色譜分析方法及儀器校準的討論

A. 高效液相色譜儀的使用和原理分析

高效液相色譜儀(HPLC)是分析實驗室常用的測試儀器之一，其應用越來越廣泛。此種儀器在使用過程中，難免會出現各種各樣的問題，並將直接影響到所測數據的准確性和儀器的正常工作。操作者如果能了解故障的成因，即可清楚預防和排除這些故障的方法，就可正確地使用儀器並最大限度地發揮儀器的性能。今天我們要從以下幾個方面和您分享下在使用高效液相色譜儀中需注意的幾個問題。

一、使用試管的問題

1、試管的潔凈問題。

高效液相色譜分析法是一個很靈敏的分析方法，如果因使用不潔凈的試管，便會影響試驗結果的准確性。例如，在用甲醇作溶劑來溶解樣品時，所用的小試管是用橡膠塞來做蓋子的，因此，在每次進樣時，都有一個保留時間固定的干擾峰存在，後經證實，此干擾峰是由甲醇浸泡橡膠塞而溶下的組分所產生，換用玻璃試管後，干擾峰消除。

2、塑料試管的溶解問題。

近年來，一次性塑料試管給試驗人員帶來了極大的方便，但是，在使用過程中一定要注意有機溶劑對試管的溶解現象，在利用此種試管提取樣品時，有些有機溶劑(如氯仿等)對管壁有溶解現象，這些被溶解下來的物質有時也能在檢測器上產生信號，從而干擾樣品的測定。這時，可用相同的實驗條件先行試驗一下，看看不含被抽提物時，提取液在檢測器上能否產生干擾信號，如確有干擾信號存在，就只能換用耐有機溶劑的玻璃試管了。

3、被測樣品在試管壁上的吸附問題。

這個問題也應引起注意，否則也會影響測試結果的准確性，在治療葯物監測(Therapeutic Drug Monitoring,TDM)中，有些被測葯物如阿米替林，丙咪嗪等易吸附在玻璃試管的管壁上，因此，操作中宜採用聚丙烯管，為防止提取中吸附現象的發生，可採用0.5%的已二胺已烷液做為提取劑，可有效地防止吸附。

二、操作進樣閥的問題

目前，在分析型高效液相色譜儀中常用的進樣閥是7725型進樣閥，其內部的六通閥結構使進樣操作非常方便，但是，如果使用不當，也會帶來問題。例如，在高效液相色譜法的試驗過程中，有時會有異常色譜峰的出現以及重現性不好的問題，這主要是由於操作方法不當所引起，要想解決此類問題，需從以下幾個方面入手。

1、進樣量的控制。

用進樣閥來進樣時，閥內的樣品環是定量的，(一般分析型進樣閥的樣品環體積為20ul)，由於進樣時，注射到進樣閥內的樣品溶液在樣品環的管路中有徑向的速度梯度(即管軸處比管壁處的液流速度快)。因此，要想使樣品環中充滿樣品溶液，從而使用進樣閥來准確地定量，則必須使進樣量大於樣品環體積的2倍。如果用注射器來控制進樣量，則最大隻能注射樣品環體積1/2的量，這樣才能防止部分樣品由溢流管溢出從而導致定量分析的誤差。

2、進樣閥的清潔問題。

如果樣品環中有上次進樣時樣品的殘留，必然會污染下次注射進的樣品，為防止這種現象的發生，應按下列步驟操作：a.進樣閥有2個位置，INJECT和LOAD。首先在LOAD位置時，以注射器將流動相注入進樣閥內清洗幾次，每次用量大約40ul；b.然後將進樣閥板手扳至INJECT位置時，再以流動相清洗幾次，每次用量還是40ul；c.最後，再將樣品注射到進樣閥里。

按照上述的步驟操作，可以避免由進樣閥引起的污染，從而使干擾峰消除並提高分析結果的准確性。

3、進樣閥溢流管的堵塞。

有時，進樣閥的溢流管會發生堵塞現象，向進樣閥內注射樣品時，注射針推不動。此故障是由於溢流管的堵塞所致。堵塞的原因多半是由於溶解樣品的流動相用的是鹽溶液，而其中的鹽在溢流管的排空埠處結晶所致。此時，可用小燒杯盛少量蒸餾水對溢流管口稍加浸泡，埠處鹽的結晶就能被溶解掉，故障排除。如能在每次進樣完成之後，用蒸餾水反復沖洗至溢流管中的鹽分全部沖出，則可避免此故障的發生。

三、流動相(MOBLLE PHASE)的問題

甲醇和乙腈在高效液相色譜分析法中常常被用來配製流動相。高效液相色譜法中常用的試劑最好是高等級的專用試劑，如色譜純試劑。在要求不太嚴格時，優級純甚至分析純的試劑也能用。高效液相色譜分析法中常用的是紫外檢測器，因此，從降低基線噪音和提高分析靈敏度上來考慮，應該使用紫外吸收小且雜質含量少的色譜純試劑。

1、流動相的過濾。

配製好的流動相在使用前一定要先用0.5um孔徑的微孔濾膜來過濾。這是因為溶液中含有很多肉眼難以發現的微小顆粒，如果不把它們濾除掉，就會堵塞泵口、柱頭上的過濾器，這樣就堵塞了流動相的正常通道，使色譜柱的阻力增加，柱壓升高，柱效下降。碰到這種情況時，要換用經過濾的流動相，並將堵塞的濾器拆下來浸泡在20%的硝酸水溶液中以超聲波清洗機清洗20分鍾，以除去濾片上的堵塞物。

