N末端氨基酸分析的方法

1. 常用於蛋白質多肽鏈N端。C端測定的方法有幾種基本原理是什麼

(1)N-末端測定
A.二硝基氟苯法(FDNB，DNFB)：1945年Sanger提出此方法，是他的重要貢獻之一。
DNP-氨基酸用有機溶劑抽提後，通過層析位置可鑒定它是何種氨基酸。Sanger用此方法測定了胰島素的N末端分別為甘氨酸及苯丙氨酸。
B.氰酸鹽法：1963年Stank及Smyth介紹了一種測定N末端的新方法，步驟如下：
由於乙內醯脲氨基酸不帶電荷，因此可用離子交換層析法將它與游離氨基酸分開，分離所得的乙內醯脲氨基酸再被鹽酸水解，重新生成游離的氨基酸，鑒別此氨基酸即可了解N-末端是何種氨基酸。
C.二甲基氨基萘磺醯氯法：1956年Hartley等報告了一種測定N-末端的靈敏方法，採用1-二甲基氨基萘-5-磺醯氯，簡稱丹磺醯氯。它與游離氨基末端作用，方法類似於Sanger的DNFB法，產物是磺醯胺衍生物。
丹磺醯鏈酸具有強烈的黃色熒光。此法優點為靈敏性較高(比FDNB法提高100倍，樣品量小於1毫微克分子)及丹磺醯氨基酸穩定性較高(對酸水解穩定性較DNP氨基酸高)，可用紙電泳或聚醯胺薄膜層析鑒定。
(2)C-末端分析
A.肼解法：這是測定C-末端最常用的方法。將多肽溶於無水肼中，100℃下進行反應，結果羧基末端氨基酸以游離氨基酸狀釋放，而其餘肽鏈部分與肼生成氨基酸肼。
這樣羧基末端氨基酸可以採用抽提或離子交換層析的方法將其分出而進行分析。如果羧基末端氨基酸側鏈是帶有醯胺如天冬醯胺和谷氨醯胺，則肼解時不能產生游離的羧基末端氨基酸。此外肼解時注意避免任何少量的水解，以免釋出的氨基酸混淆末端分析。
B.羧肽酶水解法：羧肽酶可以專一性地水解羧基末端氨基酸。根據酶解的專一性不同，可區分為羧肽酶A、B和C。應用羧肽酶測定末端時，需要事先進行酶的動力學實驗，以便選擇合適的酶濃度及反應時間，使釋放出的氨基酸主要是C末端氨基酸。

2. 蛋白質多肽鏈N端測定的方法及基本原理

1 多肽鏈的拆分。由多條多肽鏈組成的蛋白質分子，必須先進行拆分。幾條多肽鏈藉助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基).
2 測定蛋白質分子中多肽鏈的數目。通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數與蛋白質分子量之間的關系，即可確定多肽鏈的數目。
3 二硫鍵的斷裂。幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然後用烷基化試劑保護生成的巰基，以防止它重新被氧化。
二硫鍵的切割與保護（元素後數字為下標）
a 過甲酸〔performic acid〕 不可逆
－CH2SO3H
b、還原＋氧化 不可逆
[ 巰基乙醇，DTT ] ＋ 碘乙酸等
－S-CH2-COOH
c、亞硫酸分解〔Sulfitolysis〕 可逆
－R1-S-S-R2 ＋ HSO3-
R1-S- + R2-S-SOH3
可以通過加入鹽酸胍的方法解離多肽鏈之間的非共價力；應用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。
巰基（-SH）的保護4 測定每條多肽鏈的氨基酸組成，並計算出氨基酸成分的分子比（如右圖）
5 分析多肽鏈的N-末端和C-末端
多肽鏈端基氨基酸分為兩類：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸(Carboxyl-terminal) 。在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。N末端分析法（Sanger法；Edman法；DNS-Cl；酶降解法），C末端分析法（肼解法；酶降解法；硼氫化鋰法）。
6 多肽鏈斷裂成多個肽段。可採用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，並將其分離開來。
7 測定每個肽段的氨基酸順序
8 確定肽段在多肽鏈中的次序。
利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。
9 確定原多肽鏈中二硫鍵的位置
一般採用胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術分離出各個肽段，用過甲酸處理後，將可能含有二硫鍵的肽段進行組成及順序分析，然後同其它方法分析的肽段進行比較，確定二硫鍵的位置。

3. 鑒定蛋白質多肽鏈N端的第一個氨基酸,可以用的物質有哪些

常用於蛋白質多肽鏈N端.C端測定的方法有幾種
(1)N-末端測定 A.二硝基氟苯法(FDNB，DNFB)：1945年Sanger提出此方法，是他的重要貢獻之一。DNP-氨基酸用有機溶劑抽提後，通過層析位置可鑒定它是何種氨基酸。Sanger用此方法測定了胰島素的N?末端分別為甘氨酸及苯丙氨酸。B.氰酸鹽法：1963年Stank及Smyth介紹了一種測定N?末端的新方法，步驟如下：由於乙內醯脲氨基酸不帶電荷，因此可用離子交換層析法

