豬瘟檢疫方法的研究進展

A. 如何預防豬瘟

豬瘟目前還沒有特效治療方法，必須採取以免疫注射為主的綜合性防制措施。

（1）預防接種：有條件的地區和養豬小區、豬場可採用豬瘟免疫監測手段，根據豬瘟抗體水平消長規律進行適時免疫。免疫效價監測方法，可採用豬瘟間接血凝試驗或酶聯免疫吸附試驗。如果沒有條件進行抗體監測，根據本地區有無散發豬瘟發生，可採取兩種免疫程序：A.有散發仔豬豬瘟的地區、場要用乳前免疫方法，仔豬在吃初乳前進行豬瘟疫苗免疫，每頭小豬注射1頭份。B.在豬瘟防治工作較好、無散發仔豬豬瘟地區、場，可在20日齡、60日齡分別免疫一次豬瘟疫苗。留種用的後備豬，6月齡再注射一次。種豬群每年兩次注射豬瘟疫苗。在免疫接種過程中，疫苗劑量要足，針頭長短合適，不打飛針，確保免疫效果。

（2）檢疫凈化：定期對繁殖豬群采血監測，將帶有豬瘟強毒抗體的豬和多次免疫抑制的豬查出淘汰，凈化豬群，消除豬瘟發生的隱患。

（3）加強疫苗管理：做到從主渠道購進疫苗。疫苗現稀釋現用，注射時要做到疫苗不離冰桶，桶不離冰，保證疫苗有效，嚴禁使用過期疫苗和失真空疫苗。

（4）加強免疫時用的針頭、針管及注射部位的消毒，減少人為疫病傳播。

（5）緊急接種：發病地區、場要採取緊急接種，並適當加大疫苗劑量（可加大1～3倍）減少發病和控制疫情擴大蔓延。

（6）加強病死豬處理：對可疑病豬予以隔離。死豬及污染物必須無害化處理，嚴禁出售和食用。

（7）加強場內外環境消毒：每一個月或半個月全場環境大消毒一次；每周至少1次豬舍帶豬消毒一次；飼養用具每2～3天消毒一次；場門口、各棟舍門口的消毒池要經常更換葯液，保持消毒葯液有效。

（8）加強管理，提高豬只的個體抗病能力。提供最佳生活條件，冬季禦寒，夏季防暑，舍內空氣新鮮。

（9）堅持自繁自養，嚴禁外購商品豬，引種時要從無疫情地區引進，引進後必須隔離檢疫觀察1個月以上，豬瘟強毒抗體陰性，豬瘟疫苗免疫後方可進場。

B. 我國首次出現「非洲豬瘟"，面對豬瘟該如何防控

參考一下這篇文章

怕的非洲豬瘟來了，該如何防控

農業農村部新聞辦公室8月3日發布，遼寧省沈陽市沈北新區發生一起生豬非洲豬瘟疫情，這是我國首次發生非洲豬瘟疫情（ASFV）。疫情發生後，農業農村部根據《非洲豬瘟疫情應急預案》啟動Ⅱ級應急響應。當地按照要求，啟動應急響應機制，採取封鎖、撲殺、無害化處理、消毒等處置措施，禁止所有生豬及易感動物和產品運入或流出封鎖區，沈陽市已暫停全市范圍的生豬向外調運。目前，該起疫情已得到有效控制。

中國農業科學院蘭州獸醫研究所早在十年前就針對我國非洲豬瘟的防控和應急儲備，OIE非洲豬瘟參考實驗室建立了良好的合作關系，並在農業農村部韓長賦部長的見證下與波蘭國家獸醫所共建實驗室，引進相關診斷技術和材料，並於2011年申請並得到農業部獸醫局的許可，進行非洲豬瘟診斷技術的研究及診斷試劑盒的研發（農醫葯便函[2011]596號）。

