⑴ 高通量測序分的原理
高通量測序的原理與特色
高通量測序：高通量測序技術是對傳統測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，因此在有些文獻中稱其為下一代測序技術(next generation sequencing)足見其劃時代的改變，同時高通量測序使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序(deep sequencing)。
Illumina公司的新一代測序儀Genome AnalyzerIIx具有高准確性，高通量，高靈敏度，和低運行成本等突出優勢，可以同時完成傳統基因組學研究（測序和注釋）以及功能基因組學 （基因表達及調控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。Illumina Genome AnalyzerIIx是一種基於單分子簇的邊合成邊測序技術，基於專有的可逆終止化學反應原理。測序時將基因組DNA的隨機片段附著到光學透明的玻璃表面（即Flow cell），這些DNA片段經過延伸和橋式擴增後，在Flow cell上形成了數以億計Cluster，每個Cluster是具有數千份相同模板的單分子簇。然後利用帶熒光基團的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過可逆性終止的SBS（邊合成邊測序）技術對待測的模板DNA進行測序。
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http://www.sunbiotech.com.cn/news_view-id3258.htm
⑵ 測序相關知識總結
高通量測序技術（High-throughput sequencing，HTS）是對傳統Sanger測序（稱為一代測序技術）革命性的改變,一次對幾十萬到幾百萬條核酸分子進行序列測定, 因此在有些文獻中稱其為下一代測序技術(next generation sequencing，NGS )足見其劃時代的改變, 同時高通量測序使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能, 所以又被稱為深度測序(Deep sequencing)。
Sanger法測序利用一種DNA聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應構成，每個反應含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，並混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由於ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整，使反應得到一組長幾百至幾千鹼基的鏈終止產物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高解析度變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理後可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。
全基因組重測序是對基因組序列已知的個體進行基因組測序，並在個體或群體水平上進行差異性分析的方法。隨著基因組測序成本的不斷降低，人類疾病的致病突變研究由外顯子區域擴大到全基因組范圍。通過構建不同長度的插入片段文庫和短序列、雙末端測序相結合的策略進行高通量測序，實現在全基因組水平上檢測疾病關聯的常見、低頻、甚至是罕見的突變位點，以及結構變異等，具有重大的科研和產業價值。
de novo測序也稱為從頭測序：其不需要任何現有的序列資料就可以對某個物種進行測序，利用生物信息學分析手段對序列進行拼接，組裝，從而獲得該物種的基因組圖譜。獲得一個物種的全基因組序列是加快對此物種了解的重要捷徑。隨著新一代測序技術的飛速發展，基因組測序所需的成本和時間較傳統技術都大大降低，大規模基因組測序漸入佳境，基因組學研究也迎來新的發展契機和革命性突破。利用新一代高通量、高效率測序技術以及強大的生物信息分析能力，可以高效、低成本地測定並分析所有生物的基因組序列。
外顯子組測序是指利用序列捕獲技術將全基因組外顯子區域DNA捕捉並富集後進行高通量測序的基因組分析方法。外顯子測序相對於基因組重測序成本較低，對研究已知基因的SNP、Indel等具有較大的優勢，但無法研究基因組結構變異如染色體斷裂重組等。
轉錄組學（transcriptomics）是在基因組學後新興的一門學科，即研究特定細胞在某一功能狀態下所能轉錄出來的所有RNA（包括mRNA和非編碼RNA）的類型與拷貝數。Illumina提供的mRNA測序技術可在整個mRNA領域進行各種相關研究和新的發現。mRNA測序不對引物或探針進行設計，可自由提供關於轉錄的客觀和權威信息。研究人員僅需要一次試驗即可快速生成完整的poly-A尾的RNA完整序列信息，並分析基因表達、cSNP、全新的轉錄、全新異構體、剪接位點、等位基因特異性表達和罕見轉錄等最全面的轉錄組信息。簡單的樣品制備和數據分析軟體支持在所有物種中的mRNA測序研究。
Small RNA（micro RNAs、siRNAs和 pi RNAs）是生命活動重要的調控因子，在基因表達調控、生物個體發育、代謝及疾病的發生等生理過程中起著重要的作用。Illumina能夠對細胞或者組織中的全部Small RNA進行深度測序及定量分析等研究。實驗時首先將18-30 nt范圍的Small RNA從總RNA中分離出來，兩端分別加上特定接頭後體外反轉錄做成cDNA再做進一步處理後，利用測序儀對DNA片段進行單向末端直接測序。通過Illumina對Small RNA大規模測序分析，可以從中獲得物種全基因組水平的miRNA圖譜，實現包括新miRNA分子的挖掘，其作用靶基因的預測和鑒定、樣品間差異表達分析、miRNAs聚類和表達譜分析等科學應用。
成熟的microRNA（miRNA）是17~24nt的單鏈非編碼RNA分子，通過與mRNA相互作用影響目標mRNA的穩定性及翻譯，最終誘導基因沉默，調控著基因表達、細胞生長、發育等生物學過程。基於第二代測序技術的microRNA測序，可以一次性獲得數百萬條microRNA序列，能夠快速鑒定出不同組織、不同發育階段、不同疾病狀態下已知和未知的microRNA及其表達差異，為研究microRNA對細胞進程的作用及其生物學影響提供了有力工具。
染色質免疫共沉澱技術（ChromatinImmunoprecipitation，ChIP）也稱結合位點分析法，是研究體內蛋白質與DNA相互作用的有力工具，通常用於轉錄因子結合位點或組蛋白特異性修飾位點的研究。將ChIP與第二代測序技術相結合的ChIP-Seq技術，能夠高效地在全基因組范圍內檢測與組蛋白、轉錄因子等互作的DNA區段。
