核酸和多肽葯物分析方法

Ⅰ 跪求實驗方案急。關於植物小分子多肽的提取分離和分析 最好用到高效液相提取 分析的

多肽類化合物廣泛存在於自然界中，其中對具有一定生物活性的多肽的研究，一直是葯物開發的一個主要方向。生物體內已知的活性多肽主要是從內分泌腺組織器官、分泌細胞和體液中產生或獲得的，生命活動中的細胞分化、神經激素遞質調節、腫瘤病變、免疫調節等均與活性多肽密切相關。隨著現代科技的飛速發展，從天然產物中獲得肽類物質的手段也不斷得到提高。一些新方法、新思路的應用。不斷有新的肽類物質被發現應用於防病治病之中。本文介紹了近幾年肽類物質分離、分析的主要方法研究進展。
1 分離方法
採取何種分離純化方法要由所提取的組織材料、所要提取物質的性質決定。對蛋白質、多肽提取分離常用的方法包括：鹽析法、超濾法、凝膠過濾法、等電點沉澱法、離子交換層析、親和層析、吸附層析、逆流分溶、酶解法等。這些方法常常組合到一起對特定的物質進行分離純化，同時上述這些方法也是蛋白、多肽類物質分析中常用的手段，如層析、叫泳等。
1.1 高效液相色譜（HPLC）
HPLC的出現為肽類物質的分離提供了有利的方法手段，因為蛋白質、多肽的HPLC應用與其它化合物相比，在適宜的色譜條件下不僅可以在短時間內完成分離目的，更重要的是HPLC能在制備規模上生產具有生物活性的多肽。因此在尋找多肽類物質分離制備的最佳條件上，不少學者做了大量的工作。如何保持多肽活性、如何選擇固定相材料、洗脫液種類、如何分析測定都是目前研究的內容。
1．1．1 反相高效液相色譜（RP-HPLC）
結果與保留值之間的關系：利用RP-HPLC分離多肽首先得確定不同結構的多肽在柱上的保留情況。為了獲得一系列的保留系數，Wilce等利用多線性回歸方法對2106種肽的保留性質與結構進行分析，得出了不同氨基酸組成對保留系數影響的關系，其中極性氨基酸殘基在2～20氨基酸組成的肽中，可減少在柱上的保留時間；在10～60氨基酸組成的肽中，非極性氨基酸較多也可減少在柱上的保留時間，而含5～25個氨基酸的小肽中，非極性氨基酸增加可延長在柱上的保留時間。同時有不少文獻報道了肽鏈長度、氨基酸組成、溫度等條件對保留情況的影響，並利用計算機處理分析得到每種多肽的分離提取的最佳條件。
肽圖分析（Peptide Mapping）：肽圖分析是根據蛋白質、多肽的分子量大小以及氨基酸組成特點，使用專一性較強的蛋白水解酶[一般未肽鏈內切酶（endopeptidase）]作用於特殊的肽鏈位點將多肽裂解成小片斷，通過一定的分離檢測手段形成特徵性指紋圖譜，肽圖分析對多肽結構研究合特性鑒別具有重要意義。利用胰蛋白酶能特意性作用於Arg和Lys羧基端的肽鏈的性質，通過RP-HPLC法採用C18柱檢測了重組人生長激素特徵性胰肽圖譜。同時胰島素的肽圖經V8酶專一裂解也製得，並可鑒別僅相差一個氨基酸殘疾的不同種屬來源的胰島素。人類腫瘤壞死因子的單克隆抗體結構也應用酶解法及在線分析技術確定了肽圖，便於鑒定分析。此項技術已經在新葯開發中得到廣泛應用。
1.1.2 疏水作用色譜（Hydrophobic interaction chromatogrphy，HIC）
HIC是利用多肽中含有疏水基因，可與固定相之間產生疏水作用而達到分離分析的目的，其比RP-GPLC具有較少使多肽變性的特點。利用GIC分離生產激素（GH）產品的結構與活性比EP-GPLC分離的要穩定，活性較穩定。Geng等利用HIC柱的低變性特點，將大腸桿菌表達出的經鹽酸胍乙啶變性得到人重組干擾素-γ。通過HIC柱純化、折疊出高生物活性的產品。不同人尿表皮生長因子（EGF）也利用HIC純化到了，均具有良好的生物活性。HIC可將未經離子交換柱的樣品純化。而RP-HPLC則不能達到這一要求。
1.1.3 分子排阻色譜（Sizs-Exclusion chromatogrphy，SEC）
SEC是利用多肽分子大小、形狀差異來分離純化多肽物質，特別對一些較大的聚集態的分子更為方便，如人重組生長激素（hgH）的分離，不同結構、構型的GH在SEC柱上分離行為完全不同，從而可分離不同構型或在氨基酸序列上有微小差異的變異體，利用SEC研究修飾化的PEG的分離方法，此PEC具有半衰期長、作用強的特點。一些分子量較大的肽或蛋白均可利用此法分離分析。
1．1．4離子交換色譜（Iron-Exchange chromatography,IEXC）
IEXC可在中性條件下，利用多肽的帶電性不同分離純化具有生物活性的多肽。其可分為陽離子柱與陰離子柱兩大類，還有一些新型樹脂，如大孔型樹脂、均孔型樹脂、離子交換纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠樹脂等。在多肽類物質的分離分析研究中，對多肽的性質、洗脫劑、洗脫條件的研究較多，不同的多肽分離條件有所不同，特別是洗脫劑的離子強度、鹽濃度等對純化影響較大。Wu等報道利用離子交換柱層析法，探討分離牛碳酸酐異構體和牛血清白蛋白、雞血清白蛋白酶的提取條件，獲得了有價值的數據供今後此類物質分離研究。
1．1．5膜蛋白色譜（Chromatography of Membrane Protein,CMP）