4. 常用於蛋白質多肽鏈N端.C端測定的方法有幾種

常用於蛋白質多肽鏈N端測定的方法：

1、二硝基氟苯法（FDNB法）

2、二甲基氨基萘磺醯氯法（DNS－Cl法）

3、異硫氰酸笨酯法（Edman法）

常用於蛋白質多肽鏈C端測定的方法

1、肼解法

2、還原法

3、羧肽酶法

(4)N末端氨基酸分析的方法擴展閱讀：

多肽合成是一個固相合成順序，一般從N端即氨基端向C端即羧基端合成。過去的多肽合成是在溶液中進行的稱為液相合成法。

液相合成基於將單個N-α保護氨基酸反復加到生長的氨基成份上，合成一步步地進行， 通常從合成鏈的C端氨基酸開始，接著的單個氨基酸的連接通過用DCC，混合炭酐， 或N-carboxy酐方法實現。

5. 什麼叫做n末端氨基酸殘基 詳解，能畫出化學方程式，並指出

N末端氨基酸殘基就是肽鏈中含有游離α氨基的那個氨基酸殘基。在一條多肽鏈中，氨基酸之間通過氨基與羧基脫水縮合形成的肽鍵連接成長鏈，肽鏈一端的氨基酸的α羧基沒有形成肽鍵，處於游離狀態，這一端就是肽鏈的C端，另一端的α氨基沒有形成肽鍵，這一端是肽鏈的N端。N端的含有游離α氨基的氨基酸殘基就是N末端氨基酸殘基。

6. 蛋白質氨基末端氨基酸的測定方法

測定蛋白質最基本的方法是定氮法,即先測定樣品中的總氮量,再由總氮量計算出樣品中蛋白質的含量.蛋白質含量測定最常用的方法是凱氏定氮法,它是測定總有機氮的最准確和操作較簡便的方法之一,在國內外應用普遍.此外,雙縮脈法、染料結合法、酚試劑法等也常用於蛋白質含量測定,由於方法簡便快速,故多用於生產單位質量控制分析. 蛋白質及氨基酸的測定 蛋白質是生命的物質基礎,是構成生物體細胞組織的重要成分,一切有生命的活體都含有不同類型的蛋白質.人體內的酸鹼平衡、水平衡的維持；遺傳信息的傳遞；物質的代謝及轉運都與蛋白質有關.人及動物只能從食品得到蛋白質及其分解產物,來構成自身的蛋白質,故蛋白質是人體重要的營養物質,也是食品中重要的營養指標. 蛋白質是復雜的含氮有機化合物,分子量很大,它們由20種氨基酸通過醯胺鍵以一定的方式結合起來,並具有一定的空間結構.不同的蛋白質其氨基酸構成比例及方式不同,故各種不同的蛋白質其含氮量也不同.蛋白質可以被酶、酸或鹼水解,最終產物為氨基酸.氨基酸是構成蛋白質的最基本物質,在構成蛋白質的氨基酸中,亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸等8種氨基酸在人體中不能合成,必須依靠食品供給,故被稱為必需氨基酸,它們對人體有著極其重要的生理功能,常會因其在體內缺乏而導致患病,或通過補充而增強了新陳代謝作用.所以食品及其原料中蛋白質和氨基酸的分離、鑒定和定量具有極其重要的意義. 蛋白質的測定 測定蛋白質最基本的方法是定氮法,即先測定樣品中的總氮量,再由總氮量計算出樣品中蛋白質的含量.蛋白質含量測定最常用的方法是凱氏定氮法,它是測定總有機氮的最准確和操作較簡便的方法之一,在國內外應用普遍.此外,雙縮脈法、染料結合法、酚試劑法等也常用於蛋白質含量測定,由於方法簡便快速,故多用於生產單位質量控制分析. 微量凱氏定氮法 本法適用於各類食品中蛋白質的測定. 1．原理 食品與硫酸和催化劑一同加熱消化,使蛋白質分解,分解的氨與硫酸結合生成硫酸胺.然後鹼化蒸餾使氨游離,用過量硼酸吸收後再以硫酸或鹽酸標准溶液滴定,根據酸的消耗量乘以換算系數,即為蛋白質含量.反應過程分為三個階段,用反應式表示如下. ①消化 2NH2(CH2)2COOH 4-13H2S04一(NH.)2S04+6C02+12S0=+16H20 (NH4)2S04+2Na()H一2NH3十+2H20+.Na2S04 2NH3+4H3803—,(NH4)2 B207+5H20 ③滴定 (NH4)2 B2 07+2HCl+5H20—NH4C1+4H3803 2．儀器 ①消化爐. ②凱氏定氮蒸餾裝置. 3．試劑 所用試劑均用不含氨的蒸餾水配製.試劑均為分析純. ①CuS04. ②K2SO. ③濃H2SO. ④2％H.BO.溶液. ⑤混合指示劑：1份O．1％甲基紅乙醇溶液與5份O．1％溴甲酚綠乙醇溶液臨用時混合.也可用2份O．1％甲基紅乙醇溶液與1份0．1％次甲基藍乙醇溶液臨用時混合. ⑥飽和氫氧化鈉：500 g氫氧化鈉加入500 mL水中,攪拌溶解,冷卻後放置數日,澄清後使用. ⑦0．01 toolI．一』或0．05 toolL叫HCl標准溶液(需用無水碳酸鈉標定後使用). 4．操作步驟 ①樣品消化：精密稱取O．2～2．0 g固體樣品或2～5 g半固體樣品或吸取液體樣品5～20mI.,放人500 mI.乾燥凱氏燒瓶中,加人O．2 g硫酸銅、3 g硫酸鉀及20 mL濃HzSOa,於凱氏瓶口放一小漏斗,並將其以45.角斜支於有小孔的石棉網上.（更多詳細咨詢請參考國家標准物質網 www.rmhot.com ）用電爐以小火加熱,待內容物全部碳化,泡沫停止產生後,加大火力,保持瓶內液體微沸,至液體變藍綠色透明後再繼續加熱微沸30 min.冷卻,小心加入20 mL水,再放冷至室溫,移人100 mL容量瓶中,並用少量水洗燒瓶洗液並人容量瓶,在加水至刻度,混勻備用.除不加樣品外,取與處理樣品相同量的硫酸銅、硫酸鉀、硫酸,按同一方法做試劑空白消化. ②水蒸氣發生瓶內裝水至約2／3處,加甲基紅指示液數滴及數毫升硫酸,以保持水呈酸性,加入數粒玻璃珠以防暴沸,加熱煮沸水蒸氣發生瓶內的水. ③向接收瓶內加入10 mL 2％硼酸溶液及混合指示液l滴,並使冷凝管的下端插入液面下,吸取lO mI.樣品消化稀釋液由小玻璃杯流人反應室,並以10 mL水洗滌小燒杯使之流人反應室內,塞緊小玻璃杯的棒狀玻璃塞.將3～10 mL飽和氫氧化鈉溶液倒人小玻璃杯中,提起玻璃塞使其緩緩流入反應室,立即將玻璃塞蓋緊,並加水於小玻璃杯中以防漏氣.加緊螺旋夾,開始蒸餾.蒸汽通人反應室使氨通過冷凝管而進入接收瓶內,蒸餾2～5 min,移動接收瓶,使冷凝管下端離開液面,然後用少量中性水沖洗冷疑管下端外部,再蒸餾1 min取下接收瓶,以0．01 molI．叫或O．05 molL1HCl標准溶液滴定至灰色或藍紫色為終點.同時吸取10 mI_,試劑空白消化液按③操作. 5．計算 6.說明 ①干樣用稱量紙稱重連紙一同消化,空白管同樣放稱量紙消化. ②含糖量高和油脂高的樣品消化時容易溢出,加熱要緩慢. ③氨是否蒸餾完全,可用pH試紙測試餾出液是否為鹼性來判斷. ④實驗前必須仔細檢查蒸餾裝置的各個連接處,保證不漏氣.所用橡皮管、塞子須浸在氫氧化鈉(10％)中,煮沸10 min,然後水洗、水煮,再用水洗. ⑤小心加樣,切勿使樣品沾污凱氏燒瓶口部和頸部.