ChIP-Seq的原理是：首先通過染色質免疫共沉澱技術（ChIP）特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段，並對其進行純化與文庫構建；然後對富集得到的DNA片段進行高通量測序。研究人員通過將獲得的數百萬條序列標簽精確定位到基因組上，從而獲得全基因組范圍內與組蛋白、轉錄因子等互作的DNA區段信息。
CHIRP-Seq( Chromatin Isolation by RNA Purification )是一種檢測與RNA綁定的DNA和蛋白的高通量測序方法。方法是通過設計生物素或鏈霉親和素探針，把目標RNA拉下來以後，與其共同作用的DNA染色體片段就會附在到磁珠上，最後把染色體片段做高通量測序，這樣會得到該RNA能夠結合到在基因組的哪些區域，但由於蛋白測序技術不夠成熟，無法知道與該RNA結合的蛋白。
RNA Immunoprecipitation是研究細胞內RNA與蛋白結合情況的技術，是了解轉錄後調控網路動態過程的有力工具，能幫助我們發現miRNA的調節靶點。這種技術運用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉澱下來，然後經過分離純化就可以對結合在復合物上的RNA進行測序分析。
RIP可以看成是普遍使用的染色質免疫沉澱ChIP技術的類似應用，但由於研究對象是RNA-蛋白復合物而不是DNA-蛋白復合物，RIP實驗的優化條件與ChIP實驗不太相同（如復合物不需要固定，RIP反應體系中的試劑和抗體絕對不能含有RNA酶，抗體需經RIP實驗驗證等等）。RIP技術下游結合microarray技術被稱為RIP-Chip，幫助我們更高通量地了解癌症以及其它疾病整體水平的RNA變化。
CLIP-seq,又稱為HITS-CLIP，即紫外交聯免疫沉澱結合高通量測序(crosslinking-immunprecipitation and high-throughput sequencing), 是一項在全基因組水平揭示RNA分子與RNA結合蛋白相互作用的革命性技術。其主要原理是基於RNA分子與RNA結合蛋白在紫外照射下發生耦聯，以RNA結合蛋白的特異性抗體將RNA-蛋白質復合體沉澱之後，回收其中的RNA片段，經添加接頭、RT-PCR等步驟，對這些分子進行高通量測序，再經生物信息學的分析和處理、總結，挖掘出其特定規律，從而深入揭示RNA結合蛋白與RNA分子的調控作用及其對生命的意義。
什麼是metagenomic（宏基因組）：
Magenomics研究的對象是整個微生物群落。相對於傳統單個細菌研究來說，它具有眾多優勢，其中很重要的兩點：(1)微生物通常是以群落方式共生於某一小生境中，它們的很多特性是基於整個群落環境及個體間的相互影響的，因此做Metagenomics研究比做單個個體的研究更能發現其特性；(2) Metagenomics研究無需分離單個細菌，可以研究那些不能被實驗室分離培養的微生物。
宏基因組是基因組學一個新興的科學研究方向。宏基因組學（又稱元基因組學，環境基因組學，生態基因組學等），是研究直接從環境樣本中提取的基因組遺傳物質的學科。傳統的微生物研究依賴於實驗室培養，元基因組的興起填補了無法在傳統實驗室中培養的微生物研究的空白。過去幾年中，DNA測序技術的進步以及測序通量和分析方法的改進使得人們得以一窺這一未知的基因組科學領域。
10 .什麼是SNP、SNV（單核苷酸位點變異）
單核苷酸多態性singlenucleotide polymorphism，SNP 或單核苷酸位點變異SNV。個體間基因組DNA序列同一位置單個核苷酸變異(替代、插入或缺失)所引起的多態性。不同物種、個體基因組DNA序列同一位置上的單個核苷酸存在差別的現象。有這種差別的基因座、DNA序列等可作為基因組作圖的標志。人基因組上平均約每1000個核苷酸即可能出現1個單核苷酸多態性的變化，其中有些單核苷酸多態性可能與疾病有關，但可能大多數與疾病無關。單核苷酸多態性是研究人類家族和動植物品系遺傳變異的重要依據。在研究癌症基因組變異時，相對於正常組織，癌症中特異的單核苷酸變異是一種體細胞突變（somatic mutation），稱做SNV。
基因組上小片段（>50bp）的插入或缺失，形同SNP/SNV。
基因組拷貝數變異是基因組變異的一種形式，通常使基因組中大片段的DNA形成非正常的拷貝數量。例如人類正常染色體拷貝數是2，有些染色體區域拷貝數變成1或3，這樣，該區域發生拷貝數缺失或增加，位於該區域內的基因表達量也會受到影響。如果把一條染色體分成A-B-C-D四個區域，則A-B-C-C-D/A-C-B-C-D/A-C-C-B-C-D/A-B-D分別發生了C區域的擴增及缺失，擴增的位置可以是連續擴增如A-B-C-C-D也可以是在其他位置的擴增，如A-C-B-C-D。
染色體結構變異是指在染色體上發生了大片段的變異。主要包括染色體大片段的插入和缺失（引起CNV的變化），染色體內部的某塊區域發生翻轉顛換，兩條染色體之間發生重組（inter-chromosome trans-location）等。一般SV的展示利用Circos 軟體。
15.什麼是Segment plication
一般稱為SD區域，串聯重復是由序列相近的一些DNA片段串聯組成。串聯重復在人類基因多樣性的靈長類基因中發揮重要作用。在人類染色體Y和22號染色體上，有很大的SD序列。
既基因型與表型；一般指某些單核苷酸位點變異與表現形式間的關系。
17.什麼是soft-clipped reads
當基因組發生某一段的缺失，或轉錄組的剪接，在測序過程中，橫跨缺失位點及剪接位點的reads回帖到基因組時，一條reads被切成兩段，匹配到不同的區域，這樣的reads叫做soft-clipped reads，這些reads對於鑒定染色體結構變異及外源序列整合具有重要作用。
由於大部分測序得到的reads較短，一個reads能夠匹配到基因組多個位置，無法區分其真實來源的位置。一些工具根據統計模型，如將這類reads分配給reads較多的區域。
21.什麼是Contig N50？
Reads拼接後會獲得一些不同長度的Contigs。將所有的Contig長度相加，能獲得一個Contig總長度。然後將所有的Contigs按照從長到短進行排序，如獲得Contig 1，Contig 2，Contig 3...………Contig 25。將Contig按照這個順序依次相加，當相加的長度達到Contig總長度的一半時，最後一個加上的Contig長度即為Contig N50。舉例：Contig 1+Contig 2+ Contig 3+Contig 4=Contig總長度 1/2時，Contig 4的長度即為Contig N50。Contig N50可以作為基因組拼接的結果好壞的一個判斷標准。值越大，contig越長組裝效果越好，測序效率也就越好了.