CMP+分離強蔬水性蛋白、多肽混合物的層析系統，一般有去垢劑（如SDS）溶解膜蛋白後形成SDS-融膜蛋白，並由羥基磷灰石為固定相的柱子分離純化。羥基磷灰石柱具有陰離子磷酸基團（P-端），又具有陽離子鈣（C-端），與固定相結合主要決定於膜蛋白的大小、SDS結合量有關。利用原子散射法研究cAMP的分離機制發現，樣品與SDS結合後在離子交換柱上存在SDS分子、帶電荷氨基酸與固定相中帶電離子間的交換，從而達到分級分離的目的。
1．1．6高效置換色譜（High-Performance Displacement Chromatography,HPDC）
HPDC是利用小分子高效置換劑來交換色譜柱上的樣品，從而達到分離的目的。它具有分離組分含量較少成分的特性。利用HPDC鑒定分離了低於總量1%組分的活性人重組生長激素（rHG ）。在研究非毒性交換劑時Jayarama發現硫酸化葡萄糖（Detran Sulfate，DS）是對β乳球蛋白A和B的良好置換劑，一般DS的相對分子質量為1×104和4×104最宜。研究表明置換劑的相對分子質量越低，越易於與固定相結合，因此在分離相對分子質量小的多肽時，需要更小的置換劑才能將其置換純化出來。
1.1.7 灌注層析（Perfusion Chromatography，PC）
PC是一種基於分子篩原理與高速流動的流動相的層析分離方法，固定相孔徑大小及流動相速度直接影響分離效果。試驗證明其在生產、制備過程中具有低投入、高產出的特性。目前市場上可供應的PC固定相種類較多，適合於不同分子量的多肽分離使用。
1.2 親和層析（Affinity Chromatography，AC）
AC是利用連接在固定相基質上的配基與可以和其特異性產生作用的配體之間的特異親和性而分離物質的層析方法。自1968年Cuatrecasas提出親和層析概念以來，在尋找特異親和作用物質上發現了許多組合，如抗原-抗體、酶-催化底物、凝集素-多糖、寡核苷酸與其互補鏈等等。對多肽類物質分離目前主要應用其單抗或生物模擬配基與其親和，這些配基由天然的，也有根據其結構人工合成的。Patel等人利用一系列親和柱分離純化到了組織血漿纖維蛋白酶原激活劑蛋白多肽。
固定金屬親和層析（Immobilized Metal Affinity Chromatography.LMAC）是近年來發展起來的一種親和方法。其固定相基質上鰲合了一些金屬離子，如Cu2+、Ni2+、Fe3+等，此柱可通過配為鍵鰲合側鏈含有Lys、Met、Asp、Arg、Tyr、Glu和His的多肽，特別是肽序列中含有His-X-X-X-His的結構最易結合到金屬離子親和柱上，純化效果較好。其中胰島素樣生長因子（Insylin Like Growth Factor，IGF）、二氫葉還原酶融合蛋白等均用此方法分離到純度較高的產品。
Chaiken等人報道了另一種親和層析方法，利用反義DNA表達產生，其與正鏈DNA表達產生的肽或蛋白具有一定的親和性，如Arg加壓素受體復合物，已用此法分離得到。DNA與蛋白、多肽復合物之間的作用也是生物親和中常用的方法。將人工合成的寡核苷酸結合在固定相基質上，將樣品蛋白或多肽從柱中流過，與之結合可達到分離特定結構多肽的目的。
1.3 毛細管電泳（Capillary electrophoresis，CE）--分離分析方法
CE是在傳統的電泳技術基礎上於本世紀60年代末由Hjerten發明的，其利用小的毛細管代替傳統的大電泳槽，使電泳效率提高了幾十倍。此技術從80年代以來發展迅速，是生物化學分析工作者與生化學家分離、定性多肽與蛋白類物質的有利工具。CE根據應用原理不同可分為以下幾種；毛細管區帶電泳Capillary Zone electrophoresis，CZE）、毛細管等電聚焦電泳（Capillary Isoeletric Focusing，CIEF）毛細管凝膠電泳（CapillaryGelElectrophoresis，CGE）和膠束電動毛細管層析（Micellar Electokinetic Electrophoresis Chromatorgraphy,MECC）等。
1.3.1 毛細管區帶電泳（Capillary Zone Electrophoresis，CZE）
CZE分離多肽類物質主要是依據不同組分中的化合物所帶電性決定，比傳統凝膠電泳更准確。目前存在於CZE分離分析多肽物質的主要問題是天然蛋白或肽易與毛細管硅膠柱上的硅醇發生反應，影響峰形與電泳時間，針對這些問題不少學者做了大量實驗進行改進，如調節電池泳液的PH值，使與硅醇反應的極性基團減少；改進毛細管柱材料的組成，針對多肽性質的不同採取不同的CZE方法研究分離5個含9個氨基酸殘基的小肽，確定了小肽分析的基本條件，即在低PH條件下，緩沖液中含有一定濃度的金屬離子如Zn2+等，此時分離速度快而且准確。
1．3．2細管等電聚電泳（Capillary Isleletric Focusing,CIEF）
由於不同的蛋白、多肽的等電點（PI）不同，因此在具有不同pH梯度的電泳槽中，其可在等電點pH條件下聚集沉澱下來，而與其他肽類分離開來。CIEF在分離、分析混合多肽物質中應用不多，主要應用與不同來源的多肽異構體之間的分離，如對rHG不同異構體分離。由於在CIEF柱表面覆蓋物的不穩定性限制了此法的廣泛應用。
1．3. 3毛細管凝膠電泳 (Capillary Gel Electrophoresis,CGE)
CGE是基於分子篩原理，經十二烷基磺酸鈉（SDS）處理的蛋白或多肽在電泳過程中主要靠分子形狀、分子量不同而分離。目前，又有一種非交聯歡、線性、疏水多聚凝膠柱被用於多肽物質的分離分析，此電泳法適於含疏水側鏈較多的肽分離，這種凝膠易於灌注，使用壽命長，性質較為穩定。
