轉錄組研究方法

『壹』 什麼是轉錄組分析

轉錄組
是指某個物種或特定細胞在某一生理功能狀態下，細胞內所有轉錄的mRNA產物的集合，包含了時間
和空間
的限定，是連接
基因組
遺傳信息與生物功能的
蛋白質組
的必然紐帶。轉錄水平的調控是
目前
研究最多的，也是生物體最重要的調控方式。
應用高通量技術進行轉錄組測序是一種快捷可靠的獲取轉錄組信息的方法。mRNA的轉錄本表達分析，通過獲得研究對象基因組轉錄區域的信息，鑒定轉錄發生
位點
，可變剪切等，其精確的計數方法更可對基因進行精確的定量分析。

『貳』 轉錄組數據分析RNA-seq

轉錄組學（transcriptomics）的研究對象是全基因組尺度下所有轉錄本（transcript），即轉錄組（transcriptome）

將熒游標記的cDNA製成微陣列探針來測定樣本中特定轉錄本含量。又稱為 基因晶元（Gene Chip）、微陣列（Microarry）。

獲取表達量的步驟：
提取RNA -> 反轉錄 （->擴增）->標記->雜交->掃描->獲得原始數據
局限性：
• 只能檢測已知或；確定性的序列
• 無法檢測新發現的，未放置到晶元上的基因
• 有部分探針的信號可能會收到非特異性雜交或個體序列差異的影響

基於高通量二代測序技術的轉錄組學研究方法。
特點：
高通量、低成本；不依賴已知轉錄本探針，可以測全轉錄組；對於低表達豐度的轉錄本靈敏
度高；以reads數量腐酸表達，比晶元的熒光信號更為精確。
應用和最新進展

依據文庫要求檢查完整性分值，如果不合格將不適合建庫測序。一些特殊文庫對RNA提取要求很高，如全長轉錄組文庫，需要特殊提取流
程保證RNA 完整性。

需要的數據：參考基因組數據fasta、GFF注釋信息、雙端測序的fastq文件
我這里用的是普通栽培稻( Oryza sativa L.)的參考基因組和、GFF文件和SRR17439319數據。
參考步驟： https://blog.csdn.net/sunchengquan/article/details/79781366
注意：配置時，需要在bin目錄下執行 ./vdb-config --interactive ，然後彈出一大堆亂七八糟的之後，按X退出即可。再執行./fastq-mp，若沒有報錯，而是幫助信息的話即可以使用。

測序數據分析前需要經過數據預處理，並檢查數據GC含量、序列重復成俗、是否存在接頭等。

在質控後，再質檢一次，對比看看有什麼不同。

將 reads 匹配到參考基因組或轉錄組的相應位置上
• 非剪接比對：轉錄組
Bowtie、BWA
• 剪接比對：參考基因組
STAR、HISAT、Topha
對鑒定SNP做了優化： GSNAP、MapSplice等

① 建立基因組索引

②利用注釋文件比對

沒有注釋文件的比對方法

③ SAM 文件處理
使用 samtools 對 SAM 文件排序並轉化為 BAM 文件。samtools是一個用於操作sam和bam文件的工具合集，包含有許多命令。

④比對結果可視化
比對結果使用 IGV 、Genome Maps 和Sacant 等可視化查看。
例如：IGV 通過讀入基因組和注釋信息以及BAM 文件展示比對結果。
需要額外添加 BMA 的索引: samtools index test_sorted.bam test_sorted.