六、防治方法

加強進口種豬和豬產品的檢疫，堅決做好國際機場及港口的廢物、垃圾的銷毀處理工作。一旦有可疑非洲豬瘟發生，要採取果斷的撲殺措施，嚴格封鎖，徹底消毒。病毒對環境的抵抗力較強，在23℃經120天仍存活。在熱帶，豬圈內的病毒至少可存活2周。有效消毒劑的種類較少。目前，最有效的消毒劑是10%的笨及苯酚。OIE推薦使用的其他消毒劑包括0.8%的氫氧化鈉、0.3％福爾馬林和2.3%的次氯酸鹽等。生豬養殖者要嚴禁從疫區調運生豬，注意做好日常消毒工作，盡可能封閉飼養生豬，採取隔離防護措施，盡量避免與野豬、鈍緣軟蜱接觸，嚴禁使用未經高溫處理的餐館、食堂的泔水或餐余垃圾飼喂生豬。一旦出現不明原因死亡異常增多且有豬瘟類似症狀的，應及時上報當地獸醫部門。

C. 非洲豬瘟的檢測方法有哪些非洲豬瘟疫情防控方法是什麼

熒光定量 PCR 方法，該方法是將光譜技術引入到PCR 反應中，通過熒光信號的強弱變化定量測定特異性擴增產物的量，解決了常規 PCR 方法敏感性低和電泳檢測中溴化乙錠對環境的污染問題。

等溫擴增法，該方法是一種新興的分子生物學檢測方法，等溫擴增方法不需要 PCR 中的變性、退火步驟，即可完成對靶序列的循環擴增，大幅縮短了時間，整個擴增反應時間一般少於 60 min，而常規PCR 方法的反應時間一般需要 2 h 以上。等溫擴增試劑盒適合現場檢測，靈敏度高，能夠大幅提高豬瘟防控的可行性。

要減少場外人員和車輛進入豬場，要對人員和車輛入場前徹底消毒，要對豬群實施全進全出飼養管理，要對新引進生豬實施隔離，要按規定申報檢疫。

非洲豬瘟防控注意事項

養殖場應該堅持全進全出，自繁自育的養殖模式，構建完善的封鎖隔離措施，避免豬和野豬直接接觸。養殖場在生豬調運過程中，盡量不要跨省引進種豬，必須引種時，一定要進行嚴格的產地檢疫、疫情檢測，嚴格執行落地報告制度和隔離觀察制度。

殖場內部如果發現非洲豬瘟可疑疫情，嚴格按照《非洲豬瘟疫情應急預案》進行處置，迅速採取應急措施，預防疫情傳播和蔓延。

D. 豬瘟病毒的簡介

豬瘟病毒（Hogcholera virus, Swine fever virus)
豬瘟病毒是ssRNA病毒，黃病毒科瘟病毒屬，其RNA為單股正鏈。病毒粒子呈圓形，大小為38～44nm，核衣殼是立體對稱二十面體，氯化銫中浮密度1.15～1.17g/ml，有包膜。豬瘟病毒在細胞質內復制,不能凝集紅血球，與牛腹瀉病毒有相關抗原。該病毒對乙醚敏感，對溫度、紫外線、化學消毒劑等抵抗力較強。
豬瘟病毒能在豬胚或乳豬脾、腎、骨髓、淋巴結、白血球、結締組織或者肺組織的細胞中培養，但在這些細胞上不產生明顯病變。可利用雞新城疫病毒強化試驗（END試驗)測定豬瘟病毒，作為診斷豬瘟的一種方法。
豬瘟發現
豬瘟於1833年首先發現於美國的俄亥俄州。1885年，Salmon和Smith等對豬瘟和沙門氏菌病及豬丹毒作了鑒別診斷。1903年，DeSchweinitz和Dorset兩氏證明豬瘟的病原體是病毒。匈牙利的Hutyra Koves於1908年製成豬瘟高免血清，說明那時歐洲已存在豬瘟。日本於1909年第一次發現並開始研究豬瘟（Sasahara，1970）。中國何時發現和證明豬瘟存在，沒有明確的文字記載。約於1925年，東南大學農科開始研製免疫血清防制豬瘟。