1．3．4膠束電動毛細管層析（Micellar Electrokinetic Electorphoresis Chromatography, MECC）
MECC的原理是在電泳液中加入表面活性劑，如SDS，使一些中性分子帶相同電荷分子得以分離。特別對一些小分子肽，陰離子、陽離子表面活性劑的應用都可使之形成帶有一定電荷的膠束，從而得到很好的分離效果。有文獻報道在電解液中加入環糊精等物質，可使用權含疏水結構組分的多肽選擇性與環糊精的環孔作用，從而利用疏水作用使多肽得到分離。
1．4多肽蛋白質分離工程的系統應用
以上提到的分離多肽的技術在實際應用過程中多相互結合，根據分離多肽性質的不同，採用不同的分離手段。特別是後基因組時代，對於蛋白質組深入的研究，人們對於分離多肽及蛋白質的手段不斷改進，綜合利用了蛋白質和多肽的各種性質，採用包括前面提到的常規蛋白多肽提取方法，同時利用了高效液相色譜，毛細管電泳，2-D電泳等手段分離得到細胞或組織中盡可能多的蛋白多肽。在蛋白質組學研究中系統應用蛋白和多肽分離鑒定的技術在此研究中即是分離手段也是分析方法之一。特別是以下提到的質譜技術的發展，大大的提高了蛋白多肽類物質的分析鑒定的效率。
2 分析方法
2．1 質譜分析（Mass Spectrometry, MS）
MS在蛋白、多肽分析中已經得到了廣泛應用，特別是在分離純化後的在線分析中，MS的高敏性、快速性特別適合多肽物質分析鑒定。其中連續流快原子轟擊質譜（Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB）和電霧離子化質譜（Electrospray Ionization, EIS）是近幾年發展起來的新方法。
2．1．1連續流快原子轟擊質譜（Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB）
cf-FAB是一種弱離子化技術，可將肽類或小分子量蛋白離子化成MH+或（M-H）形式。主要應用於肽類的分離檢測，其具有中等解析度，精確度大於+0.2amu，流速一般在0.5-1.5μl·Ml-1。在測定使流動相需加0.5%-10%基質如甘油和高有機溶劑成分，使樣品在檢測探針處達到敏感化。cf-FAB常與HPLC、CEZ等方法結合使用達分離分析的目的，許多多肽的cf-FAB分析方法已經建立，並得到很好的應用。如Hideaki等利用此法研究L-Pro、L-Ala的四肽化合物系列。證明L-Pro在保持小肽構相穩定性。連接分子方面具有重要意義。
2.1.2 電霧離子化質譜（Electrospray Ionozation，EIS）
EIS可產生多價離子化的蛋白或多肽，允許相對分子質量達1×105蛋白進行分析，解析度在1500-2000amu。精確度在0.01%左右。EIS更適合相對分子質量大的蛋白質的在線分析，且需要氣化或有機溶劑使樣品敏感化。利用EIS與HPLC聯合分離分析GH和血紅蛋白均獲成功，其也可與CEZ聯合應用。
2.1.3 基質輔助激光解析/離子化-飛行時間質譜（Matrix-associated laser disso-ciation/ionization time of flight mass spectrmtry，MALDI-TOF MS）
MALDI-TOF是目前蛋白質鑒定中精確測定測定分子質量的手段，特別適合對混合蛋白多肽類物質的相對分子質量的測定，靈敏度和解析度均較高。它是目前蛋白質組學研究的必備工具。同時結合液相色譜的聯用技術可以高效率的鑒定多肽物質。特別是當各種原理的質譜技術串聯應用時，不但可以得到多肽的相對分子質量信息，還可以測定它的序列結構，此項技術將在未來蛋白質組學研究中起到決定性作用。
2.2 核磁共振(Nuclear Magnetic resonance，NMR)
NMR因圖譜信號的純數字化、過度的重疊范圍過寬（由於相對分子質量太大）核信號弱等原因，在蛋白、多肽物質的分析中應用一直不多。隨著二維、三維以及四維NMR的應用，分子生物學、計算機處理技術的發展，使NMR逐漸成為此類物質分析的主要方法之一。NMR可用於確定氨基酸序列、定量混合物中的各組分組成含量等分析中。但要應用於蛋白質分析中仍有許多問題需要解決，例如，如何使分子量大的蛋白質有特定的形狀而便於定量與定性分析，如何減少數據處理的時間問題等。這些問題多有不少學者在進行研究。雖然在蛋白質分析中應用較少，NMR在分析分子中含少於30個氨基酸的小肽時是非常有用的，可以克服上述蛋白質分析中的缺點而達到快速准確分析的目的。
2.3 其他
除上述方法之外，氨基酸組成分析、氨基酸序列分析、場解析質譜、IR、UV光譜、CD、圓而色譜、生物鑒定法、放射性同位素標記法及免疫學方法等都已應用於多肽類物質的結果鑒定、分析檢測之中。
以上簡要的介紹了近幾年多肽物質分離、分析的常用方法及最新研究方向。隨著科學技術水平的不斷發展，會有許多更新的分離分析手段不斷涌現，因此這一領域的研究具有廣闊的前景。 應用SDS-PAGE顯示小分子多肽
SDS-PAGE在分離、鑒定和純化蛋白質方面有著廣泛應用，其有效分離范圍取決於聚丙烯醯胺的濃度和交聯度，其孔徑隨著雙丙烯醯胺與丙烯醯胺比率的增加而減小，比率接近於1：20時，孔徑達到最小值。分子量低於10kD的小分子肽類，即使用較高濃度的聚丙烯醯胺凝膠的SDS-PAGE也不能完全分離，或是顯不出色，或是顯帶較弱，帶型彌散。且分子量越小，效果也越差。