⑤比對結果評估
比對結果評估工具：RSeQC、Qualimap

計算FPKM

-p 線程數
-G 參考基因組注釋
-e 只估計已給參考基因組注釋的基因豐度
-A 基因豐度估計輸出文件
-o 輸出文件

『叄』 空間轉錄組應用領域與研究思路

細胞位置信息對於幹細胞分化，組織發育以及腫瘤組織微環境起著重大的作用，那麼空間轉錄組在這些研究領域中是如何設計如何解決科學問題的呢？跟著我一探究竟吧。

之前跟大家一起瀏覽了10X Genomics Visium 空間轉錄組的分析流程（ 不可錯過的單細胞轉錄組研究新維度：空間轉錄組 ）
，這次跟大家分享一下空間轉錄組的應用領域以及研究的思路。

根據10X Genomics 官網上公布的利用ST（Spatial Transcriptomics）技術進行研究的文獻，可以看到該技術涵蓋了 腫瘤 、 發育 、 疾病 等領域，涉及到腫瘤、淋巴、大腦、心臟等各種組織。同時空間轉錄組技術除了可以應用在常見的哺乳動物，也可以應用在 植物學 的研究上。

我們以2020年1月份發表在Nature Biotechnology 上，對PDAC（胰腺導管腺癌）的研究為例，探討下空間轉錄組在腫瘤生物學方面的研究。

該研究主要整合了原ST技術和單細胞RNA技術，彌補了原ST解析度較低、單細胞RNA缺乏空間信息的缺點，兩者互相補充，實現了 單細胞水平加空間的全面無偏的癌症組織分析 。

1.探究PDAC組織的細胞類型，以及與空間相關的細胞亞型
2.探究不同腫瘤樣本微環境特點

如上圖所示，作者分兩條線進行設計分析，取兩名PDAC患者的2例新鮮PDAC-A和B腫瘤組織，同時進行scRNA-seq和ST建庫測序分析。

scRNA-seq 細胞分類： 利用CNV和細胞分類分析以及熒游標記實驗證實了PDAC-A包含兩種癌症細胞群cluster1(TM4SF1)和cluster2(S100A4)，PDAC-B包含一種癌症細胞群cluster1（TM4SF1）。

ST-seq細胞分群： 依據病理學進行組織分區，計算Spots表達水平進行PCA分類，發現cluster與組織分類是一致的。

MIA演算法整合分析：
1.發現在組織空間受限區域中含有特定的細胞類型和特定細胞亞群的富集。例如PDAC-A的成纖維細胞特異性基因與ST分析結果中的特定區域的一組基因具有很強的一致性；除此之外，還發現了導管上皮區域富含導管細胞，胰腺組織區域富含腺泡細胞和分泌細胞。
2.依據MIA結果繪制了不同腫瘤樣本微環境的特點、免疫環境狀態、應激水平以及細胞之間相互作用的模式，有助於對患者預後進行預判。

熒光實驗驗證： 利用免疫熒游標記實驗進行結果驗證。

該文章的一大亮點是引入了MIA演算法進行空間和單細胞的整合，目前10X Genomics visium 系統大大提升了空間解析度，一個Spot大概包含1-10個單細胞（主要受研究的組織細胞直徑的影響），幾乎接近單細胞水平。

接下來我們一起看一下，發表在Cell上一篇關於人類心臟研究的文章，充分發揮了空間轉錄組技術， 全方位展示了單細胞空間解析度下的全器官模式 。

該研究利用空間轉錄組（ST）、單細胞（scRNA）和原位測序（in situ sequencing，ISS）技術進行聯合分析，最終獲得了人類心臟發育的時間、空間的基因表達模式，並深入探討了不同類型細胞的功能。同時創建了人類胚胎心臟的公共網路資源，共享研究數據和成果。

研究設計如上圖所示，取來自3個人的孕4.5-5周、6.5周和9周的心臟組織，採用ST、scRNA 和原位測序三種技術手段，從時間、空間兩個維度展示了人類心臟發育表達的模式。

STseq分析： 對不同孕期的胚胎心臟切片進行空間轉錄組技術分析，經過降維聚類，差異表達等分析，最終獲得了10個cluster細胞類型，並標注了10個cluster特異性表達的基因。

scRNAseq分析： 對孕6.5周胚胎心臟分割兩部分進行scRNA建庫測序分析，經過降維聚類，獲得15個cluster細胞類型，鑒定到的細胞類型與先前報道一致。

