquisition Mode選擇Single

（9）設置溶解曲線，在program新的一行中輸入Melting curve，Acquisition Mode選擇Melting Curves 95℃ 5s，新增設置溫度，再點擊增加按鈕，65℃ 1min 以上兩步Acquisition Mode默認選擇None

（10）點擊增加按鈕，95℃ Acquisition Mode選擇Continuous ，其他設置無需改動

（11）設置保溫的過程cooling，1個循環，無需熒光，40℃ 1min

（12）設置完成後，點擊右方保存按鈕，保存設置的程序

（13）點擊start run，開始運行PCR反應，此時可在軟體上實時監測樣品擴增情況。

樣品編輯

（1）實驗結束，點擊Sample editor，進入樣本編輯程序

（2）在select Workflow中選擇ABs Quant進行絕對定量，根據樣本在板中的排布方式進行樣本編輯，設置陰性對照、空白對照、標准品等，在SELECT Sample中選擇樣品孔

（3）在Sample Name中輸入被選擇樣品名稱

（4）最後點擊make replicates設置復孔

（5）標准品設置時，需填寫拷貝數、稀釋倍數、初始濃度即可

（6）編輯好樣品後，可進行數據分析，如有需要，也可進行組間分析

結果分析

（1）點擊左下方的SUM，將顯示出所有信息，包括設置的反應程序、實驗結果分析等。

（2）點擊Analysis，可對已有的數據進行細致的分析

（3）點擊Abs Quant/2nd DerivativeMax，彈出Create new analysis窗口

（4）在Subset中選擇分析樣品的區域即可出現分析圖，相應樣品的擴增曲線

（5）Standard Curve是根據標准品得出的標准曲線，左側有擴增效率、斜率、截距、線性關系以及錯誤率 （一般error值越小，說明實驗准確率越高，擴增效率如果越接近「2」，說明這次的擴增反應越好）

（6）在數據表格，可顯示樣本的Cp值，以及相應的樣本濃度值，按復孔進行數據統計，顯示Cp平均值、方差，濃度的平均值以及方差

⑻ 實時熒光定量 PCR

    實時熒光定量 PCR ，簡稱 RT-QPCR, 屬於 Q-PCR 的一種，目前該技術已得到廣泛應用，如：擴增特異性分析、基因定量分析、基因分型、 SNP 分析等。熒光定量 PCR 常用的方法是 DNA 結合染料 SYBR GreenⅠ的非特異性方法。

    SYBR Green I 是一種結合於所有 dsDNA 雙螺旋小溝區域的具有綠色激發波長的熒光染料， 可與所有的各種序列的雙鏈 DNA 分子結合。 在 游離狀態 下，SYBR Green I 發出 微弱的熒光 ，但 一旦與雙鏈 DNA 結合 ， 嵌入至 dsDNA， 熒光大大增強 。

    因此， SYBR Green I 的熒光信號強度與雙鏈 DNA 的數量相關， PCR 擴增不同時期中， dsDNA 含量不同， SYBR Green I 熒光信號強度不同。 可以根據熒光信號檢測出 PCR 體系存在的雙鏈 DNA 數量， 並可根據對照進行相關的計算和分析。

實驗開始前，需准備好實驗所需的各種試劑和耗材。

試劑包括：特異性 PCR 引物，新鮮提取備用的總 RNA。

使用的試劑盒有：用於合成 cDNA 第一鏈的羅氏試劑盒 Transcriptor FirstStrand cDNA Synthesis Kit，包含了 cDNA 反應所需要的所有實驗組分以及相關的正對照反應組分。

配套 LightCycler® 480 使用的試劑盒 LightCycler® 480 SYBR Green I Master，包含了 PCR 所需的各種實驗組分，如 1 號管中包含熱啟動 Taq DNA Polymerase及反應緩沖液， dNTP mix， SYBR Green I 染料和 MgCl2正式試驗開始前，冰上解凍各個試劑及試劑盒組分，置於冰上待用。 注意：SYBR Green I Master 需避光放置。

