微生物研究方法

A. 微生物的培養方法有哪些

微生物培養法是在人為條件下繁殖微生物的方法。根據微生物的種類以及對養料、溫度、氧氣、水分、酸鹼度等環境條件的要求不同，並聯系生產和實驗上的具體要求，可有不同的培養方法。可分好氣培養法和厭氣培養法兩類。中海生物技術的培養基一是好氣微生物培養法，常用：
①搖床培養法，即將微生物接種於盛有液體培養基的三角瓶後，放在恆溫培養室中的搖床上作有節奏的振盪，使空氣不斷進入培養液中，促其良好生長;
②淺盤培養法，又稱表面培養法，在盤內放一淺層培養基，使微生物能夠充分接觸空氣，而有利於生長繁殖，但此法所需空間大，並且容易污染雜菌;
③深層培養法，適用於好氣微生物的大規模發酵培養，在大容積的液體培養基中，通入無菌空氣，並不斷攪拌，可使微生物充分接觸空氣，迅速繁殖並積累代謝產物。二是厭氣微生物培養法，實驗室常用化學還原劑或抽氣機吸除培養基中的分子氧，也有用靜止狀態的深層培養法。在生產中常用密封式發酵罐或不通風的固體發酵法。

B. 微生物測定法的方法分類

液體稀釋法
在一組試管中分別加入一定的培養基，然後加入不等量的被測物質，再將已培養好的、用於測定的微生物接種進去,在規定的條件下培養一定時間,觀察其消長情況並與標准曲線對比，計算出被測物質的含量。
固體平板擴散法
將溶化的固體培養基與被測定微生物混合做成平板，把含不等量被測物質的液體滴入置於平板上(直接滴樣法)；或注入平板上的牛津杯內（管碟法）；或吸入圓形濾紙片後，再置於平板上(紙片法)；也可以在平板上挖一定大小的圓孔，然後把被測物滴入孔內（打孔法）；經培養後在物質擴散所及的范圍內出現抑菌法（或生長圈）,測量圈的直徑,並與標准曲線對比,計算出被測物質的含量（見圖[固體平板擴散法 1、3、7 打孔法2、8紙片法4、6管碟法5直接滴樣法][]）。
1932年，A.弗萊明在研究溶菌酶和青黴素時，開始使用微生物法測定抗生素的活性。1940年，E.B.錢恩等根據平板上抑菌圈的大小測定青黴素的活性含量。後又經E.P.亞伯拉罕等進一步將上述測定方法予以完善。測定抗生素時常用的微生物有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母、黑麴黴等。1935年，W.H.肖普費最先用微生物測定維生素B。1939年,E.E.斯內爾和F.M.斯特朗用乳桿菌測定維生素的含量。1934年，K.A.凱肯等用阿拉伯聚糖乳桿菌測定9種氨基酸。此後,乳桿菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬的成員及某些微生物的變異株，逐漸成為最常使用的對象。

