病毒熒光定量定性分析方法

『壹』 實時熒光定量PCR的原理

所謂實時熒光定量PCR技術 ，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最後通過標准曲線對未知模板進行定量分析的方法。
檢測方法
1.SYBRGreenⅠ法：
在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈後，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。
SYBR定量PCR擴增熒光曲線圖
PCR產物熔解曲線圖（單一峰圖表明PCR擴增產物的單一性）
2.TaqMan探針法：
探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5』-3』外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物的形成完全同步。
服務流程
1.客戶認真寫好訂單，提供待檢基因相關信息；
2.簽訂技術服務合同，支付預付款（30-50%)；
3.設計合成定量PCR引物（或客戶提供文獻引物委託本公司合成）；
4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反轉錄；
5.PCR預實驗，主要檢測引物的特異性和擴增效率；
6.正式定量實驗：對所有樣品上機檢測；
7.實驗結果和數據分析，形成報告。
收費標准
優惠包干價：120元/樣/基因（SYBRgreenI法，相對定量）
（含RNA提取，反轉錄，引物合成費用，上機測試費用（3個重復）；一個內參免費（內參3個重復） Ct值（Cycle threshold，循環閾值）的含義為：每個反應管內的熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環數

（如圖1所示）。
1. 熒光閾值（threshold）的設定
PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的預設（默認）設置是3-15個循環的熒光信號的標准偏差的10倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-15
2. Ct值與起始模板的關系
每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，公式如下。
Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)
n為擴增反應的循環次數，X0為初始模板量，Ex為擴增效率，N為熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產物的量。
起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標准品可作出標准曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標准曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。 實時熒光定量PCR所使用的熒光物質可分為兩種：熒光探針和熒光染料。現將其原理簡述如下：
1. TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用葯分析的首選技術平台。
2. SYBR熒光染料：在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈後，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。SYBR僅與雙鏈DNA進行結合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應是否特異。
3. 分子信標：是一種在5和3末端自身形成一個8個鹼基左右的發夾結構的莖環雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，導致熒光基團與淬滅基團緊緊靠近，不會產生熒光。PCR產物生成後，退火過程中，分子信標中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產生熒光 。 1．傳統定量PCR方法簡介
1）內參照法：在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成。上游引物用熒游標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內標也被擴增。在PCR產物中，由於內標與靶模板的長度不同，二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內標為對照定量待檢測模板。
2）競爭法：選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒游標記）。擴增後用內切酶消化PCR產物，競爭性模板的產物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產物分開，分別測定熒光強度，根據已知模板推測未知模板的起始拷貝數。
3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產物被固相板上特異的探針所結合，再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結合物，最終酶使底物顯色。常規的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內標，作出標准曲線，也可實現定量檢測目的。
2．內標在傳統定量中的作用
由於傳統定量方法都是終點檢測，即PCR到達平台期後進行檢測，而PCR經過對數期擴增到達平台期時，檢測重現性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復實驗，所得結果有很大差異，因此無法直接從終點產物量推算出起始模板量。加入內標後，可部分消除終產物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
3．內標對定量PCR的影響
若在待測樣品中加入已知起始拷貝數的內標，則PCR反應變為雙重PCR，雙重PCR反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數相差比較大時，這種競爭會表現得更為顯著。但由於待測樣品的起始拷貝數是未知的，所以無法加入合適數量的已知模板作為內標。也正是這個原因，傳統定量方法雖然加入內標，但仍然只是一種半定量的方法。 實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限，實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度，並記錄在電腦軟體之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據標准曲線獲得定量結果。因此，實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的：
1）Ct值的重現性PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期（對數期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恆定的。
2）Ct值與起始模板的線性關系由於Ct值與起始模板的對數存在線性關系，可利用標准曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種採用外標准曲線定量的方法。
外標准曲線的定量方法相比內標法是一種准確的、值得信賴的科學方法。利用外標准曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最准確，重現性最好的定量方法，已得到全世界的公認，廣泛用於基因表達研究、轉基因研究，葯物療效考核、病原體檢測等諸多領域。 各級各類醫療機構、大學及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸醫站、食品企業及乳品廠等。
由於qPCR是實時定量檢測致病病原體基因核酸，因此它比化學發光、時間分辨、蛋白晶元等免疫學方法更具獨到優勢。