所需儀器與耗材有：羅氏 LightCycler® 480 全自動實時定量 PCR 儀以及配套使用的 96 或 384 多孔板，透明封板膜等一次性耗材。賽默飛公司提供的 Thermo Scientific Arktik PCR 儀、單道移液器、 Nunc 冰盒及 QSP 盒裝吸頭等。

接下來進入實驗部分，本實驗操作流程是：首先用新鮮提取的 RNA 反轉錄合成 cDNA 第一鏈，然後進行實時熒光定量 PCR，其中包括： SYBR Green 反應體系的配置； PCR 程序設置； 運行 PCR 實驗，樣品編輯和結果分析。

首先是反轉錄合成 cDNA 第一鏈：

實驗操作時注意：所有 RNA 相關的操作均要佩戴手套，防止 RNase 污染。相關操作嚴格按照試劑盒使用說明進行相關操作。

按照體系配方在冰上的 Rnase free 的滅菌 PCR 管中配置 Template primer mix，總體系 13μl，本實驗是聯合使用 anchored oligo dT 引物和隨機六聚體引物進行的反轉錄。 先配置 NTC 對照，加入 9 號管水 10μl、 6 號管的 50mM oligo dT 引物 1μl、 5 號管的 0.6mM 隨機六聚體引物 2μl，混勻。 然後進行樣品一號管的體系配置， 依次加入 1μl 已調整濃度的總 RNA、 1μl oligo dT 引物、 2μl 隨機六聚體引物、最後加 9μl 水補充至總體積 13μl，混勻。其他樣品管，參照 1 號管的配置方法，依次加好反應體系。注意：可將總 RNA的模板量適當調整至 10ng-5μg，mRNA調整至 1-100ng。

若 RNA 樣品濃度較低，則可加入 10μg/ml 的 MS2 RNA 來穩定模板 RNA。

將配好的反應 mix 在 PCR 儀中 65℃變性 10min，可有效減少 RNA 的二級結構。加熱後迅速置於冰上驟冷，放置 5min。在反應 Template primer mix 中按體系配方順序，依次加入以下試劑： 2 號管的 5×反轉錄酶 buffer， 4 號管 dNTP mix， 3 號管 40 U/μl 的 RNase 抑制劑， 1 號管 20 U/μl 的反轉錄酶，最終體積為 20μl。

若樣品數較多，先配置反應 mix 再分裝，小心吸打混合，切勿渦旋振盪。 混勻後於瞬時離心機上短暫離心，使樣品和反應液落至離心管底部。將離心管放置 PCR 中，根據使用的引物以及目標 mRNA 的片段長度進行程序設置。本實驗反應溫度和時間設置為： 25℃， 10min， 55℃反應 30min。反應完畢後，於 85℃下加熱 5min 滅活反轉錄酶， 再置於冰上停止反應。此反應產物可於 2-8℃存放 1-2h，或在-15 至-25℃下存放更長時間。

cDNA 產物無需進行純化即可用於後續的 PCR 反應。 20μl 的 PCR 反應體系可取 2-5μl cDNA 反應產物進行擴增。此試劑盒中的反轉錄酶具有 RNase H 活性，可以在 cDNA 合成之後去除 RNA 模版，減少其對後續 PCR 的影響。

本部分實驗，我們選用羅氏的 SYBR Green I Master 試劑盒進行基礎的絕對定量分析。

本實驗共設置 5 個標准樣品，包含 1 個標記為 0 的空白對照， 5 個反轉錄樣品，包含 NTC 對照，由於樣品數較多，先配製不含模版的總體系，再分裝為10管，加入各個樣品的模板後，再將每個樣品分裝為 3 個復孔。