為了能在SDS-PAGE上顯示測定小分子量的多肽，通常採取兩種方法：一是增加凝膠的濃度和交聯度，在制膠時加入一些可以降低聚丙烯醯胺凝膠網限孔徑的溶質分子，使用尿素、甘油或蔗糖等物質；二是選擇緩沖液中的拖尾離子的種類和濃度以達到改善多肽的分離效果。
操作步驟
1．電泳緩沖液的配製如下表所示
緩沖液Tris
(mol/L)Tricine
(mol/L)pHSDS
(%)
陽極緩沖液
陰極緩沖液
膠緩沖液0.2
0.1
3.0—
0.1
—8.9*
8.25**
8.4*—
0.1
0.3
* 用HCl調pH
** pH約為8.25

2．丙烯醯胺貯存液的配製
單丙-雙丙混合物單丙的百分數雙丙的百分數
49.5% T, 3%C
49.5% T, 6%C48
46.51.5
3.0
T：丙烯醯胺的總濃度
C：交聯度

3．膠的制備，與一般SDS-PAGE相似，按下表配製分離膠和濃縮膠
組 份分離膠
16% T，6%C濃縮膠
6% T，3%C
49.5% T, 3%C丙烯醯胺溶液（ml）
49.5% T, 6%C 丙烯醯胺溶液（ml）
膠緩沖液（ml）
脲（g）[甘油（ml）]
水（ml）
10%過硫酸銨（μl）
TEMED（μl）
總體積（ml）—
3.3
3.3
3.6[2.4]
1
40
4.0
10.040.48
—
1.00
—
1.50
25
2.5
3.03
4．樣品緩沖液
4% SDS
12%甘油
50mmol/L Tris
2%巰基乙醇
0.01% Serva blue
多肽樣品與樣品緩沖液混合沸煮2min（或40℃溫浴30min）。
5．將灌膠的玻璃板固定在電泳裝置上，用1%瓊脂糖封邊，倒入陰極緩沖液，依次加樣。
6．將電泳裝置放入電泳槽內，倒入陽極緩沖液，將正負極與電泳儀相接，恆電壓50~60V，待指示劑進入分離膠後，電壓可升至70~90V，恆壓約3h待指示劑走出凝膠下緣停止電泳。
7．染色、脫色及膠的保存同SDS-PAGE。

Ⅱ 多肽和蛋白質類葯物的分析方法

1.1生物檢定法
由於蛋白多肽類葯物多為有生物活性的物質,且生物活性不僅取決於葯物的一級結構，與二 、三級結構亦密切相關，故生物檢定法是研究該類葯物動力學獨特而必需的方法。生物檢定 法 有兩個目的，直接測定體液中葯物濃度及鑒定標記葯物的生物活性。其方法主要可分為兩大 類。
1.1.1在體分析常規的有胰島素的小鼠血糖法等，另外還有根據各 類蛋白多肽的生物活性 不同而建立的各異的方法，如根據IL-8可將大量中性粒細胞從骨中動員出的性質[1] 而建立 的IL-8動員中性粒細胞家兔體內實驗。這類方法最直觀地反映生物活性，但涉及整體動物 ，費時費力，靈敏度不高，變異較大。
1.1.2離體組織（細胞）分析如NGF刺激雞背根神經節增長，縮宮素 的大鼠離體子宮法等。 隨著分子生物學的發展，許多特異性強，靈敏度高的依賴細胞株被建立，細胞培養已是最常 用的方法。根據蛋白多肽與細胞相互作用的機理不同，具體的操作亦有多種。如細胞增殖法 （Proliferation assays）,快速靈敏,但特異性稍差; 抑制增殖法(Antiproliferation as s ays),檢測系統簡單,靈敏而專一; 減少細胞損傷法(Cytopathic effect rection assays ) [2],則是依據具有抗病毒活性的葯物如干擾素，保護細胞不受病毒損傷, 方法直觀 靈敏, 但 可能會受到多肽亞型的干擾。以上的方法都是以細胞數目的增減為量效指標，計數方法有直 接計數法和間接計數法，後者包括MTT法，同位素（3H,14C）摻入法 等。此外，還有根據蛋 白多肽與細胞間接作用進行檢測，如與免疫檢測聯用的抗體誘導法[3]，結合酶反 應的酶誘 導分解法[4]等。總的說來，細胞培養法多具有靈敏特異，客觀可靠的優點，但其 不足也顯 而易見。首先，生物檢定法無法定量失去活性的小代謝物，無法示蹤它們的體內動態；其次 ，樣品多存在於人或動物血清中，血清中內源物質的干擾以及可能存在的內源因子的交叉反 應，影響了方法的專屬性；再者，啟動生物過程常需閾量細胞因子從而降低了方法的靈敏度 ；依賴株細胞長期培養易發生變異而影響檢測的特異性。
1.2免疫學方法
免疫學方法是利用蛋白多肽葯物抗原決定簇部位的單克隆或多克隆抗體特異地識別被檢葯物 ，再以放射計數，比色等方法予以定量，即將特異的抗原抗體反應配以靈敏檢測的方法。常 用的方法有三種。
1.2.1放射免疫法（Radioimmunoassays RIA）該法是被測葯物（Ag ）,標記葯物（多為125I-Ag）與抗體（Ab）的競爭性結合反應，方法的特異性 取決於抗原抗體的親和力及標記葯 物的純度，與生物檢定法相比，有簡明，易於控制的優點。
1.2.2免疫放射定量法（Immunoradiometrec assays IRMA）該法中 被測葯物依然是Ag，它 先與固定相上的Ab形成Ab∶Ag復合物，再與標記抗體125I-Ab結合，形成Ab∶Ag ∶125I-Ab夾心 狀。由於Ag需有兩個Ab來識別，這就大大增加了方法的特異性，是一靈敏而低變異的方法， 只是對標記抗體的純度要求很高。