2、流動相的脫氣。

流動相在使用前必須脫氣，以盡可能的除去溶解在流動相中的氣體，否則，這些氣體會使柱填料的性能降低，還能夠對檢測器的信號產生很大的干擾。脫氣有多種方法，如超聲脫氣、真空脫氣、氮氣脫氣等。真空脫氣法和氮氣流脫氣法是目前最常用的脫氣法。水和甲醇混合後會產生大量的氣泡，如果不脫氣就使用，氣泡就會進入色譜柱和檢測器，並將影響分析工作的正常進行。

四、色譜柱的使用和保養

色譜柱是高效液相色譜儀最主要的部件，被測物質能否被很好的分離和測定，色譜柱的性能起著決定性的作用。因此，在日常工作中，應特別注意色譜柱的正確使用和維修保養，以延長色譜柱的使用壽命。

1、使用預柱和保護柱。

預柱(pre-column)安裝於泵和進樣器之間，它給色譜柱中的流動相提供了完全的平衡，並防止了對柱填料有破壞作用的組分或污染物進入色譜柱。保護柱(guard column)可以阻擋能夠牢固地吸附於色譜柱上的組分進入色譜柱，保護柱應與色譜柱的填料相同。預柱和保護柱可以經常更換，而不需要經常更換色譜柱，這就延長了色譜柱的使用壽命。

2、防止氣體進入色譜柱。

有些色譜柱(如凝膠柱)是不允許氣泡進入的，否則將會使柱效降低甚至形成微小的難以驅除的氣室。因此，為了防止氣泡進入色譜柱，一定要使用經過脫氣的流動相，並且要嚴格按照下列步驟來安裝色譜柱。a.拆卸下色譜柱入口處的密封螺絲，觀察是否有溶劑滲出；b.如有溶劑滲出，即可將色譜柱接到管路上，以避免氣泡的進入；c.如無溶劑滲出時，表明色譜柱的此端已經進去空氣了，此時，可將色譜柱的出口端接到進樣閥上，以流動相來反方向沖洗色譜柱，以便將柱內的空氣排除。最好以0.2ml/min的小流量來沖色譜柱，如果溶劑的流速太快或者是壓力突然的上升都將會導致柱性能的降低；d.如果流出的溶劑里不含有氣泡，說明柱內的氣體已經被排出了，再將色譜柱以正確的方向接好，這樣氣泡就進不到色譜柱裡面了。

3、色譜柱的清洗。

為了不使被測物質和雜質停留在色譜柱中，在每次的樣品分析工作完成之後，都應及時地清洗色譜柱。首先要用對被測樣品洗脫能力強的溶劑來洗脫色譜柱，以分析工作中常用的反相色譜分析法為例，因其先流出的物質是極性大的物質，此時應用100%的甲醇或使用異丙純、四氫呋喃等極性稍弱的溶劑將吸附在柱內的極性小的物質洗脫下來，洗脫液的用量一般為柱體積的20倍即可。如果流動相是緩沖溶液，則應先用蒸餾水來沖洗色譜柱，以沖掉柱內的鹽，然後再用合適的溶劑來沖洗。

凝膠濾過色譜法(Gel Filtration Chromatography)中所使用的凝膠柱常用緩沖溶液做流動相，用完之後當然要用蒸餾水來沖洗。如果是連續操作，可以將緩沖溶液置於柱內過夜，但最好是維持小流速(＜0.5ml/min)以防止緩沖鹽的析出，如果流動相中含有鹵化物，即使是停一夜，也必須要用蒸餾水將色譜柱沖洗干凈，以防止它們對柱體的腐蝕。

4、色譜柱的存放。

如果色譜柱暫時不用，存放時要注意以下幾點：

a.幾天之內的短期放置，應先用溶劑沖洗好色譜柱(如凝膠柱則用蒸餾水來沖洗)，再把色譜柱的兩頭用密封螺絲密封好即可。

b.如果色譜柱長期不用，僅用上述方法來處理就不行了，這時應使用色譜柱使用說明書中所指明的溶劑來充滿色譜柱，反相柱一般使用甲醇，正相柱則可用正已烷或庚烷，而凝膠柱則不能用水了，因柱內如果有微生物的生長則會使柱效降低，此時應用0.05%的NaNs水溶液(防腐劑)來沖洗色譜柱，再將色譜柱封嚴。色譜柱長期放置時，一定要將色譜柱的兩端封嚴，以防止由於溶劑揮發而造成的柱填料干縮現象，因這可導致柱效的嚴重降低。

c.色譜柱應貯存在室溫下，如果放置於0℃以下的環境里，柱內就會結冰，這也將導致柱效的降低。

高效液相色譜儀的構造高效液相色譜儀（HPLC）一般由高壓輸液系統、進樣系統、分離系統、記檢測系統、數據處理系統等幾部分組成。制備型儀器還需配有餾份收集系統。為了取得較好的分析結果，HPLC儀器對於准確度、精確度、靈敏度及結果重現性有較高的要求。

高效液相色譜儀的工作原理

儲液器中的流動相被高壓泵打入系統，樣品溶液經進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱(固定相)內，由於樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數，在兩相中作相對運動時，經過反復多次的吸附-解吸的分配過程，各組分在移動速度上產生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀，數據以圖譜形式列印出來。

(1)色譜分析方法及儀器校準的討論擴展閱讀：

高效液相色譜儀的構造高效液相色譜儀（HPLC）一般由高壓輸液系統、進樣系統、分離系統、記檢測系統、數據處理系統等幾部分組成。制備型儀器還需配有餾份收集系統。為了取得較好的分析結果，HPLC儀器對於准確度、精確度、靈敏度及結果重現性有較高的要求。