給定一組具有其自身長度的重疊群，L50計數被定義為長度總和占基因組大小一半的重疊群的最小數量。
21.1 什麼是Scaffold N50？
Scaffold N50與Contig N50的定義類似。Contigs拼接組裝獲得一些不同長度的Scaffolds。將所有的Scaffold長度相加，能獲得一個Scaffold總長度。然後將所有的Scaffolds按照從長到短進行排序，如獲得Scaffold 1，Scaffold 2，Scaffold 3...………Scaffold 25。將Scaffold按照這個順序依次相加，當相加的長度達到Scaffold總長度的一半時，最後一個加上的Scaffold長度即為Scaffold N50。舉例：Scaffold 1+Scaffold 2+ Scaffold 3 +Scaffold 4 +Scaffold 5=Scaffold總長度 1/2時，Scaffold 5的長度即為Scaffold N50。Scaffold N50可以作為基因組拼接的結果好壞的一個判斷標准。
22.什麼是測序深度和覆蓋度？
測序深度是指測序得到的總鹼基數與待測基因組大小的比值。假設一個基因大小為2M，測序深度為10X，那麼獲得的總數據量為20M。覆蓋度是指測序獲得的序列占整個基因組的比例。由於基因組中的高GC、重復序列等復雜結構的存在，測序最終拼接組裝獲得的序列往往無法覆蓋有所的區域，這部分沒有獲得的區域就稱為Gap。例如一個細菌基因組測序，覆蓋度是98%，那麼還有2%的序列區域是沒有通過測序獲得的。
RPKM,Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads, is defined in thisway [Mortazavi etal., 2008]: 每1百萬個map上的reads中map到外顯子的每1K個鹼基上的reads個數。 假如有1百萬個reads映射到了人的基因組上，那麼具體到每個外顯子呢，有多少映射上了呢，而外顯子的長度不一，那麼每1K個鹼基上又有多少reads映射上了呢，這大概就是這個RPKM的直觀解釋。
如果對應特定基因的話，那麼就是每1000000 mapped到該基因上的reads中每kb有多少是mapped到該基因上的exon的read Total exon reads:This is the number in the column with header Total exonreads in the row for the gene. This is the number of reads that have beenmapped to a region in which an exon is annotated for the gene or across theboundaries of two exons or an intron and an exon for an annotated transcript ofthe gene. For eukaryotes, exons and their internal relationships are defined byannotations of type mRNA.映射到外顯子上總的reads個數。這個是映射到某個區域上的reads個數，這個區域或者是已知注釋的基因或者跨兩個外顯子的邊界或者是某個基因已經注釋的轉錄本的內含子、外顯子。對於真核生物來說，外顯子和它們自己內部的關系由某類型的mRNA來注釋。
Exonlength: This is the number in the column with the header Exon length inthe row for the gene, divided by 1000. This is calculated as the sum of thelengths of all exons annotated for the gene. Each exon is included only once inthis sum, even if it is present in more annotated transcripts for the gene.Partly overlapping exons will count with their full length, even though theyshare the same region.外顯子的長度。計算時，計算所有某個基因已注釋的所有外顯子長度的總和。即使某個基因以多種注釋的轉錄本呈現，這個外顯子在求和時只被包含一次。即使部分重疊的外顯子共享相同的區域，重疊的外顯子以其總長來計算。 Mapped reads: The sum of all the numbers in the column with header Totalgene reads. The Total gene reads for a gene is the total number ofreads that after mapping have been mapped to the region of the gene. Thus thisincludes all the reads uniquely mapped to the region of the gene as well asthose of the reads which match in more places (below the limit set in thedialog in figure18.110) that have been allocated tothis gene's region. A gene's region is that comprised of the flanking regions(if it was specified in figure 18.110), the exons, the introns andacross exon-exon boundaries of all transcripts annotated for the gene. Thus,the sum of the total gene reads numbers is the number of mapped reads for thesample (you can find the number in the RNA-Seq report).map的reads總和。映射到某個基因上的所有reads總數。因此這包含所有的唯一映射到這個區域上的reads。
舉例：比如對應到該基因的read有1000個，總reads個數有100萬，而該基因的外顯子總長為5kb，那麼它的RPKM為：10 9*1000(reads個數)/10 6(總reads個數) 5000(外顯子長度)=200或者：1000(reads個數)/1(百萬) 5(K)=200這個值反映基因的表達水平。
FPKM(fragments per kilobase of exon per million fragments mapped). FPKM與RPKM計算方法基本一致。不同點就是FPKM計算的是fragments，而RPKM計算的是reads。Fragment比read的含義更廣，因此FPKM包含的意義也更廣，可以是pair-end的一個fragment，也可以是一個read。
什麼是轉錄本重構