1.2.3酶聯免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assays ELISA）ELISA的原理與IRMA相 似，只是第二個抗體不是用碘標，而是用可以與底物發生顯色反應的酶如HRP來標記，與上 述兩法相比，ELISA具有使用壽命長，重復性好，無輻射源的優點，並且已有不少實驗證明 ，它與生物檢定法具有一定的量效關系[4]及相關性[5]，提示它可部分地 反映葯物的生物活性。
免疫學方法的缺點在於它測定的是蛋白多肽的免疫活性而不是生物活性；不能同時測定代謝 物，且具有抗原決定簇的代謝片段可能增加結果誤差；不同來源的抗體與相同的蛋白多肽反 應可能有較大的差別；還可能受到內源物質的干擾。但免疫法畢竟是一種迅速，靈敏，適於批處理的方法，已有數十種蛋白多肽被開發成能滿足葯物動力學研究的商品葯盒。臨床 葯動學領域，免疫法已逐漸取代生物檢定法。
1.3同位素標記示蹤法
放射性同位素標記技術是研究蛋白多肽在生物體內處置的一種最常用的方法。所使用的同位 素有125I, 99mTc, 3H,14C, 35S 等，其中125I因比放射性高，半衰期適宜，標記制備簡單 而最為常用。標記方法有兩種，一是內標法，即把含有同位素的氨基酸加入生長細胞或合成 體系，該法對生物活性地影響可能較小，但由於制備復雜而限制了其廣泛應用；二是外標法 ，常用化學方法如氯胺T或Iodogen法將125I連接於大分子上，因相對簡單而被首 選。
同位素法具有簡便直觀，檢測迅速的優點，尤其適用於蛋白多肽葯物的組織分布研究，但其 缺點亦顯而易見。首先，它不能進行人體葯物動力學研究；其次，同位素標記後是否會引起 葯物的生物活性及其在生物體內的代謝行為發生變化，一直存在爭議．前者可通過調整反應 條件和生物檢定法加以改善和驗證，基本上可使生物活性無明顯變化；後者因葯而異則復雜 的多，已有報道認為[6]，放射性標記法可干擾表皮生長因子與細胞的相互作用， 從而導致 其體內清除的紊亂；最後，由於蛋白多肽進入體內會被降解代謝，或與其它蛋白質結合，總 的放射性不能代表葯物動力學過程，因此如何鑒別樣品的原葯，降解物及結合物是該法中需 解決的關鍵問題，常用的方法有兩種。
1.3.1SDS-PAGE法根據葯物Mr的大小選擇不同濃度的凝膠電 泳，通過控制電流等條件使得原 葯與其它產物分開，然後通過切割膠條放射計數或放射自顯影的方法，來檢測電泳放射性圖 譜。該法具有較高的解析度和靈敏度，但電泳過程中，125I-小肽和游離 125I可能擴散至空白凝膠或電解液中，從而使結果可能偏高。
1.3.2HPLC法高效反相色譜（RHPLC），高效排阻液相色譜（SEHPLC ）[7]，高效離子交換液相色 譜（IEHPLC）分別根據保留時間與蛋白多肽的疏水-親水性特徵，Mr大小，極性的 關系 來分離樣品中的物質。它們共同的優點是特異性高，解析度好，可同時測定原葯和降解物， 其中SEHPLC亦可得到結合物的信息，而RHPLC用於蛋白多肽的分離有獨特的優越性。但因受 注入樣品量的限制，靈敏度，重現性都受影響，且設備昂貴，成本較高。
1.3.3 HPLC-RAD法
高效液相偶聯同位素在線檢測系統。這種方法將HPLC的高度分析分離行為和同位素的高靈敏度檢測結合在一起。使得葯物的分析分離更加直觀和方便。特別在蛋白質多肽類葯物葯動學方面體現了其獨特的優點。
1.4色譜法
1.4.1HPLC在進行普通葯物動力學研究中，HPLC是技術成熟，應用廣 泛的分析手段。在蛋 白多肽葯物的實驗研究或產業化中，HPLC都是主要的分離純化工具。但鑒於蛋白多肽葯物結 構的特殊性，除了一些小分子多肽，如peptichemio[8]，加壓素的八肽拮抗劑（oc tapeptid e antagonist of vasopressin）[9]可分別直接或經選擇性柱反應後,單獨 用帶熒光檢測 器的HPLC進行葯動學研究外，HPLC常需進一步改進或與其它更靈敏的檢測技術聯用方能滿足 葯動學的需要。除了上述提及的與同位素的聯用，還有許多與免疫學方法的聯用，如Philli ps[10]採用免疫親和色譜技術分析人三種不同體液中粒細胞集落刺激因子的濃度； Partilla [11]等認為HPLC與RIA聯用可以檢測人體液中的神經肽。此外，令人矚目的還有液 /質在線聯用（LC-MS）。
LC-MS將高分離能力，適用范圍廣泛的色譜分離技術與高靈敏、專屬及通用,在研究蛋 白多肽的結構中具有重要價值的質譜法聯用起來，成為強有力的分離分析方法。多年來限制 LC-MS技術發展的決定因素是介面問題，由傳送帶介面（Moving-belt interface），熱噴 霧 介面（Thermospray），到最近的電噴霧離子化介面（Electrosptay ionization ESI），聯 用技術日趨成熟，尤其適用於生物樣品中低濃度（pg/ml）葯物及代謝物的測定[12] ，而蛋 白多肽類葯物恰有在體內代謝快，濃度低的特點。國外已將用LC-MS於該類葯物，葯物代 謝 物[13，14]的動力學研究，國內尚處於起步階段，除了儀器本身價格昂 貴，技術上亦存在 一些問題，如它對樣品的純度要求很高如何將葯物從生物體液，尤其是血漿中提取純化以 減少干擾；如何選擇合適的內標以減少系統誤差；在將LC-MS用於檢測體育禁用肽(HCG,HGH ,EPO,ACTH等)時發現，糖肽難用於質譜分析，因為在質譜條件下，同樣的氨基酸序列可產生 多種不同質量的多糖鏈，而每條鏈及整個分子都有可以產生質譜信號，這就大大降低了質譜 信號的專屬性。盡管LC-MS在蛋白多肽葯物的體內葯物代謝動力學研究中還存在一 定的難度，但其作為實用性強，前景好的領域已引起人們的廣泛關注。