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高壓輸液系統

高壓輸液系統包括：溶劑儲液瓶、溶劑脫氣裝置、高壓輸送泵以及梯度洗脫裝置。其中，高壓輸液泵是高效液相色譜儀的主要部件之一，輸送壓力達150—350×105Pa。輸液系統要為HPLC儀器提供流量恆定、准確、無脈沖的流動相，流量的精度和長期的重復性要好，同時還要提供精度好、准確度高、重現性好的多元溶劑梯度。因此，輸液泵的好壞直接影響著整個系統的質量和分析結果的可靠性。

進樣系統：進樣能在試樣引入色譜柱，有六個介面：1,4之間接定量環；2接高壓泵；3接色譜柱；5,6接廢液管。

色譜分離系統：色譜柱通常為不銹鋼柱，內裝各種填充劑。常用的填料為硅膠，可用於正相色譜;化學鍵合固定相，根據鍵合的基團不同，可用於反相或正相色譜。其中、最常用的是十八烷基鍵合硅膠，即ODS柱，可用於反相色譜或離子對色譜。

檢測系統：檢測系統用於連續檢測色譜柱流出的物質，進行定性定量分析。要求其靈敏度高、噪音小、基線穩定、響應值的線性范圍寬等。近年來各國都在研究開發新的檢測技術，進一步擴大了HPLC的應用。

根據檢測需要的不同檢測器可分為紫外檢測器(UVD)、示差折光檢測器(RID)、電化學檢測器(ECD)、紅外檢測器(IRD)、核磁共振檢測器(NMRD)、質譜檢測器(MSD)、蒸發光散射檢測器(ELSD)、小角度激光散射檢測器(LALLSPD)。

數據處理系統：高效液相色譜的分析結果除可用記錄儀繪制譜圖外，還可使用微處理機和色譜數據工作站來記錄和處理色譜分析的數據。

B. 儀器分析的色譜分析

色譜分析法是基於色譜現象而發展起來的一種分析方法。1906年，俄國植物學家茨維特認識到所謂色譜現象和分離方法有密切聯系，而且對分離有重大意義。他用這種方法分離了植物色素，並系統地研究了上百種吸附劑，奠定了色譜分析法的基礎。20世紀30年代，具有離子交換性能的合成樹脂問世，解決了一系列疑難問題，提高了色譜分離技術。由於單純的分離意義不大，20世紀50年代，人們開始將分離方法和各種檢測系統聯接起來，分離分析同時進行，於是人們設計和製造了大型色譜分析儀。除了上述的方法以外，現代儀器分析法還有磁共振法、射線分析法、電子能譜法、質譜法等等。

C. 關於氣相色譜使用注意事項

為保證氣相色譜儀能夠正常運行，確保分析數據的准確性、及時性，需要對氣相色譜儀進行定期維護。

1、氣源檢查檢：查發生器或者氣體鋼瓶是否處於正常狀態；檢查脫水過濾器、活性炭以及脫氧過濾器，定期更換其中的填料。

2、管線泄漏：檢查定期檢查管線是否泄漏，可使用肥皂沫滴到介面處檢查。

3、氣化室的維護：氣化室包括：進樣室螺帽、隔墊吹掃出口、載氣入口、分流氣出口、進樣襯管。不同的部件有不同的維護方式：

1）進樣室螺帽、隔墊吹掃出口、載氣入口及分流氣出口4個部件需按廠家要求定期清洗：把這幾個部件從氣化室上拆卸下來，放在盛有丙酮溶液的燒杯中浸泡並超聲2小時，晾乾後使用；若有損壞應及時更換。

2）進樣襯管必須定期進行清洗，先用洗液清洗，然後用丙酮溶液浸泡，再用電吹風吹乾備用，及時添加石英棉。

4、若有損壞應及時更換。

5、檢測器的維護：檢測器的收集器、檢測器接收塔、火焰噴嘴、檢測器基部、色譜柱螺帽等處，須用丙酮溶液清洗，一般超聲2小時，至清洗干凈，清洗後用電吹風吹乾備用。

6、柱溫箱的維護：柱溫箱的外殼、容積區間，可用脫脂棉蘸乙醇擦洗。

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一、使用方法

氣相色譜儀的一般分析流程：載氣由高壓鋼瓶中流出，經減壓閥降到所需壓力後，通過凈化乾燥管使載氣凈化，再經穩壓閥和轉子流量計後，以穩定的壓力、恆定的速度流經氣化室與氣化的樣品混合，將樣品氣體代入色譜柱中進行分離。

分離後的各組分隨著載氣先後流入檢測器，然後載氣放空。檢測器將物質的濃度或質量的變化轉變為一定的電信號，經放大後在記錄儀上記錄下來，就得到色譜流出曲線。根據色譜流出曲線上得到的每個峰的保留時間，可以進行定性分析，根據峰面積或峰高的大小，可以進行定量分析

二、應用領域

氣相色譜法是以氣體為流動相的色譜分析方法，主要用於分離分析易揮發的物質。氣相色譜法已成為極為重要的分離分析方法之一，在醫葯衛生、石油化工、環境監測、生物化學等領域得到廣泛的應用。