用測序的數據組裝成轉錄本。有兩種組裝方式：1，de-novo構建； 2，有參考基因組重構。其中de-novo組裝是指在不依賴參考基因組的情況下，將有overlap的reads連接成一個更長的序列，經過不斷的延伸，拼成一個個的contig及scaffold。常用工具包括velvet，trans-ABYSS，Trinity等。有參考基因組重構，是指先將read貼回到基因組上，然後在基因組通過reads覆蓋度，junction位點的信息等得到轉錄本，常用工具包括scripture、cufflinks。
什麼是genefusion
將基因組位置不同的兩個基因中的一部分或全部整合到一起，形成新的基因，稱作融合基因，或嵌合體基因。該基因有可能翻譯出融合或嵌合體蛋白。
什麼是表達譜
基因表達譜(geneexpression profile)：指通過構建處於某一特定狀態下的細胞或組織的非偏性cDNA文庫,大規模cDNA測序,收集cDNA序列片段、定性、定量分析其mRNA群體組成,從而描繪該特定細胞或組織在特定狀態下的基因表達種類和豐度信息,這樣編製成的數據表就稱為基因表達譜
什麼是功能基因組學
功能基因組學（Functuionalgenomics）又往往被稱為後基因組學（Postgenomics），它利用結構基因組所提供的信息和產物，發展和應用新的實驗手段，通過在基因組或系統水平上全面分析基因的功能，使得生物學研究從對單一基因或蛋白質得研究轉向多個基因或蛋白質同時進行系統的研究。這是在基因組靜態的鹼基序列弄清楚之後轉入對基因組動態的生物學功能學研究。研究內容包括基因功能發現、基因表達分析及突變檢測。基因的功能包括：生物學功能，如作為蛋白質激酶對特異蛋白質進行磷酸化修飾；細胞學功能，如參與細胞間和細胞內信號傳遞途徑；發育上功能，如參與形態建成等。採用的手段包括經典的減法雜交，差示篩選，cDNA代表差異分析以及mRNA差異顯示等，但這些技術不能對基因進行全面系統的
分析，新的技術應運而生，包括基因表達的系統分析（serial analysis of gene expression,SAGE），cDNA微陣列（cDNA microarray），DNA 晶元（DNA chip）和序列標志片段顯示（sequence tagged fragmentsdisplay。
什麼是比較基因組學
比較基因組學(ComparativeGenomics)是基於基因組圖譜和測序基礎上，對已知的基因和基因組結構進行比較，來了解基因的功能、表達機理和物種進化的學科。利用模式生物基因組與人類基因組之間編碼順序上和結構上的同源性，克隆人類疾病基因，揭示基因功能和疾病分子機制，闡明物種進化關系，及基因組的內在結構。
什麼是表觀遺傳學
表觀遺傳學是研究基因的核苷酸序列不發生改變的情況下，基因表達了可遺傳的變化的一門遺傳學分支學科。表觀遺傳的現象很多，已知的有DNA甲基化（DNAmethylation），基因組印記（genomicimpriting），母體效應（maternaleffects），基因沉默（genesilencing），核仁顯性，休眠轉座子激活和RNA編輯（RNA editing）等。
什麼是計算生物學
計算生物學是指開發和應用數據分析及理論的方法、數學建模、計算機模擬技術等。當前，生物學數據量和復雜性不斷增長，每14個月基因研究產生的數據就會翻一番，單單依靠觀察和實驗已難以應付。因此，必須依靠大規模計算模擬技術，從海量信息中提取最有用的數據。
什麼是基因組印記
基因組印記(又稱遺傳印記)是指基因根據親代的不同而有不同的表達。印記基因的存在能導致細胞中兩個等位基因的一個表達而另一個不表達。基因組印記是一正常過程，此現象在一些低等動物和植物中已發現多年。印記的基因只佔人類基因組中的少數，可能不超過5%，但在胎兒的生長和行為發育中起著至關重要的作用。基因組印記病主要表現為過度生長、生長遲緩、智力障礙、行為異常。目前在腫瘤的研究中認為印記缺失是引起腫瘤最常見的遺傳學因素之一。
什麼是基因組學
基因組學（英文genomics），研究生物基因組和如何利用基因的一門學問。用於概括涉及基因作圖、測序和整個基因組功能分析的遺傳學分支。該學科提供基因組信息以及相關數據系統利用，試圖解決生物，醫學，和工業領域的重大問題。
什麼是DNA甲基化
DNA甲基化是指在DNA甲基化轉移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共價鍵結合一個甲基基團。正常情況下，人類基因組「垃圾」序列的CpG二核苷酸相對稀少，並且總是處於甲基化狀態，與之相反，人類基因組中大小為100—1000 bp左右且富含CpG二核苷酸的CpG島則總是處於未甲基化狀態，並且與56％的人類基因組編碼基因相關。人類基因組序列草圖分析結果表明，人類基因組CpG島約為28890個，大部分染色體每1 Mb就有5—15個CpG島，平均值為每Mb含10．5個CpG島，CpG島的數目與基因密度有良好的對應關系[9]。由於DNA甲基化與人類發育和腫瘤疾病的密切關系，特別是CpG島甲基化所致抑癌基因轉錄失活問題，DNA甲基化已經成為表觀遺傳學和表觀基因組學的重要研究內容。
什麼是基因組注釋？
基因組注釋(Genomeannotation) 是利用生物信息學方法和工具,對基因組所有基因的生物學功能進行高通量注釋,是當前功能基因組學研究的一個熱點。基因組注釋的研究內容包括基因識別和基因功能注釋兩個方面。基因識別的核心是確定全基因組序列中所有基因的確切位置。
什麼是Q30？
Q30是指一個鹼基的識別可靠性等於99.9%，或者說出錯可能性是0.1%。Q20則是指鹼基識別的可靠性等於99%。
Q30數據量是指一批數據中，質量高於等於Q30的數據的量的總和。
測序數據的PF data/PF reads是什麼意思？
PF是pass filter的意思。也就是質量合格的意思。Illumina的測儀序會自動地對一個read(序列)的質量可靠性進行打分。
對於前25個鹼基中的是否有兩個鹼基的識別可靠性低於0.6，是PF的判斷標准。這句話翻譯成較容易理解的話: 就是前25個鹼基中，如果低質量的數據有2個或更多，則這條read被判定為不合格，PF就不通過。反之，則質檢通過。
PF是國際公認的質檢標准。
你們給的數據是什麼質量的？
對於哺乳動物基因組重測序、外顯子測序，我們保證數據質量是Q30的比例高於80%。對於mRNA測序，smRNA測序，我們保證對照Lane的數據質是Q30的比例高於80%。
一般情況下:
哺乳動物基因組重測序、外顯子測序，GC比例在40%左右，Q30的比例是80~95%
RNA-seq，GC比例在50%左右，Q30的比例是~80%。如果Poly(A)特別多的情況下，Q30會更低一些
SmRNA-seq，因為有許多的read讀通之後，只剩下一串的A，質量會更低，我們的實驗結果%Q30在70~75%
測序中的Duplication是什麼，如何避免，一般會有多少Duplication?
所謂Duplication是指起始與終止位置完全一致的片段。
引起Duplication的主要原因是因為在測序中有PCR過程，來源於同一個DNA片段PCR的產物被重復測序，就會是Duplication。次要原因是正巧兩個片段的頭和尾的位置完全一致。
一般通過控制PCR的循環數來控制Duplication。我們一般控制PCR的循環次數在10~12個循環。
在葯明康德外顯子測序中，如果用illumina的捕獲試劑盒Duplication的比例約為10%，如果用Nimblegen的捕獲試劑盒Duplication的比例波動較大，在5~50%范圍 ，平均為30%。
在RNA-seq中，Duplication的比例約為40%。RNA-seq中，因為高豐度的mRNA集中在幾個基因上，集中度很高，所以Duplication的比例也就高。
測序的插入片段一般是多長？
測序的插入片段一般是100bp到600bp.