E. 豬瘟最好的防治方法有哪些

答：目前，對於該病還沒有有效的治療方法，主要靠平時的預防。具體措施有：①定期預防注射，每年春、秋兩季，除對成年豬普遍進行一次豬瘟兔化弱毒疫苗注射外，對斷奶仔豬及新購進的豬都要及時防疫注射。將豬瘟兔化弱毒疫苗按瓶簽說明加生理鹽水稀釋，大、小豬一律肌內注射1毫升，注射後4天即可產生免疫力。②豬瘟常發疫區，仔豬出生後25～30日齡注射一次，55～60日齡仔豬斷奶後再注射一次，保護率可達100%。③給懷孕母豬注射疫苗，能增強母子抵抗豬瘟病毒的能力。一般於母豬分娩前一個半月進行一次預防注射。④緊急免疫接種，在已發生疫情的豬群中，做緊急預防注射，能起到控制疫情和防止疫情蔓延的作用，注射時可先從周圍無病區和無病豬舍的豬開始，後注射同群豬，病豬一般不注射。為加強免疫力，注射時可適當增加劑量。⑤加強飼養管理，定期進行豬圈消毒，提高豬群整體抗病力，杜絕從疫區購豬。新購入的豬應隔離觀察30天，證實無病，並注射豬瘟疫苗後方可混群。⑥在豬瘟流行期間，飼養用具每隔3～5天消毒一次。病豬消毒後，徹底消除糞便、污物，鏟除表土，墊上新土，豬糞應堆積發酵。

F. 非洲豬瘟疫苗將擴大試驗范圍，他們是否能戰勝豬瘟

當去年非洲豬瘟病毒在中國出現時，大量的豬死於該病毒，所以造成了豬的短缺，引發豬的價格上漲，養殖戶也因此而損失慘重。

中國農業科學院表示，將根據農業和農村事務部的工作部署，繼續加快疫苗試驗和研究的生產，進一步擴大黑龍江等地的臨床試驗范圍，並努力盡快完成相關試驗，並按照法律程序輸入安全證書聲明和疫苗注冊程序。

G. 中國科學家成功解析豬瘟病毒，我們是不是可以放心吃豬肉了

近期非洲豬瘟在世界蔓延引發寬泛關注。中國科學家團隊通過用時近1年合作研究攻關，即日已分離出中國國內正在發作的非洲豬瘟病毒盛行株，並勝利分析非洲豬瘟病毒顆粒精細三維布局，為開發效果佳、安全性高的新型非洲豬瘟疫苗奠定了鞏固底子。

作為全世界非常大的豬肉生產和花費國，生豬產業在我國人民經濟開展和人民群眾生活中具有不行替代的重要作用，但是這些病毒疫苗短時間內還是不可以投入使用的，還需要時間去徹底解決他。