ISS分析： 利用ISS的亞細胞空間解析度的特性，運用pciSeq方法創建了一個綜合概率，確定scRNA定義的細胞類型的空間細胞圖譜，從而實現單細胞解析度的基因表達時空分析。

作者把運用這三種技術整合的人類胚胎心臟發育的時空基因表達圖譜數據提交到一個公共網站上，以共享數據成果。 https://hdca-sweden.scilifelab.se/a-study-on-human-heart-development/

ISS技術是2013年發表在Nature Methods 上的一篇文章，主要講述了這種擴增測序方法。滾環擴增：這種方法依賴一種鎖式（padlock）探針，它與目標序列的任一側雜交，以形成環狀模板，進行復制。由於產物是拴在模板上的，這提供了可靠定位，並可通過連續的寡核苷酸探針摻入，實現原位測序。這項技術一般用於序列（RNA，基因）組織細胞定位驗證分析。

關於ST技術在疾病研究領域的介紹，我們以2019年12月發表在Scientific Reports 上的一篇關於關節炎的研究為例，一起探討下這項技術的應用思路。

該研究主要利用ST空間轉錄組技術，探索了類風濕性關節炎（RA）和脊柱關節炎（SpA）的炎症信號通路。揭示了在RA中，適應性免疫反應與T-B細胞相互作用，而在SpA中，適應性免疫反應與組織修復功能相關。

研究設計如上圖所示，分別取RA和SpA各3名患者，取其髖部或者膝蓋處的滑膜組織進行ST建庫測序分析，揭示了慢性炎症性疾病的細胞機制和在組織中的功能的多樣性。例如在RA中，適應性免疫反應與T-B細胞相互作用，而在SpA中，適應性免疫反應與組織修復功能相關。

ST分析： 取每個患者病患處3個部位滑膜組織，每個患者3個部位的數據合並在一起作為一個bulk對單個組織切片進行糾正對比。由bulk和單個組織差異表達分析來看，RA與T細胞、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）關聯更強，而SpA組織的特徵更多在於軟骨損傷和修復系統的過程。

功能分析： 利用Ingenuity Pathway Analysis (IPA) and Metascape ( http://metascape.org )軟體對差異表達基因進行功能和分子網路通路分析，發現RA與適應性免疫應答相關，SpA與細胞外基質相關、與軟骨損傷修復過程相關。

細胞類型鑒定： 利用Xcell軟體進行細胞類型的鑒定，展現了空間組織區域細胞的類型。

前面介紹了人類腫瘤、發育和疾病相關的研究，那麼ST技術能否應用於植物學上，為農林研究貢獻一種新技術、新方案呢？答案是肯定的。下面這篇就是2017年發表在Nature Plant 雜志上的一篇關於植物學的研究。

該研究利用空間轉錄組技術首先在被子植物和裸子植物中模擬了生成空間轉錄組圖譜的可行性，並且在擬南芥中識別了141個表達差異基因和花序組織區域的功能通路上的189個差異基因。空間轉錄組學與功能學結合研究，將為植物發育、進化等研究帶來新的思路和新的方法。

研究設計如上圖所示。作者對待研究的植物進行取樣，如擬南芥花序、銀杏芽等一些植物進行取樣，切片，建庫測序分析。

1.討論被子植物和裸子植物空間轉錄技術的可行性

a.展示了金銀花的葉子芽在一年四季的形態；b.金銀花葉子芽兩個發育中和休眠中的葉芽基因表達熱圖，每個顏色條代表一個橫截切面，黑色箭頭指示位置表示空間Spots的基因表達較低；c.展示不同組織切片空間位點PCA的情況，i為雌性錐組織切片Spots PCA；ii 為不同的組織結構（PT/LO）PCA；d.表明每個Spots的基因和轉錄本數量在擬南芥中復制。黑線表示每個重復中每個Spots的平均基因或轉錄本的數量；由b和c的PCA圖示可以看到空間轉錄組信息（Spots）是可以區分組織差異性的。