通常採用的檢測器有：熱導檢測器，火焰離子化檢測器，氦離子化檢測器，超聲波檢測器，光離子化檢測器，電子捕獲檢測器，火焰光度檢測器，電化學檢測器，質譜檢測器等。

D. 氣相色譜分析法中,進樣量是否需要非常准確為什麼

得根據方法來定。如果是外標法測，自然得非常准確，內標法或者是面積歸一化法，則不一定要那麼准確了，當然能准確是最好了。因為進樣量會影響最後的峰高，如果沒法控制的話，會有很大的誤差。

1、內標法：選擇適當的物質作為內標物質，定量加入被測樣品中，跟據被測組分和內標物質的峰面積之比，乘以校正因子，對映內標物質加入量所進行含量測定方法。

內標法的優點：色譜條件對結果影響不大，准確度、精度較高。

缺點：選擇合適的內標物質比教困難。

2、外標法：又稱標准曲線法，依照測量標准品所繪制的曲線來計量被測樣品的含量的方法。

外標法的優點：簡單，適和大量樣品分析。

缺點：每次色譜條件很難相同，容易出現誤差。

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氣相色譜分析法具體如下：

1、在石油化學工業中，採用氣相色譜法來分析原料和產品，進行質量控制；

2、在電力部門中，用來檢查變壓器等的潛伏性故障；在環境保護工作中，用來監測空氣和水的質量；

3、在農業上，用來監測農作物中殘留的農葯；

4、在商業部門，檢驗及鑒定食品質量的好壞；

5、在醫學上可用來研究人體新陳代謝、生理機能，在臨床上用於鑒別葯物中毒或疾病類型；

6、在宇宙艙中可用來自動監測飛船密封倉內的氣體。

E. 有哪些常用的色譜定量方法試比較它們的優缺點和使用范圍

1、面積歸一化法優點是簡便、准確，當操作條件變化時對結果影響較小，宜於分析多組分試樣中各組分的含量。但是試樣中所有組分必須全部出峰，因此，此法在使用中受到一定限制。 2、外標法是用純物質配成一系列不同濃度的標准溶液（或直接購買不同濃度標准溶液）分別取一定體積，注入色譜儀，根據峰面積和濃度做標准曲線。在分析未知樣時按與標准曲線相同的操作條件和方法，由標准曲線查出所需組分的濃度（現在在工作站上直接就能求出濃度）。此法要求進樣准確，操作條件穩定，分析樣品和標准曲線條件必須一致。 3、內標法是試樣中所有組分不能全部出峰或只要求測定試樣中某個或某幾個組分時，可採用此法。內標法是在准確稱取一定量的試樣中，加入一定的標准物質（內標物），根據內標物和試樣的質量以及色譜圖上的相應峰面積，計算待測組分的含量。內標法的關鍵是選擇合適的內標物，內標物應是試樣中不存在的純物質，物質與被測物質相近，能溶於樣品中，但不能於樣品發生反應。此法比較費事，一般不使用於快速分析。

F. 氣相色譜法怎樣分析2.6

不同型號的和不同配備的儀器校正是有差別的，下面的這個是安捷倫儀器用的供你參考：

氣相色譜儀校正規程

1. 目的

2. 為了保證分析數據的准確、可靠，必須對儀器進行校準，特製定此校正規程。

3. 2.范圍

4. 本規程適用於以熱導池(TCD)、火焰離子化（FID）為檢測器的氣相色譜儀的校準。

5. 3.管理職責

6. 3.1本規程由質檢部分析工程師組織實施。

7. 3.2由質檢主管負責監督檢查。

8. 4.校正項目和技術要求

9. 4.4熱導池(TCD) 檢測器

10. 4.2基線雜訊≤0.1mV ；基線漂移(30min)≤0.2 mV

11. 4.3TCD靈敏度STCD≥800Mv0ml/mg

12. 4.4火焰離子化（FID）檢測器

13. 4.5FID檢測限≤5×10-10g/s

14. 4.6FID基線雜訊≤1×10-12A；基線漂移（30min）≤1×10-11A

15. 4.7儀器的定量重復性 RSD≤3%

16. 5.校正條件

17. 5.110μl微量進樣器

18. 5.2色譜級的標准物質

19. 5.3苯-甲苯溶液

20. 5.4正十六烷-異辛烷溶液

21. 6.校正方法

22. 6.1熱導池(TCD) 為檢測器

23. 6.1.1校正條件

24. 6.1.1.1色譜柱：TDX-01（或性能相似的載體） 內徑2-3mm,長1-2m的不銹鋼柱

25. 6.1.1.2載氣：氦氣(純度不低於99.99%),流速30-60ml/min

26. 6.1.1.3溫度：柱箱70℃左右,檢測室100℃,汽化室120℃

27. 6.1.1.4橋流或熱絲溫度：選擇最佳值

28. 6.1.2TCD基線雜訊和基線漂移測定

29. 6.1.2.1按6.1.1條件,將衰減置於最靈敏檔,用零位調節器調節,使輸出信號在記錄器或積分儀的中間位置,加橋電流待基線穩定後,記錄基線半小時,測量並計算基線雜訊和基線漂移。

30. 6.1.2.2Agilent7890色譜儀的基線雜訊和漂移使用工作站直接計算並列印出來。在OFFLINE中依次點擊Report→System Suitability→Edit Noise Ranges,再輸入計算基線雜訊和漂移的時間范圍,查看報告時選擇Performance報告形式。