因為Hiseq測序過程中有一個橋式PCR的過程。如果插入片段過長，測橋式PCR產生的Cluster就會太大，而且光強也會減弱。所以插入片段的長度是有限制的。
PhiX文庫有什麼用？
PhiX文庫是一種用病毒基因組做的文庫。其基因序列已精確知曉，GC比例約為40%，與人類、哺乳類的基因組的GC比例接近。其基因序列又與人類的基因序列相去甚遠，在與哺乳類基因組一些測序時，可以輕松地通過基因序列比對而將之去除。
在測四種鹼基不平衡（A、G、C、T四種鹼基的含量遠遠偏離25%）的樣本時，可以加入大量的PhiX文庫，以部分抵消樣本的不平衡性。例如ChIPed DNA測序，或者亞硫酸氫鹽處理過的DNA文庫，或者擴增子測序（PCR樣測序），都可以加入PhiX，以部分彌補鹼基不平衡性。
也可以少量地加入樣本，以作為control library來驗證測序質量。
⑶ 高通量測序技術 中的「高通量」 是什麼意思
高通量測序技術（High-throughput sequencing）又稱「下一代」測序技術（"Next-generation" sequencing technology），以能一次並行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標志。
高通量大概意思就是一次能進行多個樣品。
⑷ 小白的生信筆記（1）——高通量測序的一些基礎知識
1977年，英國化學家桑格（Frederick Sanger）發明了雙脫氧鏈終止法，這個技術以及吉爾伯特（W.Gilbert)發明的化學降解法被稱為一代測序技術。 Sanger法測序利用一種DNA聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應構成，每個反應含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，並混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由於ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整，使反應得到一組長幾百至幾千鹼基的鏈終止產物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高解析度變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理後可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。
不同於一代測序，NGS採用的是邊合成邊測序的策略，主要的技術路線以Roche公司的454技術、illumina公司的Solexa，Hiseq技術和ABI公司的Solid技術為代表。為了增強測序准確性，需要對同一模板通過PCR擴增多個拷貝來矯正偏差值。因此整個測序分為PCR擴增（一種可以快速復制大量產生相同DNA片段的技術）和測序兩個步驟。但是PCR過程會一定程度增加系統的錯誤率，並且帶來的錯誤具有偏向性，這也是二代技術存在的問題之一。
illumina公司主打產品MiSeq測序儀、HiSeq X Ten測序儀、Miseq FGx測序儀、NextSeq 500/550桌上型測序儀、MiniSeq台式測序儀等，涵蓋了不同的應用場景的不同需求。
第二代測序技術測序平台和測序成本，測序費用，花費時間，建庫等實驗技術難度，錯誤率以及讀長（150-400bp），分析工作的體量，對於滿足更高的科研需求和在醫療診斷中的普及都是不小的阻礙。其PCR過程帶來的誤差和偏好或成為其在醫療診斷大規模運用的阻礙。三代技術主要解決二代測長較短的問題。
PacBio 的SMRT 技術，LifeTechnologies 的 IonTorrent 半導體測序技術和 Oxford NanoporeTechnologies 納米孔單分子測序技術是三代測序技術的代表。
PacBio SMR
PacBio的SMRT仍然運用邊合成邊測序的策略，但是其超強活性的DNA聚合酶是實現超長讀長（~1000bp）的關鍵。反應在納米管中進行，方便達到超高通量的目的。利用的是ZMW（零模波導孔）原理在超小的納米孔中區別熒光信號的背景。其測序速度很快，每秒約10個dNTP。目前的問題在於測序的錯誤率太高（81-83%），這也是大多數三代技術需要解決的共同問題。不過錯誤隨機，幾乎沒有偏向性，為其通過矯正來減少錯誤率提供了可能。目前這個技術已經投入市場。
Oxford Nanopre MinlON
而Nanopore的MinlON測序儀應用納米孔單分子技術，這是一種基於電信號的測序技術，比起其他的光信號測序技術來說是一個革新。技術核心是一種特殊的內有分子接頭的納米孔，由蛋白質小孔嵌在人造膜上形成。膜兩側加上電壓，使電流通過小孔。當不同的DNA鹼基通過納米孔時，其對電流的阻礙作用短暫地影響流過納米孔的電流強度，不同鹼基影響的程度不同，這種差異被靈敏的電子設備捕捉從而鑒定所通過的鹼基種類。這種技術的優點很多，讀長長（大約在幾十kb，甚至100 kb），錯誤隨機，而不是聚集在讀取的兩端，通量較高，該公司也在努力簡化樣品制備流程。理論上運用這個技術RNA也可以直接測序，還能檢測到甲基化的胞嘧啶。不過不能實現理想的錯誤率控制，或成為其投入市場的阻礙。
LifeTechnologies IonTorrent
IonTorrent 使用半導體晶元，在晶元的微孔中固定DNA鏈。依次加入AGCT的鹼基，DNA合成時如果鹼基可以結合到模板鏈則會釋放一個氫離子。這個氫離子導致局部HP值發生變化。離子感測器檢測到PH 變化後，便將化學信號轉變為序列信息。而如果DNA 鏈有兩個連續的相同鹼基，則記錄到的信號翻倍，從而將其識別。如果不匹配，則記錄不到變化。這種技術由於不涉及熒光激發和拍照，則運行時間被大大縮減（僅數小時），無需激光光源，光學系統和照相系統，也不需要熒游標記，規避了這些環節帶來的誤差。但是其讀長不算太長（200bp），並且當遭遇多個連續的相同鹼基時，強烈的PH變化會帶來誤差。
de novo測序也稱為從頭測序：其不需要任何現有的序列資料就可以對某個物種進行測序，利用生物信息學分析手段對序列進行拼接，組裝，從而獲得該物種的基因組圖譜。
外顯子組測序是指利用序列捕獲技術將全基因組外顯子區域DNA捕捉並富集後進行高通量測序的基因組分析方法。外顯子測序相對於基因組重測序成本較低，對研究已知基因的SNP、Indel等具有較大的優勢，但無法研究基因組結構變異如染色體斷裂重組等。
Magenomics研究的對象是整個微生物群落。相對於傳統單個細菌研究來說，它具有眾多優勢，其中很重要的兩點：(1)微生物通常是以群落方式共生於某一小生境中，它們的很多特性是基於整個群落環境及個體間的相互影響的，因此做Metagenomics研究比做單個個體的研究更能發現其特性；(2) Metagenomics研究無需分離單個細菌，可以研究那些不能被實驗室分離培養的微生物。