H. 豬瘟的治療

簡介
在歐洲稱為古典豬瘟{classical swine fever．CSF），是由豬瘟病毒（HCV或CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病，豬是該病毒唯一的自然宿主。於1833年首次發現於美國俄亥俄州，百餘年來其流行遍及全球。國際獸疫局將其定為A類傳染病，中國《動物防疫法》將其列為一類傳染病．是目前危害中國養豬業發展的主要疫病之一。中國豬瘟兔化弱毒疫苗在防治豬瘟中曾起到決定性作用，但近幾年來出現免疫效果不理想．應用組織培養弱毒苗也發生免疫失敗，究其原因比較多。由於豬瘟造成的經濟損失巨大．歷來是各國研究的熱點。
csFV基因結構與功能的研究
CSFV為有囊膜病毒，40--60 nm，單股正鏈RNA。CSFV基因組長約1 2 3 kb，僅含有一個大的開放性閱讀框架（ORF）．此ORF翻譯成含3898個氨基酸殘基．分子量約438 kDa的多聚蛋白，並進一步在病毒和宿主細胞蛋白酶的作用下加工為成熟蛋白．cSFV的所有結構蛋白和非結構蛋白均由該ORF所編碼。ORF兩側是5』一端非翻譯區（5』-UTR）和3』一端非翻譯區（3』-UTR）．且5』一端無帽子結構．3』一端無poly(A）尾巴。這一大前體蛋白以共翻譯和後翻譯的形式在細胞蛋白酶和病毒特異蛋白酶作用下．加工成結構蛋白和非結構蛋白，其結構蛋白和非結構蛋白在病毒RNA上的編碼順序為Npro、c、Erns(E0）、E1、E2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、 NS5A、NS5B。NS2-3可被加工成NS2、NS3(P80），除c、E0、E1和E2為結構蛋白外．其餘均為非結構蛋白。
目前已經定位的CSFV蛋白有5種，即 Npro、c、Erns(E0）、E1和E2．它們均由CSFV的 RNA-ORF5』一端所編碼。在結構蛋白中，最具有免疫防制研究價值的是EO和E2。
1.1 c，是病毒的衣殼蛋白，也稱p14，由病毒ORF中的Setl 69～Al a267組成．是 CSFV核衣殼蛋白其N端由CSFV非結構蛋白p23的水解作用產生，c端可能是由宿主細胞的信號肽酶作用所致。
1．2 gp44/48，是病毒的一種囊膜糖蛋白．也稱Erns．舊稱E0。有9個可能的糖基化位點，去糖基的蛋白骨架分子量約26KDa，由病毒ORF中Glu168-Ala494組成。在感染細胞中gp44/48在內質網內積累，並可存在於細胞膜表面或被分泌到胞外。在病毒粒子中gp44/48以97KDa的同源二聚體形式存在於囊膜表面。由於其分子內缺乏疏水的膜錨定區，與病毒囊膜結合力弱．易從囊膜上游離下來。gp44/48可誘導產生豬瘟的中和抗體．免疫豬可誘導產生對致死量CSFV的保護性免疫。由於編碼 gp44/48的核酸序列在屬內比編碼gp55的序列保守程度高，因此E rns可作為防治豬瘟的一種靶蛋白。
Erns具有RNase活性，作用於單鏈的 RNA．且對富含u的序列活性最高。4ng的 Ems在體外即可將CSFV基因組RNA完全降解。推測Ems沒有將其自身RNA降解掉的原因可能是由於空間上的隔離。在宿主細胞中，新合成的E rns在內質網腔內．而其基因組RNA則在胞漿中：在病毒粒子中，定位於囊膜的Ems與其基因組RNA間隔著衣殼蛋白．因此E rns是不會降解其自身RNA的。編碼Ems的基因是瘟病毒屬病毒所特有的．黃病毒科中其他病毒基因組內無此基因．推測該基因是病毒與宿主細胞的RNase基因重組得到的。