31. 6.1.2.3可接受標准：基線雜訊≤0.1mV 基線漂移（30min）≤0.2mV

32. 6.1.3TCD靈敏度AFC測定

33. 6.1.3.1在6.1.1條件下，待基線穩定後，注入2μl濃度為5mg/ml的苯-甲苯溶液，連續進樣6次，記錄苯峰面積。

STCD：TCD靈敏度（Mv。ml/mg）； A：苯峰面積算術平均值； W——苯進樣量（mg）；

Fc——校正後的載氣流速（ml/min）

6.1.3.2可接受標准： STCD≥800mv.ml/mg

6.2火焰離子化（FID）檢測器

6.2.1校正條件

6.2.1.1色譜柱用DB-5型或HP-5型，內徑為0.25～0.32mm，膜厚為0.25～0.32μm，長為30～50m

6.2.1.2載氣：氦氣（純度≥99.99%），流速1—2ml/min；氫氣（純度≥99.99%），流速50ml/min；空氣，不得含有影響儀器正常工作的灰塵、水分及腐蝕性物質，流速450ml/min

6.2.1.3分流為1：50

6.2.1.4溫度：柱箱150℃左右，檢測室300℃，氣化室260℃

6.2.1.5量程：選擇最佳值

6.2.1.6液體標准物質：濃度為100ng/μl正十六烷-異辛烷溶液

6.2.2FID基線雜訊和基線漂移校正測定

6.2.2.1按6.2.1的校正條件,點火並待基線穩定後,記錄半小時,測定並計算基線雜訊和基線漂移

6.2.2.2Agilent6890色譜儀的基線雜訊和漂移計算同6.1.2

6.2.2.3可接受標准：基線雜訊≤1×10-12A 基線漂移（30min）≤1×10-11A

6.2.3FID檢測限測定

6.2.3.1在5.2.1的校正條件下,使儀器處於最佳運行狀態.待基線穩定後,用微量器注入2μl濃度為100ng/μl的正十六烷-異辛烷溶液,連續進樣6次,計算正十六烷峰面積的算術平均值.根據以下公式計算檢測限:

6.2.3.2DFID=2NW/A

DFID：FID檢測限( g/s)； N：基線雜訊（A）； W：正十六烷的進樣量（g）

正十六烷的峰面積(A.S)

6.2.3.3可接受標准：檢測限≤5×10-10g/s

6.3定量重復性測定

6.3.1定量重復性以所用檢測器條件、將所測組份峰面積以相對標准差RSD表示.

6.3.2按下公式計算相對標准偏差:

n 1

RSD = [∑（Ai- A ）2]/（n-1） × ×100%

I=1 A

RSD：相對標准偏差（%）； n：測量次數； Ai：第i次測量的峰面積

A ：n次進樣的峰面積算術平均值； I：進樣序號； 可接受標准：RSD≤3%

7.性能確認

7.1使用標准品或供試品，確認儀器性能符合使用要求；

7.2先進行色譜柱的性能確認，內容包括：分離度，對稱因子，理論塔板數和峰面積標准偏差。

7.3氣相色譜柱的確認

7.3.1測試標准樣：己二醇、對氯苯酚、壬酸甲酯、4-丙基苯胺、正十三烷、十一烷醇、十五烷的250ppm CH2Cl2溶液。

7.3.2儀器條件：氣化室溫度為260℃，檢測器溫度為320℃，恆流速為1.0ml/min,柱恆溫為130℃，進樣量為：1ul,運行15min.，分流1：50。

7.3.3色譜柱：HP-1 30m×0.25mm×0.25um ；HP-5 30m×0.32mm×0.25um；TDX-01內徑2-3mm,長1-2m的不銹鋼柱。

7.3.4評價標准：連續進行5次分析, 分離度R＞1.5；十五烷對稱因子S在0.80~1.50范圍內；十五烷柱效＞3000m-1；十五烷峰面積的標准偏差≤3.0%。

7.4按照性能確認方法逐步進行，並記錄譜圖；根據性能測試的結果，評價儀器是否符合性能要求。

8.校正結果處理和校正周期

8.1校正結果全部項目均符合技術要求者，可繼續使用。若出現某些項目達不到規格要求，關於儀器情況，儀器負責人以維修報告的形式報於QC經理，由QC經理批准維修方案。

8.2 校正周期為1年 。

9.形成的記錄

G. 如何建立氣相色譜分析方法

色譜分析常用的定量方法：歸一化法、內標法和內加（增量）內標法、外標法。
1、面積歸一化法優點是簡便、准確，當操作條件變化時對結果影響較小，宜於分析多組分試樣中各組分的含量。但是試樣中所有組分必須全部出峰，因此，此法在使用中受到一定限制。
2、外標法是用純物質配成一系列不同濃度的標准溶液（或直接購買不同濃度標准溶液）分別取一定體積，注入色譜儀，根據峰面積和濃度做標准曲線。在分析未知樣時按與標准曲線相同的操作條件和方法，由標准曲線查出所需組分的濃度（現在在工作站上直接就能求出濃度）。此法要求進樣准確，操作條件穩定，分析樣品和標准曲線條件必須一致。
3、內標法是試樣中所有組分不能全部出峰或只要求測定試樣中某個或某幾個組分時，可採用此法。內標法是在准確稱取一定量的試樣中，加入一定的標准物質（內標物），根據內標物和試樣的質量以及色譜圖上的相應峰面積，計算待測組分的含量。內標法的關鍵是選擇合適的內標物，內標物應是試樣中不存在的純物質，物質與被測物質相近，能溶於樣品中，但不能於樣品發生反應。此法比較費事，一般不使用於快速分析。