C. 不可培養微生物的研究方法和研究意義

稀釋培養法和高通量培養法 d.pp3D 9/
在地球環境中，海洋環境中迄今可培養微生物的比例最低，僅為0.001% ～ 0.1%，這是由於海洋環境中主要是寡營養微生物，它們在人工培養時往往受到少數優勢生長的微生物的競爭作用而不能生長。為了克服該缺陷，1993 年Button從概率論的角度提出一個嶄新的方法，即稀釋培養法（Dilution culture）。該方法認為，當把海水中微生物群體稀釋至痕量時，在海水中主要存在的寡營養微生物可以不受少數幾種優勢微生物的競爭作用的干擾，因而主體寡營養微生物被培養的可能性會大大提高。隨後，Schut等的實際操作驗證了該理論的正確性。 ';/84j-3F
2002 年Connon在稀釋培養法的基礎上提出高通量培養法（High-throughput culturing，HTC）。將樣品稀釋至痕量後，採用小體積48 孔細胞培養板分離培養微生物。該方法不僅有效提高微生物的可培養性，還可在短期內監測大量的培養物，大大提高工作效率。Cho等利用該方法從太平洋近海和遠洋海水中也分離出多種新菌。Rappé 和Connon結合熒光原位雜交技術（FISH），對高通量培養法進行了改進，根據從培養板各孔中針對性地檢測SAR11 進化分支的海洋細菌的存在，在較短時間內對目標微生物進行了大量的培養。但是，稀釋培養法和高通量培養法成功的原因恰恰又是制約其進一步發展的障礙。在樣品稀釋、微生物間的不利作用被削弱的同時，有利作用也被削弱。例如，當微生物被極度稀釋、初始接種量很小時，一些微生物分泌的代謝產物也被稀釋，其他關聯微生物細胞由於缺乏這些必須的代謝產物，生長就會受到抑制；另外，缺少種間的共生關系和群體效應，很多微生物仍然不可培養。 O3!d(dY=_
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3.2 擴散盒培養法 GOW"o"S
Kaeberlein〔2〕等在分離培養潮間帶底泥中的微生物時使用一種新穎的自製培養儀器，為其起名為擴散盒（Diffusiongrowth chamber）。擴散盒由一個環狀的不銹鋼墊圈和兩側膠連的0.1μm 濾膜組成，濾膜只能允許培養環境中的化學物質通過而不能讓細胞通過。將底泥樣品置於擴散盒內的半固體培養基中，擴散盒置於魚缸底部的天然海洋底泥上，往魚缸內加入天然海水並保證擴散盒內存有一定空氣供微生物生長。培養時，使天然海水循環流動，並不斷注入新鮮的海水。培養1 周後培養基上產生大量的微型菌落，數目高達接種微生物的40%。這種培養方法能較大程度地模擬微生物所處的自然環境，由於化學物質可以自由穿過薄膜，可保證微生物群落間作用的存在，提高微生物可培養性。擴散盒法的主要不足是操作比較繁瑣。 b%nkIPA
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3.3 細胞包囊法 hNO )~rt
Zengler 等將海水和土壤樣品中的微生物先進行類似稀釋培養法的稀釋過程，然後乳化，部分微生物形成了僅含單個細胞的膠狀微滴。然後將膠狀微滴裝入層析柱內，使培養液連續通過層析柱進行流態培養。層析柱進口端用0.1μm 濾膜封住，防止細菌的進入而污染層析柱；出口端用8μm 濾膜封住，允許培養產生的細胞隨培養液流出。該方法的特點是讓微生物在開放式培養液中生長，使培養環境接近於微生物的自然生長環境，能夠很好地提高微生物可培養性，但成本較高，不利於普及使用。 & zgPN8u
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3.4 序列引導分離技術 _:5=| 2-E
序列引導分離技術（Sequence-guiding isolation）是根據微生物基因組中特定基因的特異性序列，設計引物或雜交探針，以培養物中目標序列存在和變化情況為標准，來指導對微生物最優培養條件的選擇，培養出新的微生物。Stevenson在細菌培養過程中採用了多種培養條件的組合，導致培養方案繁多復雜。為了減少分離細菌的工作量、節省時間，用PCR 作為監測手段來確定目標細菌是否得到培養。當細菌在固體培養基上長出菌落後，用緩沖液沖洗培養基表面，提取沖洗液中細菌的DNA，根據目標細菌的16S rDNA擴增情況判斷目標細菌的存在與否。繼續用PCR方法監測目標細菌直至分離得到純菌株。Béjà 等通過對尚未培養的海洋變形細菌的BAC 基因文庫進行研究，發現該類菌具有編碼視紫紅質的基因片段。視紫紅質是光營養過程中不可或缺的化學物質。據此設想增加光照可提高該菌的可培養性，而進一步的實驗結果驗證了該假設的正確性。此外，Breznak指出，分子原位雜交技術可以對推斷目標微生物的代謝方式和營養需求提供幫助，極大地節省工作時間，操作也很簡便，僅需要一種特異性的探針，顯示了在微生物培養時引入分子生物學技術作為引導的優勢和力量。