按照體系配方分別加入綠色蓋子的 2×Master Mix， 10x Primer 上下游引物，PCR 級別水。 總體系配好後，在用移液槍輕柔吸打均勻，然後分裝為 10 管，每管 55μl。往 10 管中分別加入各個樣品對應的調整好濃度的 cDNA。STD 零加入 6μl 水代替模板，其餘 STD 分別加入 6μl 已經逐級稀釋好的標樣模板。 反轉錄樣品分別加入 6μl 濃度調整好的模板 DNA， 包含 NTC。混勻，然後將每個樣按 20μl 每孔分裝至 96 孔板中。用封孔膜蓋好 96 孔板，將多孔板置於合適的離心機中 1500×g 配平離心 2min 將准備好的 96 孔板放置在LightCycler® 480 設備中。

雙擊打開 LightCycler® 480 的 1.5 軟體並登陸，自動進入軟體界面，點擊 new experiment,在 Detection Format 選項中選擇 SYBR Green I 模式, 點擊 OK 完成檢測通道的設定,接下來設置反應體積，對於 96 模塊，反應體系為 10μl-100μl 之間，本實驗是設定 20μl 的反應體系。

在 Program Name 中輸入反應名稱 pre incubation，預變性設定 1 個循環，無需進行熒光的收集，執行的溫度和時間設定為 95℃ 10min，視圖會根據設定進行實時的調整。

點擊增加按鈕，輸入 Amplification，定義擴增循環的次數為 45 次，並選擇熒光的收集功能 Quantification，然後設定 PCR 擴增循環的溫度與時間為 95℃ 10s，點擊增加按鈕，設定退火溫度和時間為 60℃ 10s，以上兩步 Acquisition Mode 都默認選擇 None，繼續點擊增加按鈕，設置延伸溫度和時間為 72℃ 20s，Acquisition Mode 選擇 Single， Ramp Rate 均按自動調整值，無需再設置。

設置溶解曲線，在 Program 中的新的一行中輸入 Melting Curves， 1 個循環數， Analysis Mode 選擇 Melting Curves，時間和溫度設置為 95℃ 5s， 點擊增加按鈕，新增設置溫度和時間為 65℃ 1min，以上兩步 Acquisition Mode 都默認選擇 None。點擊增加按鈕，新增設置溫度為 95℃，Acquisition Mode 選擇 Continuous,其他設置無需改動。

設置保溫的過程 Cooling，只需 1 個循環，無需收集熒光，設定溫度和時間為 40℃、 1min。設置完成後點擊右邊的保存按鈕保存設置的程序。此時整個 PCR的循環體系、溫度的設置已經設定完畢。

點擊 Start run 開始運行 PCR 反應，此時可在軟體上實時監測樣品擴增情況。

實驗結束，點擊 Sample Editor，進入樣本編輯區。

Select Workflow 中選擇 Abs Quant。根據樣本在板中排布的方式進行樣本編輯。設置陰性對照、空白對照、標准品以及未知樣品等。

在 Select Sample 中，選中需要設置的樣品孔。在下一欄中的 Sample Name 輸入被選擇樣品組的名稱，並在 Sample Type 中選擇樣品組的類型，最後點擊 Make Replicates 設置復孔。標准品設置時，需填寫拷貝數，只需填寫好稀釋倍數，初始濃度即可。 編輯好樣品後，即可進行數據分析。如有需要，也可進行子集編輯。

樣品編輯好後，可進行實驗結果分析。

點擊左邊欄下方的 sum 按鈕，相應出現實驗的所有信息，包括：設計的反應程序，實驗結果分析等。

點擊 analysis，可以根據樣品已有的數據進行細致准確地分析。

點擊 Abs Quant second derivative max，彈出 create new analysis 窗口，在 Subset 選項中選擇分析樣品的分布區域，點擊確定，即可出現分析圖：相應樣品的擴增曲線。

Standard Curve 是根據標准品得出的標准曲線，曲線左側標有擴增效率、斜率、截距、線性關系、以及錯誤率。一般「Error」值越小，說明實驗的准確率越高。

擴增效率如果越接近「2」，說明這次的擴增反應越好。

在數據表格，可顯示單個樣本的 Cp 值，以及相應的樣本濃度值。

按復孔進行數據統計，顯示 Cp 平均值，方差，濃度的平均值以及方差。