2.空間轉錄組技術可用於擬南芥花序分化的分析

a.每個基因在空間上的表達水平。檢測到基因表達情況用顏色斑點進行表示。b.擬南芥空間Spots分層聚類（t-SNE分析）。c.微觀領域級別的組織域分類用於線性模型分析。d.組織微類別中141個差異基因檢驗水平。綠點，實際數據中的P值；紅點，隨機排列斑點標簽後的P值；垂直虛線為排列後的P值的0.1％分位數（大約等於0.001），證實了模型的正確性，並用於估計FDR）；水平虛線為任意閾值P（H0）= 0.05。e.列舉線性模型中在組織區域微類別之間的差異表達基因。f.花序組織區域功能通路上的189個差異基因。顏色編碼如d中所示。g.線性模型檢測到的功能通路的例子。由擬南芥的研究可以知道空間轉錄組技術識別了141個表達差異基因和花序組織區域的功能通路上的189個差異基因。空間轉錄組學結合功能學研究，將有助於更好的理解研究植物的進化和發育。

這是ST技術發表以來，唯一應用於植物學研究的文章，實際經驗還不足，尤其植物樣本受到細胞壁，液泡，葉綠體和次生代謝產物的影響，需要對待研究的樣本進行特定的優化。

舉一反三的研究思路，加上ST升級版的10X Genomics Visium ，相信空間轉錄組會得到更廣泛，更深入的應用。

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『肆』 轉錄組測序流程步驟是哪些

以真核轉錄組測序為例，實驗流程為總RNA提取-mRNA分離-建庫試劑-定量-文庫回收-橋式擴增-上機測序；項目分析流程為數據產出數據=數據去雜-轉錄組拼接-SSR分析及SNP分析-基因功能注釋-基因表達差異分析-差異基因表達模式聚類-差異基因富集分析。

『伍』 轉錄組測序研究怎麼做

首先需要做的是將測出來的readsmapping到基因組上，與此同時可以得到數據mapping比例等信息，依靠這些信息可以進行數據質量的分析，然後還可以統計每個基因的表達情況，如果是比較不同樣本之間的轉錄組，則可以進行差異表達基因的分析

『陸』 有個關於轉錄組測序的問題

目前研究轉錄組主要包含三種方法：
包括基於sanger測序法的sage
（serial
analysis
of
gene
expression）、longsage和mpss（massively
parallel
signature
sequencing）；
基於雜交技術的cdna晶元和寡聚核苷酸晶元；
基於高通量測序技術的轉錄組測序（rna-seq）。
與另兩種方法相比，rna-
seq具有以下優勢：
高靈敏度，檢測閾值跨越6個數量級，能檢測到細胞中幾乎所有的轉錄本，包括一些只有幾個拷貝的稀有轉錄本，同時能對轉錄本進行定量；
高准確率，能准確的測定每個轉錄本的單核苷酸，同時不存在生物晶元的熒光模擬信號帶來的交叉反應和背景噪音的問題；
應用范圍廣，無需預先設計探針或了解物種的基因信息，即可對任意物種進行轉錄組測序，同時能發現新的轉錄本，預測新的基因，檢測可變剪切、snps、融合
基因等。
所以如果閣下希望進行轉錄組研究，可以從以上幾種方法入手。多看文獻，多向前輩請教，假以時日，會成為高手的。如有問題，可以進一步追問。
希望採納哦