單核苷酸多態性singlenucleotide polymorphism，SNP 或單核苷酸位點變異SNV。個體間基因組DNA序列同一位置單個核苷酸變異(替代、插入或缺失)所引起的多態性。不同物種、個體基因組DNA序列同一位置上的單個核苷酸存在差別的現象。有這種差別的基因座、DNA序列等可作為基因組作圖的標志。人基因組上平均約每1000個核苷酸即可能出現1個單核苷酸多態性的變化，其中有些單核苷酸多態性可能與疾病有關，但可能大多數與疾病無關。單核苷酸多態性是研究人類家族和動植物品系遺傳變異的重要依據。在研究癌症基因組變異時，相對於正常組織，癌症中特異的單核苷酸變異是一種體細胞突變，稱做SNV。
基因組上小片段（<50bp）的插入或缺失，形同SNP/SNV。
當基因組發生某一段的缺失，或轉錄組的剪接，在測序過程中，橫跨缺失位點及剪接位點的reads回帖到基因組時，一條reads被切成兩段，匹配到不同的區域，這樣的reads叫做soft-clipped reads，這些reads對於鑒定染色體結構變異及外源序列整合具有重要作用。
由於大部分測序得到的reads較短，一個reads能夠匹配到基因組多個位置，無法區分其真實來源的位置。一些工具根據統計模型，如將這類reads分配給reads較多的區域。
拼接軟體基於reads之間的overlap區，拼接獲得的序列稱為Contig（重疊群）。
基因組de novo測序，通過reads拼接獲得Contigs後，往往還需要構建454 Paired-end庫或Illumina Mate-pair庫，以獲得一定大小片段（如3Kb、6Kb、10Kb、20Kb）兩端的序列。基於這些序列，可以確定一些Contig之間的順序關系，這些先後順序已知的Contigs組成Scaffold。
Reads拼接後會獲得一些不同長度的Contigs。將所有的Contig長度相加，能獲得一個Contig總長度。然後將所有的Contigs按照從長到短進行排序，如獲得Contig 1，Contig 2，Contig 3...…Contig 25。將Contig按照這個順序依次相加，當相加的長度達到Contig總長度的一半時，最後一個加上的Contig長度即為Contig N50。舉例：Contig 1+Contig 2+ Contig 3+Contig 4=Contig總長度*1/2時，Contig 4的長度即為Contig N50。Contig N50可以作為基因組拼接的結果好壞的一個判斷標准。
Scaffold N50與Contig N50的定義類似。Contigs拼接組裝獲得一些不同長度的Scaffolds。將所有的Scaffold長度相加，能獲得一個Scaffold總長度。然後將所有的Scaffolds按照從長到短進行排序，如獲得Scaffold 1，Scaffold 2，Scaffold 3...……Scaffold 25。將Scaffold按照這個順序依次相加，當相加的長度達到Scaffold總長度的一半時，最後一個加上的Scaffold長度即為Scaffold N50。舉例：Scaffold 1+Scaffold 2+ Scaffold 3 +Scaffold 4 +Scaffold 5=Scaffold總長度*1/2時，Scaffold 5的長度即為Scaffold N50。Scaffold N50可以作為基因組拼接的結果好壞的一個判斷標准。
測序深度是指測序得到的總鹼基數與待測基因組大小的比值。假設一個基因大小為2M，測序深度為10X，那麼獲得的總數據量為20M。覆蓋度是指測序獲得的序列占整個基因組的比例。由於基因組中的高GC、重復序列等復雜結構的存在，測序最終拼接組裝獲得的序列往往無法覆蓋有所的區域，這部分沒有獲得的區域就稱為Gap。例如一個細菌基因組測序，覆蓋度是98%，那麼還有2%的序列區域是沒有通過測序獲得的。
用測序的數據組裝成轉錄本。有兩種組裝方式：1，de-novo構建； 2，有參考基因組重構。其中de-novo組裝是指在不依賴參考基因組的情況下，將有overlap的reads連接成一個更長的序列，經過不斷的延伸，拼成一個個的contig及scaffold。常用工具包括velvet，trans-ABYSS，Trinity等。有參考基因組重構，是指先將read回貼到基因組上，然後在基因組通過reads覆蓋度，junction位點的信息等得到轉錄本，常用工具包括scripture、cufflinks。
比較基因組學(ComparativeGenomics)是基於基因組圖譜和測序基礎上，對已知的基因和基因組結構進行比較，來了解基因的功能、表達機理和物種進化的學科。利用模式生物基因組與人類基因組之間編碼順序上和結構上的同源性，克隆人類疾病基因，揭示基因功能和疾病分子機制，闡明物種進化關系，及基因組的內在結構
Q30是指一個鹼基的識別可靠性等於99.9%，或者說出錯可能性是0.1%。Q20則是指鹼基識別的可靠性等於99%。Q30數據量是指一批數據中，質量高於等於Q30的數據的量的總和。
PF是pass filter的意思。也就是質量合格的意思。Illumina的測儀序會自動地對一個read(序列)的質量可靠性進行打分。對於前25個鹼基中的是否有兩個鹼基的識別可靠性低於0.6，是PF的判斷標准。這句話翻譯成較容易理解的話: 就是前25個鹼基中，如果低質量的數據有2個或更多，則這條read被判定為不合格，PF就不通過。反之，則質檢通過。
PF是國際公認的質檢標准。對於哺乳動物基因組重測序、外顯子測序，我們保證數據質量是Q30的比例高於80%。對於mRNA測序，smRNA測序，我們保證對照Lane的數據質量是Q30的比例高於80%。
一般情況下:
哺乳動物基因組重測序、外顯子測序，GC比例在40%左右，Q30的比例是80~95%；
RNA-seq，GC比例在50%左右，Q30的比例是~80%。如果Poly(A)特別多的情況下，Q30會更低一些；
SmRNA-seq，因為有許多的read讀通之後，只剩下一串的A，質量會更低，我們的實驗結果%Q30在70~75%。
Illumina的測序儀的數據產量高，數據質量也是最高的。因為採用帶終止基團的熒光dNTP，所以在測Homopolyer（鹼基同聚物，例如一串4個T：TTTT）等的時候，不會產生移碼錯讀。
Roche 454採用的是pyrosequencing的測序原理，通過水解DNA全成過程中所產生的焦磷，放出光，通過測這光來讀出序列。優點是讀長最長。但是數據產量是最低的。
Ion Torrent，包括PGM和Proton，採用測量DNA合成過程中所釋放的氫離子引起的PH值的變化，來得到序列。優點是速度最快，上機前約3~4天的時間，上機只要2~4個小時。
SOLID採用的是雜交，連接反應，再測熒光的方法。因為雜交，所以速度慢，測長較短。現在事實上已被淘汰。
PacBio是三代測序，也就是單分子測序。目前的情況是測序長度可以在1個KB以上，而且可以測出DNA序列的修飾情況。但是其缺點在於測序的准確度很低，目前的測序准確度只有每個鹼基80~90%。另一方面通量較小，一次讀7萬條reads.