1.4.2高效毛細管電泳（HPCE）HPCE是離子或荷電粒子以電場為驅動 力，在毛細管中按其 濃度和分配系數不同進行高效，快速分離的新技術，它以高解析度，高靈敏度，分析時間短 ，樣品量少及操作簡單等諸多優點而成為蛋白多肽生物分子分離分析的重要手段。在臨床 上 ，生物體液中低濃度蛋白多肽的分析面臨的問題有：蛋白多肽與毛細管壁的相互作用所引起 的遷移時間的改變，這可以通過塗層CE加以改善；由於毛細管很細，管內容積很小，進樣量 的不易控制給實驗的重復性帶來影響，而且很可能無法對低濃度的樣品提供足夠的靈敏度。 國外根據樣品的性質採用不同的預處理，大體上可分為非特異性和高親和性兩種， 將樣品加以濃縮，取得了滿意的效果[15]。HPCE在檢測上的迅速發展與HPLC已有並 駕齊驅之 勢，況且鑒於HPCE在樣品微量分析的優越性，已有人在葯物動力學研究、體內分析中，將微 透析連續采樣與之聯用[16]，這在整個葯動學研究中都不失為一有希望的方向。 2結語
由以上可知，現代科學技術的發展給蛋白多肽類葯物的研究提供了多樣的分析手段，但鑒於 該類葯物的特殊性，尚無一種方法能完全滿足動力學研究的要求。根據人用葯物注冊國 際協調會議（ICH）對生物葯物臨床前安全性評價「在科學基礎上的靈活性和具體情節個別 處理」的總則，人們通常將幾種方法聯合應用，互相補充，才能得到比較可靠的結果。

Ⅲ 多肽純化的方法有哪些

對多肽純化常用的方法包括：鹽析法、超濾法、凝膠過濾法、等電點沉澱法、離子交換層析、親和層析、吸附層析、逆流分溶、酶解法等。這些方法常常組合到一起對特定的物質進行分離純化，同時上述這些方法也是多肽類物質分析中常用的手段。

Ⅳ 論述核酸與蛋白質變性的機制及其在生命活動中的重要意義

生物化學
緒 論 Preface
生物化學（biochemistry）是研究生命化學的科學，它在分子水平上探討生命的本質，即研究生物體的分子結構與功能，物質代謝與調節，遺傳信息的傳遞與調控，及其在生命活動中的作用。
人們通常將研究核酸、蛋白質等所有生物大分子的結構、功能及基因結構、表達與調控的內容，稱為分子生物學。所以分子生物學是生物化學的重要組成部分。
一、生物化學發展簡史
1．初期階段(18世紀—20世記初)
生物化學的研究始於18世紀，但作為一門獨立的科學是在20世紀初期。主要研究生物體的化學組成。
2．蓬勃發展階段（從20世記初—20世記中期）
主要在營養學，內分泌學，酶學，物質代謝及其調控等方面取得了重大進展。
3．分子生物學發展階段（從20世紀中期 至今）
主要有物質代謝途徑的研究繼續發展，重點進入代謝調節與合成代謝的研究。
另外，顯著特徵是分子生物學的崛起。DAN雙螺旋結構模型的提出，遺傳密碼的破譯，重組DNA技術的建立等。
20世紀末始動的人類基因組計劃（human genome project）是人類生命科學中的又一偉大創舉。
以基因編碼蛋白質的結構與功能為重點之一的功能基因組研究已迅速崛起。當前出現的的蛋白質組學（proteomics）領域。
闡明人類基因組功能是一項多學科的任務，因而產生了一門前景廣闊的新興學科-----生物信息學（bioinformatics）。
我國科學家對生物化學的發展做出了重大的貢獻。
二、生物化學研究的主要內容
1．生物分子的結構與功能 2．物質代謝及其調節 3．基因信息傳遞及其調控
三、生物化學與醫學 生物化學是一門重要的醫學基礎課，與醫學有著緊密的聯系。
四、本書綱要 全書分四篇，共23章。
第一篇 生物大分子的結構和功能
生物大分子通常都有一定的分子結構規律，即由一定的基本結構單位，按一定的排列順序和連接方式而形成的多聚體。蛋白質和核酸是體內主要的生物大分子，各自有其結構特徵，並分別行使不同的生理功能。
酶是一類重要的蛋白質分子，是生物體內的催化劑。
本篇將介紹蛋白質的結構、功能；核酸的結核與功能；酶等三章。重點掌握上述生物大分子物質的結構特性，重要功能及基本的理化性質與應用，這對理解生命的本質具有重要意義。
第一章 蛋白質的結構與功能
Structure and Function of Protein
一、授課章節及主要內容：第一章 蛋白質的結構與功能
二、授課對象：臨床醫學、預防、法醫（五年制）、臨床醫學（七年制）
三、授課學時
本章共3節課時（每個課時為45分鍾）。講授安排如下：
第一次課（2學時）：緒論；第一節；第二節。 第二次課（1學時）：第三節，第四節
四、教學目的與要求
目的：通過本章學習掌握蛋白質是由20種氨基酸藉肽鍵組成的生物大分子，是機體的基本結構成分，也是機體各種生理功能的物質基礎，是生命活動的直接體現者。
要求：掌握蛋白質的生物學重要性。掌握蛋白質的分子組成特點和基本單位。掌握蛋白質的分子結構及其與功能的關系。熟悉蛋白質的重要理化性質。了解蛋白質的重要分離和純化方法。
五、重點與難點
重點：1．蛋白質的生物學重要性。2．蛋白質的分子組成特點和基本單位。3．蛋白質的分子結構及其與功能的關系。
難點：蛋白質的分子結構及其與功能的關系。
六、教學方法及授課大致安排
重點講授，復習、提問、小結相結合。 應用多媒體課件。