H. 色譜如何分析

色譜分析是指按物質在固定相與流動相間分配系數的差別而進行分離、分析的方法。其按流動相的分子聚集狀態可分為液相色譜、氣相色譜及超臨界流體色譜法等。按分離原理可分為吸附、分配、空間排斥、離子交換、親合及手性色譜法等諸多類別。按操作原理可分為柱色譜法及平板色譜法等。色譜法已成為應用最廣、葯典收載最多的一類分析方法。色譜分析有兩個要素——流動相和固定相。在流動相從固定相的一端流到另一端的過程中，加在固定相起始端的溶質隨流動相流動，並在流動相和固定相之間來回轉移。不同的溶質與這兩相的親和力大小不同，溶質的移動速度也不同，因而得到分離。固定相一般是固體，也可以是固體上附著液體；流動相是液體或氣體。
色譜分析具有很多優點：分離效果好，設備簡單，操作方便，條件較溫和，方法多樣，能適應不同的需要。其缺點主要是：處理量小，周期長，不能連續操作；有的層析介質價格昂貴，有時找不到合適的介質。
色譜分析（層析）有各種類型。按照固定相使用的形式，可分為柱層析、紙層析、薄層層析。按照溶質的展開方式，可分為前沿層析、置換層析、洗脫層析。按照流動相的物理狀態，可分為氣相層析與液相層析，以及超臨界流體層析等。按照分離機理，可分為分配層析、吸附層析、離子交換層析、排阻層析、疏水層析、離子對層析、親和層析、鍵合相層析。按照固定相和流動相的相對極性，可分為正相層析與反相層析。
在層操作時，單組分洗脫劑對多組分樣品的洗脫效果常常不夠滿意。不是先洗出的組分混雜在一起，就是後洗出的組分出峰時間長，峰寬增加。為了改善解析度、改變峰形或縮短層析時間，有時需要在層析過程中改變流動相的組成(pH、離子強度)。分階段改變流動相的組成，流動相的組成呈階梯狀變化，稱為階段洗脫。逐漸改變流動相的組成，流動相的組成呈曲線或直線狀變化，稱為梯度洗脫。流動相形成梯度可用梯度洗脫儀。高效液相層析儀中常用幾個泵分別輸送不同的溶劑，控制各個泵的流量，就能控制洗脫劑的組成。
改善層析分離效果的方法有：改變流動相的組成或pH，改變固定相，改變溫度等。在液相層析中以改變流動相的組成最重要。其餘要注意的條件有：柱要細而長；分離介質填充要緊密、均勻，顆粒細密、大小分布均勻；操作溫度保持恆定；樣品用量少；流速慢而恆定。[

I. 氣相色譜儀如何校準

不同型號的和不同配備的儀器校正是有差別的，下面的這個是安捷倫儀器用的供你參考：
氣相色譜儀校正規程
1.目的
為了保證分析數據的准確、可靠，必須對儀器進行校準，特製定此校正規程。
2.范圍
本規程適用於以熱導池(TCD)、火焰離子化（FID）為檢測器的氣相色譜儀的校準。
3.管理職責
3.1本規程由質檢部分析工程師組織實施。
3.2由質檢主管負責監督檢查。
4.校正項目和技術要求
4.4熱導池(TCD) 檢測器
4.2基線雜訊≤0.1mV ；基線漂移(30min)≤0.2 mV
4.3TCD靈敏度STCD≥800Mv0ml/mg
4.4火焰離子化（FID）檢測器
4.5FID檢測限≤5×10-10g/s
4.6FID基線雜訊≤1×10-12A；基線漂移（30min）≤1×10-11A
4.7儀器的定量重復性 RSD≤3%
5.校正條件
5.110μl微量進樣器
5.2色譜級的標准物質
5.3苯-甲苯溶液
5.4正十六烷-異辛烷溶液
6.校正方法
6.1熱導池(TCD) 為檢測器
6.1.1校正條件
6.1.1.1色譜柱：TDX-01（或性能相似的載體） 內徑2-3mm,長1-2m的不銹鋼柱
6.1.1.2載氣：氦氣(純度不低於99.99%),流速30-60ml/min
6.1.1.3溫度：柱箱70℃左右,檢測室100℃,汽化室120℃
6.1.1.4橋流或熱絲溫度：選擇最佳值
6.1.2TCD基線雜訊和基線漂移測定
6.1.2.1按6.1.1條件,將衰減置於最靈敏檔,用零位調節器調節,使輸出信號在記錄器或積分儀的中間位置,加橋電流待基線穩定後,記錄基線半小時,測量並計算基線雜訊和基線漂移。
6.1.2.2Agilent7890色譜儀的基線雜訊和漂移使用工作站軟體直接計算並列印出來。在OFFLINE中依次點擊Report→System Suitability→Edit Noise Ranges,再輸入計算基線雜訊和漂移的時間范圍,查看報告時選擇Performance報告形式。
6.1.2.3可接受標准：基線雜訊≤0.1mV 基線漂移（30min）≤0.2mV
6.1.3TCD靈敏度AFC測定
6.1.3.1在6.1.1條件下，待基線穩定後，注入2μl濃度為5mg/ml的苯-甲苯溶液，連續進樣6次，記錄苯峰面積。