『柒』 比較概述基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學的概念、研究方法、優缺點及應用設想

組學omics，研究的是整體. 按照分析目標不同主要分為基因組學，轉錄組學，蛋白質組學，代謝組學。
基因組學研究的主要是基因組DNA，使用方法目前以二代測序為主，將基因組拆成小片段後再用生物信息學演算法進行迭代組裝。當然這僅僅是第一步，隨後還有繁瑣的基因注釋等數據分析工作。
轉錄組學研究的是某個時間點的mRNA總和，可以用晶元，也可以用測序。晶元是用已知的基因探針，測序則有可能發現新的mRNA,
蛋白組學針對的是全體蛋白，組要以2D-Gel和質譜為主，分為top-down和bottom-up分析方法。理念和基因組類似，將蛋白用特定的物料化學手段分解成小肽段，在通過質量反推蛋白序列，最後進行搜索，標識已知未知的蛋白序列。
代謝組分析的代謝產物，是大分子和小分子的混合物，主要也是用液相和質譜。
總而言之，這些技術都想從全局找變數，都是一種top-down的研究方法，原因很簡單：避免『只緣身在此山中』的尷尬。
但因為技術局限，都各有缺點，尤其是轉錄組和蛋白組數據，基本上顛覆了以前一直認為的mRNA水平能代表蛋白水平的觀念，因為這兩組數據的重合度太低。
所以目前很多研究都開始使用交叉驗證方法。
無論如何，都需要對數據進行分析，有經驗的分析往往能化腐朽為神奇。

『捌』 轉錄組學有哪些實現手段，數據類型及其格式

廣義轉錄組是指生命單元(通常是一種細胞)中所有按基因信息單元轉錄和加工的RNA分子(包括編碼和非編碼RNA功能單元),或者是一個特定細胞所有轉錄本的總和.它的研究對象就是這些RNA與蛋白質分子和它們所組成的基因功能網路以及它們與細胞功能的關系.而狹義轉錄組是指可直接參與翻譯蛋白質的mRNA總和.研究生物細胞中轉錄組的發生和變化規律的科學就稱為轉錄組學(tran—scriptomics).
(二)轉錄組學的意義1．轉錄組譜可以提供特定條件下某些基因表達的信息,並據此推斷相應未知基因的功能,揭示特定調節基因的作用機制.2．通過基於基因表達譜的分子標簽,不僅可以辨別細胞的表型歸屬,還可以用於疾病的診斷.3．轉錄組的研究應用於臨床的另一個例子是可以將表面上看似相同的病症分為多個亞型,尤其是對原發性惡性腫瘤,通過轉錄組差異表達譜的建立,可以詳細描繪出患者的生存期以及對葯物的反應等.

『玖』 什麼是轉錄組分析

轉錄組分析指對細胞內所有轉錄產物的集合的分析。

轉錄組（transcriptome）廣義上指某一生理條件下，細胞內所有轉錄產物的集合，包括信使RNA、核糖體RNA、轉運RNA及非編碼RNA；狹義上指所有mRNA的集合。

轉錄組測序一般是對用多聚胸腺嘧啶（oligo-dT）進行親和純化的RNA聚合酶II轉錄生成的成熟mRNA和ncRNA進行高通量測序。

相對於傳統的晶元雜交平台，轉錄組測序無需預先針對已知序列設計探針，即可對任意物種的整體轉錄活動進行檢測，提供更精確的數字化信號，更高的檢測通量以及更廣泛的檢測范圍，是目前深入研究轉錄組復雜性的強大工具。

(9)轉錄組研究方法擴展閱讀：

轉錄組測序的技術路線：

樣品要求：

1、樣品純度要求： total RNAOD值應在1.8至2.2之間；電泳檢測28S:18S至少大於1.5。

2、樣品濃度： total RNA濃度不低於400ng/ul；樣品總量不低於15ug;目前最新的樣品建庫要求降低到1ug,濃度大於50ng/ul即可。

3、提供total RNA樣品具體濃度、體積、制備時間、溶劑名稱及物種來源。請同時附上QC數據，包括電泳膠圖、分光光度或Nanodrop儀器檢測數據。如需進行多次樣品制備，需要提供多次樣品制備所需樣品。

『拾』 單細胞轉錄組(Single cell RNA)概述

這幾年單細胞實驗和分析技術如雨後春筍般涌現，相關文章也層出不窮，各種軟文也是鋪天蓋地。作者嘔心瀝血整理了一篇關於單細胞的長文，詳細介紹單細胞轉錄組分析的整體分析。本文是第一篇，我們一起來看看單細胞轉錄組的基本知識。