7. 肽鏈的末端可以用那四種方法測定,而和什麼法則是測定C末端氨基酸最常用的方法

常用於N－末端的測定方法：1. DNFP法（桑格反應） 2. PITC法（艾德曼反應） 3. 氨肽酶法（專一性的從氨基末端將肽鍵切斷）
常用於C－末端測定方法： 1. 肼解法 2. 還原法（硼氫化鋰） 3. 羧肽酶法（專一性的從羧基末端將肽鍵切斷）
肼解法是測定C末端氨基酸最常用的方法

8. 請教：氨基酸序列的測定方法

有兩種方法，一是直接測序列法，常用Edman降解法，在弱鹼性條件下多肽連N端氨基酸（阿爾發）與PITC反應，標記為苯氨基硫代甲醯蛋白質。肽鏈中的第一個肽鍵變弱，在無水酸的存在下發發生降解，第一個氨基酸（AA1）經過分子重排成為PTH-AA1結合層析技術即可確定氨基酸的性質。C端氨基酸殘基分析，可用；羧基肽酶，肼解法；二是串聯質譜測定多肽鏈氨基酸測序。
氨基酸（amino
acid）：含有氨基和羧基的一類有機化合物的通稱。生物功能大分子蛋白質的基本組成單位，是構成動物營養所需蛋白質的基本物質。是含有鹼性氨基和酸性羧基的有機化合物。氨基連在α-碳上的為α-氨基酸。組成蛋白質的氨基酸均為α-氨基酸。

9. 蛋白質中氨基酸的檢測方法

茚三酮法是比較粗糙的方法，如果你只是想知道含量，不測序，你有HPLC，為什麼不用HPLC，先過標准品，再測你樣品的水解產物，多方便。