1.3 gp33，是CSFV囊膜糖蛋白．也稱E1，去糖基的蛋白骨架分子量21．8KDa．由1 95個氨基酸殘基（ORF編碼的Leu495至GlY68。組成，內有3個可能的糖基化位點。其蛋白骨架中有兩段疏水序列（Leu548～ Pro579～Gly689）。在多聚蛋白轉位過程中，前一段是E1向內質網腔轉位的終止信號，後一段則充當E2轉位的信號肽，除此之外，這二段疏水區還充當E1的膜錨定位點。E1在病毒囊膜內．不能誘導豬產生抗體。
1.4 gp55．為CSFV的另一囊膜糖蛋白，又稱為E2，是病毒主要的抗原蛋白，也是三個病毒糖蛋白中保守性最低．最易變異的分子。gp55常以100kDa的同源二聚體及與gp33形成75kDa的異源二聚體形式存在於病毒粒子及CSFV感染的細胞表面。在體外gp55可誘導產生病毒的中和抗體，體內可誘導產生抗CSFV的攻擊的抗體。Hulst用20μg昆曳細胞表達的E2雙相油包水乳劑免疫豬，能抵抗1 00LD50 CSFV Brescia毒株強毒的攻擊。gp55的蛋白骨架由370個氨基酸（ORF編碼的690-1060氨基酸殘基）組成．並以其c端的40個疏水氨基酸錨定在膜上。由於糖基化程度不同。E2的分子量可為51-58kDa。E2分子內的1 5個Cys殘基在屬內均保守，其中N端6個Cys殘基參與抗原結構域的形成，c端9個Cys殘基則參與同源、異源二聚體的形成。
gp55的抗原決定區在其N端部分（ORF編碼的第690-866氨基酸），可分為2個獨立的抗原結構單元，四個抗原結構域A．B．C，D。其中結構域A又可分為A．， A2，A3三個亞域。結構域B．c屬於一個結構單元．均為中和抗體的結合位點．由 ORF編碼的690～800氨基酸殘基參與構成。Cys693與CYS7377形成的二硫鍵對結構域 B、c的空間結構至關重要。另一個結構單元含A．D抗原結構域。A1、A2亞區定位於第795-851氨基酸殘基，在種內保守A1是一個抗體的中和位點。亞區A3定位於766-813氨基酸殘基．而氨基酸殘基766-800則參與了結構域D的構成。cys792～ Cys856及Cys818～Cys828間的二硫鍵對這個結構單元空問結構的形成是必需的。連接這兩個結構單元的是一段屬內保守的疏水序列．推測這段序列參與了病毒侵入細胞過程中的膜融合過程。
1.5 Npro，也稱p23，CSFV的非結構蛋白，是ORF編碼的多聚蛋白N端的第一個蛋白質。Npro由168個氨基酸組成．具有蛋白質水解酶活性，能以自催化的方式從正在翻譯的多聚蛋白上斷裂下來，成為成熟的病毒蛋白。序列比較發現，編碼p2 3的基因在瘟病毒屬中是較為保守的。它的斷裂位點在Cysl 68與其下游的病毒核衣殼p1 4 N端第一個氨基酸ser。間。Npro的 cys69和His130可能位於其酶活性中心．能水解斷裂Cys與Ala及Gly與Ser間的肽鍵，斷列位點位於活性His殘基下游38個氨基酸殘基處。Npro不參與CSFV的結構及非結構蛋白的加工過程．其蛋白酶活性在 c S F V增殖過程中的作用還不清楚。Rumenapf等人使用定點突變技術對參與 Npro催化活性的氨基酸殘基進行測定．確定了其中的GIu22、His49和Cys69是保持Npro蛋白酶活性所必需的氨基酸殘基，而 His130並非必須。
實驗窒診斷
目前豬瘟流行常常表現無規律的地區性散發．發病特徵不典型，以發熱、精神沉鬱、食慾減退、咳嗽、共濟失調、結膜炎以及腹瀉、圍產期死亡、死胎、流產。中等毒力及強毒感染有以上這些症狀，並且在豬群中不分年齡快速傳播。結合這些臨床症狀進行實驗室診斷是必要的。