單細胞轉錄組就是某一時刻單個細胞內所有mRNA總表達量，其表達量反映該細胞的總體特徵。隨著2009年湯富酬老師首先開發單細胞轉錄組技術後，單細胞轉錄組技術如雨後春筍般涌現出來，比如Smart-seq、CEL-Seq、Quartz-Seq、Drop-seq、InDrop-seq、Smart-seq2等等。單細胞轉錄組技術的出現使得我們可以把研究的精度從組織多細胞層面精確到單個細胞領域，可以單獨研究某個細胞或者某群細胞具體的特徵，特別是對於細胞發育、腫瘤微環境、單細胞圖譜繪制方面發揮了關鍵作用。

單細胞轉錄組的平台有很多，常用的有10xGenomics、BD Rhapsody、Fluidigm C1、Bio-Rad等平台，其中10xGenomics單細胞轉錄平台由於其成本優勢和通量優勢，是最常見的一種單細胞解決方案提供商，其在市場上處於絕對優勢。10xGenomics單細胞轉錄組平台能夠一次高效地捕獲100-80,000細胞（一個晶元），1000個細胞的雙細胞率僅為0.9%，是目前最為常用的單細胞捕獲平台。

在這里主要也是介紹基於10xGenomics單細胞轉錄組平台數據進行的後續生信分析以及注意事項。

普通轉錄組（Bulk RNA）是生物組織樣品中在某個時間對應的所有mRNA轉錄情況，通常作為組織或者樣品某個時刻狀態的重要指標，不同的樣品、不同組織、不同物種、不同的處理都會造成mRNA表達情況的改變，從而調控機體的生命狀態或者執行某些細胞功能，相對於蛋白而言，mRNA的穩定性和檢測的便利性，大大促進了轉錄組技術的發展和應用。

「Every cell is unique—it occupies an exclusive position in space, carries distinct errors in its copied genome and is subject to programmed and inced changes in gene expression. Yet most DNA and RNA sequencing is performed on tissue samples or cell populations, in which biological differences between cells can be obscured by averaging or mistaken for technical noise.」 ----Method of the Year 2013(Nature Methods )

但是樣品或者組織的轉錄組是所有細胞的一個轉錄組表達量的平均值，不能反映樣品中所有細胞或者某群細胞的狀態，因此需要對單個細胞的或者某群細胞的轉錄狀態進行深入的研究，這樣將更精細、更准確反映組織的狀態。 如果在進行免疫或者葯物反應研究的時候，可以更精準地針對細胞或者細胞亞群進行免疫治療或者靶向治療，這是精準醫療必要條件。

在思考這個問題之前，我們首先需要考慮的是什麼是單細胞轉錄組？只有了解單細胞轉錄組本質以後，才能更好了解如何去研究？

10xGenomics單細胞轉錄組基本流程如下圖所示，我們最終得到的是一個表達矩陣，此矩陣一般每行為基因，每列為細胞。其實這個矩陣就是每個細胞所有的基因表達情況。

後續10xGenomics單細胞轉錄組的分析幾乎都是基於上述方式得到的表達矩陣進行分析的，不管是聚類還是發育軌跡構建，其實 單細胞轉錄組研究的本質就是研究我們捕獲細胞的的異質性 ，也就是研究細胞與細胞具體有什麼差異，研究樣品中有什麼類型的細胞，這些細胞有什麼差異。

異質性具體如何研究？雖然現在單細胞轉錄組分析的工具和方案有幾百種，就本質來說， 只有兩種研究方法：一種是細胞類型的差異；另外一種是發育軌跡的構建。 現在所有的工具都可以歸類到此兩類。

單細胞轉錄組表達矩陣的獲取
10xGenomics單細胞轉錄組表達矩陣一般是通過 cellranger 軟體獲取，cellranger為10xGenomics官方分析軟體，一般後續高級分析或者重新分析都是基於此矩陣。

一般cellranger資源消耗如下圖所示：

這一篇我們對基本知識進行了介紹，同時講解了如何獲得表達量矩陣。下一篇我們會介紹詳細的單細胞轉錄組亞群分析過程和原理，請大家繼續關注。

參考文獻
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