七、主要外文專業詞彙 protein amino acid isoelectric point polypeptide glutathione(GSH) β-pleated sheat motif chaperon domain subunit fibronectin cytochrome c myoglubin hemoglobin(Hb) ACTH protein denature electrophoresis chromatography allosteric effect
十、授課提綱(或基本內容)
蛋白質是生物體含量最豐富的生物大分子物質，約占人體固體成分的45%，且分布廣泛，所有細胞、組織都含有蛋白質。生物體結構越復雜，蛋白質的種類和功能也越繁多。蛋白質也是機體的功能分子（working molecules）。它參與機體的一切生理活動，機體的各種生理功能幾乎都是通過蛋白質來完成的，而且在其中起著關鍵作用，所以蛋白質是生命的物質基礎。
第一節 蛋白質的分子組成
Conformation of Protein Molecules
一、蛋白質的元素組成
組成蛋白質的元素除含有碳、氫、氧外都含有氮。有些蛋白質還含有少量硫、磷、鐵、錳、鋅、銅、碘等。
大多數蛋白質含氮量比較接近，平均為16%，這是蛋白質元素組成的一個特點。
蛋白質的元素組成中含有氮，是碳水化物、脂肪在營養上不能替代蛋白質的原因。
二、 氨基酸
氨基酸（amino acid）是組成蛋白質的基本單位。組成人體蛋白質的氨基酸僅有20種。其化學結構式有一個共同特點，即在連接羧基的α碳原子上還有一個氨基，故稱α氨基酸(除甘氨酸外)。
（一）氨基酸的結構
組成人體蛋白質的20種氨基酸，其結構可由下列通式表示（圖1-1 見六版教材圖1-1）。
各種氨基酸在結構上有下列特點。
1．組成蛋白質的氨基酸，除甘氨酸外，均屬L-α-氨基酸。
2．不同的L-α-氨基酸，其側鏈（R）不同。
（二）氨基酸的分類
根據氨基酸側鏈R基團的結構和性質，可將20種氨基酸分成四類。
1. 非極性疏水性氨基酸 2．極性中性氨基 3．酸性氨基酸 4．鹼性氨基酸
在蛋白質的修飾過程中，蛋白質分子中20種氨基酸殘基的某些基團還可被甲基化、甲醯化、乙醯化、異戊二烯化和磷酸化等。
（三）氨基酸的理化性質
1.兩性解離及等電點：所有氨基酸都含有鹼性的α-氨基和酸性的α-羧基，因此氨基酸是一種兩性電解質，具有兩性解離的特性。
2.紫外吸收性質 根據氨基酸的吸收光譜，含有共軛雙鍵的色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm波長附近(圖1-3)。
3.茚三酮反應：可作為氨基酸定量分析方法。
三、 肽（peptides）
一肽(peptide)
在蛋白質分子中由一分子氨基酸的α-羧基與另一分子氨基酸的α-氨基脫水生成的鍵稱為肽鍵（peptide bond）。肽鍵是蛋白質分子中基本的化學鍵。如由 二個氨基酸以肽鍵相連形成的肽稱為二肽，相互之間以肽鍵相連。二肽還可通過肽鍵與另一分子氨基酸相連生成三肽。此反應可繼續進行，依次生成四肽、五肽……。由10個以內的氨基酸由肽鍵相連生成的肽稱為寡肽（oligopeptide），由更多的氨基酸借肽鍵相連生成的肽稱為多肽（polypeptide）。多肽是鏈狀化合物，故稱多肽鏈（polypeptide chain）。多肽鏈中的氨基酸分子因脫水縮合而基團不全，故稱為氨基酸殘基（resie）。多肽鏈中形成肽鍵的4個原子和兩側的α-碳原子成為多肽鏈的骨架或主鏈。構成多肽鏈骨架或主鏈的原子稱為主鏈原子或骨架原子，而餘下的R基團部分，稱為側鏈。多肽鏈的左端有自由氨基稱為氨基末端（aminoterminal）或N-端，右端有自由羧基稱為羧基 末端（carboxylterminal）或C-端。把含有51個氨基酸殘基、分子量為5733的胰島素稱作蛋白質。這似乎是習慣上的多肽與蛋白質的分界線（見六版圖1-4）。
二生物活性肽
⒈谷胱甘肽(glutathione, GSH) GSH是由谷、半胱和甘氨酸組成的三肽。第一個肽鍵與一般不同，由谷氨酸γ-羧基與半胱氨酸的氨基組成(圖1-5)，分子中半胱氨酸的巰基是該化合物的主要功能基團。（見六版圖1-5和圖1-6）。
⒉多肽類激素及神經肽
第二節 蛋白質的分子結構
Molecular Structure of Protein
人體的蛋白質分子是由20種氨基酸借肽鍵相連形成的生物大分子。每種蛋白質都有其一定的氨基酸組成及氨基酸排列順序，以及肽鏈特定的空間排布。從而體現了蛋白質的特性，是每種蛋白質具有獨特生理功能的結構基礎。蛋白質分子結構分成一級結構、二級結構、三級結構、四級結構4個層次，後三者統稱為空間結構、高級結構或空間構象（conformation）。蛋白質的空間結構涵蓋了蛋白質分子中的每一原子在三維空間的相對位置，它們是蛋白質特有性質和功能的結構基礎。由一條肽鏈形成的蛋白質只有一級結構、二級結構和三級結構，由二條或二條以上肽鏈形成的蛋白質才可能有四級結構。
一、蛋白質的一級結構
蛋白質中氨基酸的排列順序稱為蛋白質的一級結構（primary structure）。肽鍵是一級結構的主要化學鍵。有些蛋白質還包含二硫鍵，即由兩個半胱氨酸巰基脫氫氧化而成。圖2-3為牛胰島素的一級結構。（見六版教材圖1-8）。 目前已知一級結構的蛋白質數量已相當可觀，並且還以更快的速度增長。國際互聯網有若乾重要的蛋白質資料庫（updated protein databases），收集了大量最新的蛋白質一級結構及其他資料,為蛋白質結構與功能的深入研究提供了便利。