2.1 病毒抗原的檢測豬瘟病毒抗原的快速檢測對於豬瘟的診斷具有特別重要的意義。目前快速、敏感的檢測方法是利用免疫組化技術檢測扁桃體組織。扁桃體中豬瘟病毒抗原可早在感染後2d檢測到．淋巴結、脾臟以及胰腺均可作為病毒早期檢測的組織樣品。Delas Mulas等及Narita等報道了一種檢測豬瘟病毒抗原的免疫組化方法．即利用針對E2糖蛋白的單克隆抗體檢測福爾馬林固定、石蠟包埋的組織樣品的免疫組化方法。該方法的優點是能檢測長期保存的樣品，缺點是較費時．而且福爾馬林固定後的組織不能再進行病毒分離。利用鏈酶一生物素一過氧化物酶（ABc）的免疫組化方法也能用於豬瘟病毒組織切片上抗原的檢測。據報道流式細胞儀也可進行血樣中豬瘟病毒的檢測，但其敏感性較低。以豬瘟強毒感染仔豬，利用抗原捕獲ELISA方法檢測其病毒血症，結果表明該方法可用於豬群中流行病學的調查。但其敏感性以及特異性均低於傳統的實驗室方法。
2.2 感染性病毒的檢測病毒分離是目前體外檢測感染性豬瘟病毒最特異的方法。已報道有幾種方法可以從組織、全血中分離病毒，白細胞是分離病毒的最佳樣品。然而一些研究人員發現，白細胞以及單核細胞在動物感染後較長時間才能感染病毒。因此，對於豬瘟的早期診斷．全血或血漿可能比白細胞更為敏感。最常用於豬瘟病毒分離的細胞為豬腎細胞（PKl 5或SK6）或豬睾丸細胞（sT）。日本建立了一種豬腎由來的傳代細胞系（FS-L3）．FS-L3細胞在不感染病毒的情況下呈大園球狀．數倍至數十倍於普通細胞．但一旦感染了豬瘟病毒，FS-L3細胞的大園球狀即消失．這一特性已被用作豬瘟病毒的中和試驗等各種生物學特性的測定。經研究發現，產生細胞病變的毒株是因為它的遺傳基因發生了變化。從5』末端的第一個核苷酸到4764個核苷酸均已缺失．其中包括5』末端的非編碼區、自身蛋白分解酶、衣殼蛋白、糖蛋白（E0、 E1、E2）、非結構蛋白NS-1、和NS-2的基因均已缺失。
2.3 豬瘟病毒基因組檢測 已報道利用RT-PCR方法檢測豬瘟病毒RNA有數種程序。瘟病毒屬特異的引物多選自基因組的5』端保守區．其最突出的優點是其產物能用來直接測序，直接進行病毒株的分型。一般來說套式RT-PCR方法是檢測豬瘟病毒更敏感的方法，但其缺點是比較費時．不適用於大量樣品的檢測。McGoldrick等報道了一種檢測豬瘟病毒的單管熒光RT-PCR方法。此方法可檢測出仔豬血樣中感染了中等毒力或高等毒力的豬瘟病毒，其敏感性高於病毒分離方法．並且簡化了試驗程序．減少了污染的風險．還可進行大量樣品的檢測。
2.4 抗體檢測最常用的檢測豬瘟病毒抗體的方法多以病毒中和試驗為基礎。目前已建立數個特異的檢測血清抗體的E LlSA方法．包括檢測針對粗蛋白、特異結構蛋白如E2、E rns以及非結構蛋白NS3抗體的方法。目前使用最廣泛的是CSFV E2 ELISA，其敏感性與VNT相比為90%～99%．特異性為99%。Leforban等建立了一種ELISA方法，能夠區分BVDV、BDV以及 CSFV抗體。這個方法對於BVDV/BDV高流行地區（如荷蘭)csF的檢測非常有意義。ELISA特異性與敏感性的提高是目前面臨的最大的挑戰。
當前，豬瘟仍是世界養豬業的一大威脅．1 997-1 999年期間在德國、荷蘭、西班牙和義大利等國都曾多次暴發了豬瘟，在中國CSFV的持續性感染和疫苗保護效力下降的現象也比較普遍，這不僅給養豬業造成了嚴重的經濟損失，而且也給豬瘟防治政策的制定帶來了一定的困難。不過，相信隨著CSFV分子生物學和檢測方法研究的進一步深入，這些問題都會得到最終解決。