部分參考：https://www.jianshu.com/p/acd38ee4b7a1
1977年，英國化學家桑格（Frederick Sanger）發明了雙脫氧鏈終止法，這個技術以及吉爾伯特（W.Gilbert)發明的化學降解法被稱為一代測序技術。Sanger曾經在1958年及1980年兩度獲得諾貝爾化學獎，是第四位兩度獲得諾貝爾獎，以及唯一獲得兩次化學獎的人。其第一次獲獎是憑借定序胰島素的氨基酸序列，證明蛋白質具有明確構造，而第二次獲獎就是因為其雙脫氧鏈終止法——Sanger法的發明。利用這個技術他成功測定了Φ-X174噬菌體（Phage Φ-X174）的基因組序列。Sanger也是一個傳奇的大科學家，現在基因組研究中舉足輕重的桑格研究院（Sanger Institute）便是這位大牛一手建立的。
第一代測序技術的特點是測序讀長可達1000bp，准確性高達99.999%，但測序成本高，通量低等方面的缺點，嚴重影響了其真正大規模的應用。但由於高精度，現今一代測序仍然是基因檢測的金標准，也是對新一代測序結果進行評估驗證的主要手段。而在當時，正是一代測序技術使得基因組的研究在當時成為了可能，浩浩盪盪的人類基因組計劃即將轟轟烈烈的展開。1977年，英國化學家桑格（Frederick Sanger）發明了雙脫氧鏈終止法，這個技術以及吉爾伯特（W.Gilbert)發明的化學降解法被稱為一代測序技術。Sanger曾經在1958年及1980年兩度獲得諾貝爾化學獎，是第四位兩度獲得諾貝爾獎，以及唯一獲得兩次化學獎的人。其第一次獲獎是憑借定序胰島素的氨基酸序列，證明蛋白質具有明確構造，而第二次獲獎就是因為其雙脫氧鏈終止法——Sanger法的發明。利用這個技術他成功測定了Φ-X174噬菌體（Phage Φ-X174）的基因組序列。Sanger也是一個傳奇的大科學家，現在基因組研究中舉足輕重的桑格研究院（Sanger Institute）便是這位大牛一手建立的。
第一代測序技術的特點是測序讀長可達1000bp，准確性高達99.999%，但測序成本高，通量低等方面的缺點，嚴重影響了其真正大規模的應用。但由於高精度，現今一代測序仍然是基因檢測的金標准，也是對新一代測序結果進行評估驗證的主要手段。而在當時，正是一代測序技術使得基因組的研究在當時成為了可能，浩浩盪盪的人類基因組計劃即將轟轟烈烈的展開。
⑸ 什麼是高通量測序
高通量測序技術（High-throughput sequencing）又稱「下一代」測序技術（"Next-generation" sequencing technology），以能一次並行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標志。
根據發展歷史、影響力、測序原理和技術不同等，主要有以下幾種：大規模平行簽名測序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆（Polony Sequencing）、454焦磷酸測序（454 pyrosequencing）、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、離子半導體測序（Ion semiconctor sequencing）、DNA 納米球測序 （DNA nanoball sequencing）等。
高通量測序技術是對傳統測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，因此在有些文獻中稱其為下一代測序技術(next generation sequencing)足見其劃時代的改變，同時高通量測序使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序(deep sequencing)。
自從2005年454 Life Sciences公司（2007年該公司被Roche正式收購）推出了454 FLX焦磷酸測序平台（454 FLX pyrosequencing platform）以來，因為他們的拳頭產品毛細管陣列電泳測序儀系列（series capillary array electrophoresis sequencing machines）遇到了兩個強有力的競爭對手，曾推出過3730xl DNA測序儀（3730xl DNA Analyzer）的Applied BioSystem（ABI）這家一直占據著測序市場最大份額的公司的領先地位就開始動搖了，一個就是羅氏公司(Roche)的454 測序儀(Roch GS FLX sequencer)，，另一個就是2006年美國Illumina公司推出的Solexa基因組分析平台（Genome Analyzer platform），為此，2007年ABI公司推出了自主研發的SOLiD 測序儀(ABI SOLiD sequencer)。這三個測序平台即為目前高通量測序平台的代表
⑹ 這些高通量測序名詞你都知道嗎
重新測序的意思么?也對，因為基因組序列已知啦，但是由於個體的不同就有了差異性，所以需要對不同的個體進行測序哦，並且在此的基礎上，對個體或者群體的差異性進行分析。全基因組重測序的個體，通過序列比對，可以找到大量的單核苷酸多態性位點（SNP），插入缺失位點（InDel，Insertion/Deletion）、結構變異位點（SV，Structure Variation）位點和拷貝數變異位點（CNV， number variation)。然後經過注釋，就能得到很多很多有用的信息，具有辣么辣么大（比我的臉大很多）的科研和產業價值。她的英文名叫英文名為Genome Re-sequencing哦。
一看，就不是英語。一查，原來是拉丁文。也叫從頭測序（這多好，通俗易懂。）牛逼的是不要任何現有的序列資料就可以對某個物種進行測序，通過生物信息學分析手段對序列進行拼接，組裝，就可以獲得該物種的基因圖譜了。嗷~~厲害了。所以我們一猜他就是應用於從頭解析未知物種的基因組序列、基因組成、進化特點等
顧名思義，它就是通過序列捕獲技術將全基因組外顯子區域DNA捕捉並富集後進行高通量測序的基因組分析方法。因為外顯子相對少啊，所以成本低啊，對研究已知基因的SNP、Indel等具有較大的優勢，但無法研究基因組結構變異如染色體斷裂重組等。一會兒我告訴你啥叫SNP、Indel、基因組結構變異噻。
轉錄組測序技術，就是把mRNA,smallRNA,and NONcoding RNA等或者其中一些用高通量測序技術把它們的序列測出來。反映出它們的表達水平。
Illumina公司提供的mRNA測序技術可在整個mRNA領域進行各種相關研究和新的發現。mRNA測序不對引物或探針進行設計，可自由提供關於轉錄的客觀和權威信息。
研究人員僅需要一次試驗即可快速生成完整的poly-A尾的RNA完整序列信息，並分析基因表達、cSNP、全新的轉錄、全新異構體、剪接位點、等位基因特異性表達和罕見轉錄等最全面的轉錄組信息。簡單的樣品制備和數據分析軟體支持在所有物種中的mRNA測序研究
從前有三個人micro RNAs、siRNAs和 pi RNAs，他們都叫Small RNA（和諧創造美好未來，三人用一名兒也是很可以），他們是生命活動重要的調控因子，在基因表達調控、生物個體發育、代謝及疾病的發生等生理過程中起著重要的作用。
Illumina能夠對細胞或者組織中的全部Small RNA進行深度測序及定量分析等研究。
實驗時首先將18-30 nt范圍的Small RNA從總RNA中分離出來，兩端分別加上特定接頭後體外反轉錄做成cDNA再做進一步處理後，利用測序儀對DNA片段進行單向末端直接測序。通過Illumina對Small RNA大規模測序分析，可以從中獲得物種全基因組水平的miRNA圖譜，實現包括新miRNA分子的挖掘，其作用靶基因的預測和鑒定、樣品間差異表達分析、miRNAs聚類和表達譜分析等科學應用。