STCD：TCD靈敏度（Mv。ml/mg）； A：苯峰面積算術平均值； W——苯進樣量（mg）；
Fc——校正後的載氣流速（ml/min）
6.1.3.2可接受標准： STCD≥800mv.ml/mg
6.2火焰離子化（FID）檢測器
6.2.1校正條件
6.2.1.1色譜柱用DB-5型或HP-5型，內徑為0.25～0.32mm，膜厚為0.25～0.32μm，長為30～50m
6.2.1.2載氣：氦氣（純度≥99.99%），流速1—2ml/min；氫氣（純度≥99.99%），流速50ml/min；空氣，不得含有影響儀器正常工作的灰塵、水分及腐蝕性物質，流速450ml/min
6.2.1.3分流為1：50
6.2.1.4溫度：柱箱150℃左右，檢測室300℃，氣化室260℃
6.2.1.5量程：選擇最佳值
6.2.1.6液體標准物質：濃度為100ng/μl正十六烷-異辛烷溶液
6.2.2FID基線雜訊和基線漂移校正測定
6.2.2.1按6.2.1的校正條件,點火並待基線穩定後,記錄半小時,測定並計算基線雜訊和基線漂移
6.2.2.2Agilent6890色譜儀的基線雜訊和漂移計算同6.1.2
6.2.2.3可接受標准：基線雜訊≤1×10-12A 基線漂移（30min）≤1×10-11A
6.2.3FID檢測限測定
6.2.3.1在5.2.1的校正條件下,使儀器處於最佳運行狀態.待基線穩定後,用微量注射器注入2μl濃度為100ng/μl的正十六烷-異辛烷溶液,連續進樣6次,計算正十六烷峰面積的算術平均值.根據以下公式計算檢測限:
6.2.3.2DFID=2NW/A
DFID：FID檢測限( g/s)； N：基線雜訊（A）； W：正十六烷的進樣量（g）
正十六烷的峰面積(A.S)
6.2.3.3可接受標准：檢測限≤5×10-10g/s
6.3定量重復性測定
6.3.1定量重復性以所用檢測器條件、將所測組份峰面積以相對標准差RSD表示.
6.3.2按下公式計算相對標准偏差:

n 1
RSD = [∑（Ai- A ）2]/（n-1） × ×100%
I=1 A

RSD：相對標准偏差（%）； n：測量次數； Ai：第i次測量的峰面積
A ：n次進樣的峰面積算術平均值； I：進樣序號； 可接受標准：RSD≤3%
7.性能確認
7.1使用標准品或供試品，確認儀器性能符合使用要求；
7.2先進行色譜柱的性能確認，內容包括：分離度，對稱因子，理論塔板數和峰面積標准偏差。
7.3氣相色譜柱的確認
7.3.1測試標准樣：己二醇、對氯苯酚、壬酸甲酯、4-丙基苯胺、正十三烷、十一烷醇、十五烷的250ppm CH2Cl2溶液。
7.3.2儀器條件：氣化室溫度為260℃，檢測器溫度為320℃，恆流速為1.0ml/min,柱恆溫為130℃，進樣量為：1ul,運行15min.，分流1：50。
7.3.3色譜柱：HP-1 30m×0.25mm×0.25um ；HP-5 30m×0.32mm×0.25um；TDX-01內徑2-3mm,長1-2m的不銹鋼柱。
7.3.4評價標准：連續進行5次分析, 分離度R＞1.5；十五烷對稱因子S在0.80~1.50范圍內；十五烷柱效＞3000m-1；十五烷峰面積的標准偏差≤3.0%。
7.4按照性能確認方法逐步進行，並記錄譜圖；根據性能測試的結果，評價儀器是否符合性能要求。
8.校正結果處理和校正周期
8.1校正結果全部項目均符合技術要求者，可繼續使用。若出現某些項目達不到規格要求，關於儀器情況，儀器負責人以維修報告的形式報於QC經理，由QC經理批准維修方案。
8.2 校正周期為1年 。
9.形成的記錄