『貳』 如何對某個微生物菌種進行實時定量pcr

Real2time PCR)技術 ,是在 PCR反應體系中加入熒光基團 ,利用熒光信號累積實時監測整個 PCR進程 ,最後通過標准曲線對未知模板進行定量分析的方法。該技術於 1996年由美國 AppliedBiosystems公司推出 ,通過對 PCR過程的實時監控 ,可專一、 靈敏、 快速、 可重復地精確定量起始模板濃度 ,真正實現了 PCR從定性到定量的飛躍。熒光定量 PCR技術以其獨特的優勢得到快速發展 ,這項技術已經廣泛應用於臨床和生命科學研究的各個領域。現就其在臨床微生物檢測方面作一概述。1 熒光定量 PCR在檢測和鑒定中的應用1 . 1 在病毒檢測和鑒定中的應用目前 ,熒光定量 PCR已用於多種病毒的檢測。Malmstrom等術對 185份不同基因型混合到一起的 B型肝炎病毒樣本進行檢測 ,能檢測到所有的基因型 ,以此證明該方法的高精確度。OkamotoTaqMan技術平台。雷永良等對 172例臨床診斷手足口病患者的 324份標本進行人腸道病毒、 柯薩奇病毒 A組 16型和腸道病毒 EV71型核酸特異性的反轉錄檢測 ,同時進行熒光定量 PCR和 EL ISA法平行檢測 ,熒光定量 PCR方法的結果與反轉錄檢測一致 ,兩者的靈敏度均高於 EL ISA法 ,與傳統的 RT2PCR和 EL ISA相比 ,實時熒光定量 PCR檢測標本快捷 ,特異性強、 靈敏度高 ,檢測手足口病腸道病毒准確高效 ,值得推廣。秦萌等定量 RT2PCR 檢測方法 ,實現了同時檢測新甲型[1]採用四重 TaqMan熒光定量 PCR技[2]建立了風疹病毒的[3 ]設計的一種四重熒光 2011年 第 2期李春娟等 :熒光定量 PCR技術在臨床微生物檢測中的應用H1N1流感病毒、 人季節性 H1N1流感病毒和人季節性 H3N2流感病毒 ,該方法特異性強 ,靈敏度高 ,最低可檢測至 20個拷貝的 RNA。譚耀駒等[4]以人 3型腺病毒感染的細胞和常見的呼吸道消化道感染的病原體為研究對象 ,建立了人 3型腺病毒 TaqMan熒光定量 PCR檢測方法 , TCI D50細胞培養液中病毒核酸最低檢出稀釋度是 1026,且呼吸道和消化道感染常見的病原體未出現交叉反應。白志軍登革熱病毒 (DV) 1型 5′設計一套特異性引物和 TaqMan探針進行熒光定量PCR快速監測並應用於臨床診斷 ,在登革熱的早期診斷中有較高的敏感性、 特異性和重復性 ,可作為DV1的快速診斷方法。其他病毒如 A /C/E型肝炎病毒 DNA[2]、 EB 病毒[13 ]等熒光定量方法均有報道和建立。WHO 於2009年 4月 28日起草了 CDC protocol of Real2timeRT2PCR for influenza A (H1N1) ,詳細介紹了 TaqMan技術進行豬流感病毒檢測和分型的操作規程1 . 2 在細菌檢測和鑒定中的應用近年來 ,由於傳統方法鑒別細菌的種種不足 ,Real2time PCR 技術已應用於多種細菌的檢測。Chandran等了檢測結合分枝桿菌的方法 ,與傳統的塗片染色法和培養法相比 , 其靈敏度為 97. 2% , 特異性達100% ,均高於兩種傳統方法。Tatavarthy等沙門氏菌的 ompF基因進行 Real2time PCR技術檢測 ,此方法能檢測沙門氏菌屬的所有種型 ,特異性為100%。

『叄』 熒光定量pcr儀是怎樣測試dna，rna的

熒光定量pcr儀是怎樣測試dna，rna的
普通的基因擴增儀（PCR儀）只能夠定性地分析是否存在目標片段。但是價格要低很多，而且運行成本也要低很多。不過不能直接得到擴增結果，還需要做電泳檢測。實際中檢測遺傳疾病，品種分子標記篩選，甚至親自鑒定等都可以由普通PCR儀完成。
但是，某些需要定量的實驗就必須用到實時定量PCR了。比如檢測某些病原物的數量（血液乙肝病毒復製程度），特定基因的表達量（比如結合反轉錄做的RNA定量分析），某些基因在染色體組中拷貝數（以前往往使用southern blot技術）等等。熒光定量PRC一般不需要對擴增產物進行電泳分析，操作相對簡單些，但是耗材實在是貴。
簡單來說，看有沒有用普通PCR儀，看有多少用熒光定量PCR

『肆』 病毒鑒定常用方法有哪些

寨卡病毒病的檢測方法包括病毒核酸檢測、IgM抗體檢測、中和抗體檢測和病毒分離等。寨卡病毒與黃病毒屬其他病毒具有較強的血清學交叉反應，目前主要採用病毒核酸檢測。
開展蚊媒寨卡病毒檢測時，對捕獲的伊蚊成蚊或幼蟲進行病毒核酸檢測。
開展寨卡病毒實驗室檢測時，應同時考慮登革病毒和基孔肯亞病毒感染可能。登革病毒和基孔肯亞病毒實驗室檢測應按照相應的技術指南開展。
（一）臨床標本檢測。
1．病原學檢測
病原學檢測主要適用於急性期血液標本，一般認為發病7天內檢測陽性率高。
（1）核酸檢測：採用熒光定量RT-PCR方法，是目前早期診斷寨卡病毒病的主要檢測手段。
（2）病毒分離：將標本接種於蚊源細胞（C6/36）或哺乳動物細胞（BHK21、Vero）進行分離培養，出現病變以後，用檢測核酸的方法鑒定病毒。也可使用乳鼠腦內接種進行病毒分離。
2．血清學檢測
（1）血清特異性IgM抗體：發病3天後可檢出病毒特異性IgM抗體，但發病7天後檢出率高。可採用ELISA、免疫熒光等方法檢測。IgM抗體陽性，提示患者可能新近感染寨卡病毒，但寨卡病毒IgM抗體與登革病毒、黃熱病毒和西尼羅病毒等黃病毒有較強的交叉反應，易於產生假陽性。
（2）中和抗體：採用空斑減少中和試驗方法檢測。患者恢復期血清中和抗體陽轉或滴度較急性期呈4倍及以上升高，且排除登革、乙腦等其他常見黃病毒感染，可以確診。
（二）媒介標本檢測。
1．標本處理
將分類後的伊蚊成蚊或幼蟲，按照採集地點，每10～20隻為一份進行研磨處理。
2．病毒核酸檢測
用RT-PCR的方法進行寨卡病毒核酸檢測
3．病毒分離
病毒核酸陽性的標本進行病毒分離。