Assay for Transposase Accessible Chromatin using sequencing，簡稱ATAC-seq。即運用測序手段研究轉座酶可接近的染色質區域的實驗。關鍵詞：測序，轉座酶可接近染色質，轉座酶能接近的區域，也就是處於開放狀態的區域，這也是本實驗的關鍵所在，測序和染色質開放區域。
核小體連接緻密的地方，轉座酶不能進入，而鬆散的區域，轉座酶能夠進入並切割下暴露的DNA並同時連接上特異性的adapters，連接上adapters的DNA片段被分離出來，用於二代測序。因此，ATAC-seq得到的，是全基因度尺度上處於開放狀態的染色質區域。
獲得了開放區域能幹啥，預測上面結合的轉錄因子啊！
ATAC-seq概念來自於 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3959825/
將ChIP與第二代測序技術相結合的ChIP-Seq技術，能夠高效地在全基因組范圍內檢測與組蛋白、轉錄因子等互作的DNA區段。
原理如→：首先通過染色質免疫共沉澱技術（ChIP）特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段，並對其進行純化與文庫構建；
然後對富集得到的DNA片段進行高通量測序。研究人員通過將獲得的數百萬條序列標簽精確定位到基因組上，
從而獲得全基因組范圍內與組蛋白、轉錄因子等互作的DNA區段信息。
能幹下面這些事：
（1）判斷DNA鏈的某一特定位置會出現何種組蛋白修飾；
（2）檢測RNA polymerase II及其它反式因子在基因組上結合位點的精確定位；
（3）研究組蛋白共價修飾與基因表達的關系；
（4）CTCF轉錄因子研究。
ATAC-Seq與ChIP-Seq的不同的是ATAC-Seq是全基因組范圍內檢測染色質的開放程度，可以得到全基因組范圍內的蛋白質可能結合的位點信息，一般用於不知道特定的轉錄因子，用此方法與其他方法結合篩查感興趣的特定調控因子；但是ChIP-Seq是明確知道感興趣的轉錄因子是什麼，根據感興趣的轉錄因子設計抗體去做ChIP實驗拉DNA，驗證感興趣的轉錄因子是否與DNA存在相互作用。
RNA Immunoprecipitation，是研究細胞內RNA與蛋白結合情況的技術，是了解轉錄後調控網路動態過程的有力工具，能幫助我們發現miRNA的調節靶點。
這種技術運用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉澱下來，然後經過分離純化就可以對結合在復合物上的RNA進行測序分析。
它對象（研究對象，不是女朋友！）是RNA-蛋白復合物不是DNA-蛋白復合物。
RIP實驗的優化條件與ChIP實驗不太相同（如復合物不需要固定，RIP反應體系中的試劑和抗體絕對不能含有RNA酶，抗體需經RIP實驗驗證等等）。RIP技術下游結合microarray技術被稱為RIP-Chip，
幫助我們更高通量地了解癌症以及其它疾病整體水平的RNA變化。
(2) Metagenomics研究不需要！不需要！不需要分離單個細菌，所以可以研究那些不能被實驗室分離培養的微生物。
下面念經模式：
宏基因組是基因組學一個新興的科學研究方向。宏基因組學（又稱元基因組學，環境基因組學，生態基因組學等），是研究直接從環境樣本中提取的基因組遺傳物質的學科。傳統的微生物研究依賴於實驗室培養，元基因組的興起填補了無法在傳統實驗室中培養的微生物研究的空白。過去幾年中，DNA測序技術的進步以及測序通量和分析方法的改進使得人們得以一窺這一未知的基因組科學領域。
一般稱為SD區域，串聯重復是由序列相近的一些DNA片段串聯組成。
串聯重復在人類基因多樣性的靈長類基因中發揮重要作用。
在人類染色體Y和22號染色體上，有很大的SD序列。
在測序過程中，橫跨缺失位點及剪接位點的reads回帖到基因組時，一條reads被切成兩段，匹配到不同的區域，
這樣的reads叫做soft-clipped reads
一些工具根據統計模型，如將這類reads分配給reads較多的區域
1.拼接軟體基於reads之間的overlap區，拼接獲得的序列稱為Contig（重疊群）。
2.Reads拼接後會獲得一些不同長度的Contigs。將所有的Contig長度相加，能獲得一個Contig總長度。然後將所有的Contigs按照從長到短進行排序，如獲得Contig 1，Contig 2，Contig 3...………Contig 25。將Contig按照這個順序依次相加，當相加的長度達到Contig總長度的一半時，最後一個加上的Contig長度即為Contig N50。舉例：Contig 1+Contig 2+ Contig 3+Contig 4=Contig總長度*1/2時，Contig 4的長度即為Contig N50。Contig N50可以作為基因組拼接的結果好壞的一個判斷標准。
總而言之：
1.Contig就是reads之間的重疊區拼接獲得的序列！
2.就是將不同長度的Contig從長到短排序，一次相加，加到總長的1/2時的Contig就是Contig N50。
1.基因組de novo測序，通過reads拼接獲得Contigs後，
往往還需要構建454 Paired-end庫或Illumina Mate-pair庫，以獲得一定大小片段（如3Kb、6Kb、10Kb、20Kb）兩端的序列。基於這些序列，可以確定一些Contig之間的順序關系，這些先後順序已知的Contigs組成Scaffold。
就是知道順序的Contigs組成Scaffold！！
1.測序深度是指測序得到的 總鹼基數/待測基因組。
假設一個基因大小為2M，測序深度為10X，那麼獲得的總數據量為20M。
2.覆蓋度是 測序獲得的序列/整個基因組。
由於基因組中的高GC、重復序列等復雜結構的存在，測序最終拼接組裝獲得的序列往往無法覆蓋有所的區域，這部分沒有獲得的區域就稱為Gap。例如一個細菌基因組測序，覆蓋度是98%，那麼還有2%的序列區域是沒有通過測序獲得的。
如果對應特定基因的話，那麼就是每1000000 mapped到該基因上的reads中每kb有多少是mapped到該基因上的exon的read
⑺ 高通量測序的步驟
當然，首先地提取出您想要測序的東西，比如RNA、DNA 。再就是建庫-測序-分析。建庫需要將序列片段化、加接頭、PCR。不同的業務有細微的差別，比如RNA要先反轉錄成cDNA等等。然後就是上機測序了！最後就是數據分析了。數據分析分為流程分析（基本分析）和個性分析（根據老師課題分析）。這些以後呢，就是利用數據寫進文章准備發文章吧！
⑻ 高通量測序和重測序是怎麼回事啊哪位高手能賜教
是這樣的，高通量測序分為好多種，有不同的平台運作，共同的特點是極高的測序通量，相對於傳統測序的96道毛細管測序，高通量測序一次實驗可以讀取40萬到 400萬條序列。讀取長度根據平台不同從25bp到450bp，不同的測序平台在一次實驗中，可以讀取1G到14G不等的鹼基數，這樣龐大的測序能力是傳統測序儀所不能比擬的。
重測序就是說，基於第二代測序，也可以是第一代的，對之前的測過序的基因組再測一邊，並對個體或者群體樣品進行分析。基因組的重測序可以輔助研究者發現單核苷酸多態性位點（SNPs）、拷貝數變異（Copy Number Variation, CNV）、插入（Insertion）、缺失（Deletion）等變異類型，以最廉價的方式將單個參考基因組信息擴增為生物群體的遺傳特徵。短序列（Short-Reads）與雙末端（Paired-End），以及不同插入長度雙末端的組合，使我們能夠更深入地了解到序列和序列以外的基因組結構變異。
相位，就是說在測序的時候，測序的結果 會出現在電腦上，這個就叫做相位。在深一點就比較專業了，我還沒用過第二代測序，也不太清楚。但是， 據我所知相位經常會出現出現「超前」和「延遲」的現象。
⑼ 高通量測序分的原理是什麼
對DNA分子進行序列測定。