J. 高效液相色譜的原理及分析方法

原理主要有這幾種：
液—液分配色譜法
(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化學鍵合相色譜(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流動相和固定相都是液體。流動相與固定相之間應互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個明顯的分界面。當試樣進入色譜柱，溶質在兩相間進行分配。達到平衡時，服從於高效液相色譜計算公式： 高效液相色譜計算公式
式中，cs—溶質在固定相中濃度；cm--溶質在流動相中的濃度； Vs—固定相的體積；Vm—流動相的體積。LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決於K，K大的組分保留值大；但也有不同之處，GPC中，流動相對K影響不大，LLPC流動相對K影響較大。 a. 正相液 — 液分配色譜法(Normal Phase liquid Chromatography): 流動相的極性小於固定液的極性。 b. 反相液 — 液分配色譜法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流動相的極性大於固定液的極性。 c. 液 — 液分配色譜法的缺點：盡管流動相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動相中仍有微量溶解；流動相通過色譜柱時的機械沖擊力，會造成固定液流失。上世紀70年代末發展的化學鍵合固定相（見後），可克服上述缺點。現在應用很廣泛（70~80%）。
液—固色譜法
流動相為液體，固定相為吸附劑（如硅膠、氧化鋁等）。這是根據物質吸附作用的不同來進行分離的。其作用機制是：當試樣進入色譜柱時，溶質分子 (X) 和溶劑分子(S)對吸附劑表面活性中心發生競爭吸附（未進樣時，所有的吸附劑活性中心吸附的是S），可表示如下：Xm nSa ====== Xa nSm 式中：Xm--流動相中的溶質分子；Sa--固定相中的溶劑分子；Xa--固定相中的溶質分子；Sm--流動相中的溶劑分子。 當吸附競爭反應達平衡時： K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa] 式中：K為吸附平衡常數。[討論：K越大，保留值越大。]
離子交換色譜法
(Ion-exchange Chromatography) IEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基於離子交換樹脂上可電離的離子與流 離子交換色譜柱
動相中具有相同電荷的溶質離子進行可逆交換，依據這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離。以陰離子交換劑為例，其交換過程可表示如下： X-(溶劑中) (樹脂-R4N Cl-)=== (樹脂-R4N X-) Cl- (溶劑中) 當交換達平衡時： KX=[-R4N X-][ Cl-]/[-R4N Cl-][ X-] 分配系數為： DX=[-R4N X-]/[X-]= KX [-R4N Cl-]/[Cl-] [討論：DX與保留值的關系] 凡是在溶劑中能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法來進行分離。
離子對色譜法
(Ion Pair Chromatography) 離子對色譜法是將一種 ( 或多種 ) 與溶質分子電荷相反的離子 ( 稱為對離子或反離子 ) 加到流動相或固定相中，使其與溶質離子結合形成疏水型離子對化合物，從而控制溶質離子的保留行為。其原 離子色譜儀流程示意
理可用下式表示：X 水相 Y-水相 === X Y-有機相 式中：X 水相--流動相中待分離的有機離子（也可是陽離子）；Y-水相--流動相中帶相反電荷的離子對（如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等）；X Y---形成的離子對化合物。 當達平衡時： KXY = [X Y-]有機相/[ X ]水相[Y-]水相 根據定義，分配系數為： DX= [X Y-]有機相/[ X ]水相= KXY [Y-]水相 [討論：DX與保留值的關系] 離子對色譜法(特別是反相)發解決了以往難以分離的混合物的分離問題，諸如酸、鹼和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、生物鹼以及葯物等分離。
離子色譜法
(Ion Chromatography) 用離子交換樹脂為固定相，電解質溶液為流動相。以電導檢測器為通用檢測器，為消除流動相中強電解質背景離子對電導檢測器的干擾，設置了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應原理與離子交換色譜法相同。 以陰離子交換樹脂（R-OH）作固定相，分離陰離子（如Br-）為例。當待測陰離子Br-隨流動相（NaOH）進入色譜柱時，發生如下交換反應（洗脫反應為交換反應的逆過程）： 擔體圖示
抑制柱上發生的反應： R-H Na OH- === R-Na H2O R-H Na Br- === R-Na H Br- 可見，通過抑制柱將洗脫液轉變成了電導值很小的水，消除了本底電導的影響；試樣陰離子Br-則被轉化成了相應的酸H Br-，可用電導法靈敏的檢測。 離子色譜法是溶液中陰離子分析的最佳方法。也可用於陽離子分析。
空間排阻色譜法
(Steric Exclusion Chromatography) 空間排阻色譜法以凝膠 (gel) 為固定相。它類似於分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數納米到數百納米。溶質在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來進行分離，而是按分子大小進行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質的流動力學體積或分子大小有關。試樣進入色譜柱後，隨流動相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過。在試樣中一些太大的分子不能進入膠孔而受到排阻，因此就直接通過柱子，首先在色譜圖上出現，一些很小的分子可以進入所有膠孔並滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最後出現。
分析方法：
綜述
色譜柱的填料和流動相的組分應按各品種項下的規定.常用的色譜柱填料有硅膠和化學鍵合硅膠。後者以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用,辛基鍵合硅膠次之,氰基或氨基鍵合硅膠也有使用；離子交換填料,用於離子交換色譜；凝膠或玻璃微球等，用於分子排阻色譜等。注樣量一般為數微升。除另有規定外，柱溫為室溫，檢測器為紫外吸收檢測器。 在用紫外吸收檢測器時,所用流動相應符合紫外分光光度法項下對溶劑的要求。 正文中各品種項下規定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得任意改變外，其餘如色譜柱內徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進化學鍵合固定相反應
樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變, 以適應具體品種並達到系統適用性試驗的要求。一般色譜圖約於20分鍾內記錄完畢。 2.系統適用性試驗 按各品種項下要求對儀器進行適用性試驗，即用規定的對照品對儀器進行試驗和調整,應達到規定的要求；或規定分析狀態下色譜柱的最小理論板數、分離度和拖尾因子.
色譜柱的理論板數
在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項下規定的內標物質溶液，記錄色譜圖化學鍵合固定相應用
，量出供試品主成分或內標物質峰的保留時間t(R)和半高峰寬W(h/2)，按n＝5.54[t(R)╱W(h/2)]^2計算色譜柱的理論板數，如果測得理論板數低於各品種項下規定的最小理論板數，應改變色譜柱的某些條件（如柱長、載體性能、色譜柱充填的優劣等），使理論板數達到要求。
分離度
定量分析時，為便於准確測量，要求定量峰與其他峰或內標峰之間有較好的分離度。分離度（R）的計算公式為： 2[t(R2)-t(R1)] ，R＝ -W1＋W2 式中 t(R2)為相鄰兩峰中後一峰的保留時間； t(R1)為相鄰兩峰中前一峰的保留時間； W1及W2為此相鄰兩峰的峰寬。 除另外有規定外，分離度應大於1.5。
拖尾因子
為保證測量精度，特別當採用峰高法測量時，應檢查待測峰的拖尾因子(T)是否符合各品種項下的規定,或不同濃度進樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計算公式為： W(0.05h) T＝-2d1 式中 W(0.05h)為0.05峰高處的峰寬； d1為峰極大至峰前沿之間的距離。 除另有規定外，T應在0.95～1.05間。 也可按各品種校正因子測定項下，配製相當於80％、100％和120％的對照品溶液，加入規定量的內標溶液，配成三種不同濃度的溶液，分別注樣3次,計算平均校正因子，其相對標准偏差應不大於2.0％。