『伍』 乙型肝炎病毒DNA熒光定量

對於慢乙肝病人來說，dna是指病毒量是多少。其多少表明其傳染性的強弱。
乙肝大三陽配合dna判斷乙肝的傳染性較強
。
但是，病情主要是靠肝功決定。
肝功正常，不需要任何治療。
也不會影響工作。
合理休息，注意定期復查。
目前來說慢性乙肝是不可能治癒的，但是，可以控制。
應當結合乙肝兩對半、hbvdna（病毒量）、b超和肝功能情況，判斷病情，決定治療措施。
是否是大小三陽並不病情輕重的指標。
你要注意：肝功輕度異常（不超過正常值上限的2倍），不管大小三陽、只要不是肝硬化，即使病毒量很高，也不需要葯物治療。注意休息，正常合理的飲食，定期復查非常重要。
作為慢乙肝患者應當注意以下幾點：1.定期復查肝功能和乙肝兩對半情況，當肝功能異常時（大於正常值上限2倍以上），應當進一步檢查hbvdna（病毒）定量，大三陽高於10的5次方或小三陽高於10的4次方，都是抗病毒治療的指征，應當積極抗病毒治療。治療一定要去正規醫院。2.定期檢查b超和甲胎蛋白（afp），慢乙肝有肝硬化和肝癌的發展趨勢，檢查b超能夠早期處理。3.肝功能正常的乙肝攜帶者，不需要特別的治療，只要注意休息，正常合理飲食即可，切記不能飲酒。定期復查很重要，時機合適就應該積極抗病毒治療，以減少肝硬化和肝癌的發生。

『陸』 熒光定量原理

熒光定量PCR技術是通過熒光染料或熒游標記的特異性探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時監控反應過程。隨著PCR 反應的進行，反應產物不斷累積，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環，收集一次熒光強度信號，這樣就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化，結合相應的軟體對產物進行分析，可以得到熒光擴增曲線，計算待測樣品初始模版的量。實時熒光定量PCR技術是一次由定性技術向定量技術的飛躍，運用該項技術，可以對DNA、RNA樣品進行相對定量、絕對定量和定性分析。

『柒』 實時熒光定量PCR技術原理是什麼

聚合酶鏈式反應 ( PCR) 可對特定核苷酸片斷進行指數級的擴增 。在擴增反應結束之後，我們可以通過凝膠電泳的方法對擴增產物進行定性的分析，也可以通過 放射性核素摻入標記後的光密度掃描來進行定量的分析 。無論定性還是定量分析，分析的都是 PCR 終產物。但是在許多情況下，我們所感興趣的是未經 PCR 信號放大之前的起始模板量。例如我們想知道某一轉基因動植物轉基因的拷貝數或者某一特定基因在特定組織中的表達量。在這種需求下熒光定量 PCR 技術應運而生。所謂的實時熒光定量 PCR 就是 通過對 PCR 擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量 PCR 反應中，引入了一種熒光化學物質，隨著 PCR 反應的進行， PCR 反應產物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。

『捌』 二重熒光定量PCR原理

原理：隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環，收集一個熒光強度信號，這樣就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。

分子生物學研究

1、核酸定量分析。對傳染性疾病進行定量定性分析，病原微生物或病毒含量的檢測,比如近期流行的甲型H1N1流感，轉基因動植物基因拷貝數的檢測，RNAi基因失活率的檢測等。

2、基因表達差異分析。比較經過不同處理樣本之間特定基因的表達差異（如葯物處理、物理處理、化學處理等），特定基因在不同時相的表達差異以及cDNA晶元或差顯結果的確證。

3、SNP檢測。檢測單核苷酸多態性對於研究個體對不同疾病的易感性或者個體對特定葯物的不同反應有著重要的意義，因分子信標結構的巧妙性，一旦SNP的序列信息是已知的，採用這種技術進行高通量的SNP檢測將會變得簡單而准確。

『玖』 熒光定量分析測定的是什麼

所謂的實時熒光定量PCR就是通過對PCR擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析。其原理是在實時熒光定量PCR反應中，引入了一種熒光化學物質，隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷累計，熒光信號強度也等比