二、蛋白質的二級結構
蛋白質的二級結構（secandary structure）是指蛋白質分子中某一段肽鏈的局部空間結構，也就是該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置。不涉及氨基酸殘基側鏈的構象。蛋白質的二級結構主要包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規捲曲。
（一）肽單元
構成肽鍵的4個原子和與其相鄰的兩個α碳原子（Cα）構成一個肽單元（peptide unit）。由於參與肽單元的6個原子——Cα1、C、O、N、H、Cα2位於同一平面，故又稱為肽平面（ 見六版教材圖1-9）。
（二）α-螺旋
α-螺旋（α-helix）：蛋白質分子中多個肽單元通過氨基酸α-碳原子的旋轉，使多肽鏈的主鏈圍繞中心軸呈有規律的螺旋上升，盤旋成穩定的α-螺旋構象（ 見六版教材圖1-10）。α螺旋靠氫鍵維持。若氫鍵破壞，則α-螺旋構象即遭破壞。
（三）β-折疊（β-pleated sheet）
每個肽單元以Cα為旋轉點，依次折疊成鋸齒狀結構， 氨基酸殘基側鏈交替地位於鋸齒狀結構的上下方。（圖2-6 見六版教材圖1-11），氫鍵是維持β-折疊結構的主要次級鍵。圖2-6 β-折疊
（四）β-轉角（β-turn）和 無規捲曲（random coil）
β-轉角伸展的肽鏈形成180°回折，即U形轉角結構（圖1-7 見六版教材圖1-11B）。無規捲曲系指沒有確定規律性的那部分肽鏈構象。
（五）模體(motif)
在許多蛋白質分子中，可發現二個或三個具有二級結構的肽段，在空間上相互接近，形成一個特殊的空間構象，被稱為模體。一個模序總有其特徵性的氨基酸序列，並發揮特殊的功能。如在許多鈣結合蛋白分子中通常有一個結合鈣離子的模序。它由α-螺旋-環-α-螺旋三個肽段組成(圖1-12A)。鋅指結構(zinc finger)也是一個常見的模體例子。此模體由1個α-螺旋和2個反平行的β-折疊三個肽段組成(圖1-12B)。由於Zn2+可穩固模體中α-螺旋結構，致使此α-螺旋能鑲嵌於DNA的大溝中，因此含鋅指結構的蛋白質都能與DNA或RNA結合。可見模體的特徵性空間構象是其特殊功能的結構基礎。
（六）氨基酸殘基的側鏈對二級結構形成的影響
蛋白質二級結構是以一級結構為基礎的。一段肽鏈其氨基酸殘基的側鏈適合形成α-螺旋或β-折疊，它就會出現相應的二級結構。
三、蛋白質的三級結構
(一)蛋白質的三級結構（tertiary structure）是指整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置，也就是整條肽鏈所有原子在三維空間的排布位置。
例:Mb（肌紅蛋白）是由153個氨基酸殘基構成的單條肽鏈的蛋白質，含有1個血紅素輔基。可進行可逆的氧合和脫氧，圖1-13
蛋白質三級結構的形成和穩定主要靠次級鍵——疏水鍵、離子鍵（鹽鍵）、氫鍵和Van der Waals力等。疏水性氨基酸的側鏈R基為疏水基團，有避開水，相互聚集而藏於蛋白質分子內部的自然趨勢，這種結合力叫疏水鍵（圖1-11 見六版教材圖1-14）。
圖1-11 維持蛋白質分子構象的各種化學鍵
（二）結構域
分子量大的蛋白質三級結構常可分割成1個和數個球狀或纖維狀的區域，折疊得較為緊密，各行其功能，稱為結構域(domain)。如纖連蛋白(fibronectin)，它由二條多肽鏈通過近C-端的兩個二硫鍵相連而成，含有6個結構域，各個結構域分別執行一種功能，有可與細胞、膠原、DNA和肝素等配體結合的結構域(圖1-15)。
（三）分子伴侶
除一級結構為決定因素外，蛋白質空間構象的正確形成還需要一類稱為分子伴侶(chaperon)的蛋白質參與。分子伴侶通過提供一個保護環境從而加速蛋白質折疊成天然構象或形成四級結構。分子伴侶廣泛地存在於從細菌到人的生物體中，其中有很大一部分被稱之為熱休克蛋白（heat shock protein）。
四、蛋白質的四級結構
在體內有許多蛋白質分子含有二條或多條多肽鏈，才能全面地執行功能。每一條多肽鏈都有其完整的三級結構，稱為蛋白質的亞基（subunit），這種蛋白質分子中各個亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質的四級結構（quaternary structure）。
在四級結構中，各個亞基間的結合力主要是氫鍵和離子鍵維持四級結構。含有四級結構的蛋白質，單獨的亞基一般沒有生物學功能，只有完整的四級結構寡聚體才有生物學功能。亞基分子結構相同,稱之為同二聚體(homodimer),若亞基分子結構不同,則稱之為異二聚體(heterodimer)。血紅蛋白(hemoglobin,Hb)是由2個α亞基和2個β亞基組成的四聚體，兩種亞基的三級結構頗為相似，且每個亞基都結合有1個血紅素（heme）輔基（圖1-16 見六版教材圖1-16）。
五、蛋白質的分類
（一）根據蛋白質組成成分可分成單純蛋白質和結合蛋白質，單純蛋白質只含氨基酸；結合蛋白質，除蛋白質部分外，還含有非蛋白質部分，為蛋白質的生物活性或代謝所依賴。結合蛋白質中的非蛋白質部分被稱為輔基，絕大部分輔基通過共價鍵方式與蛋白質部分相連。輔基的種類也很廣，常見的有色素化合物、寡糖、脂類、磷酸、金屬離子甚至分子量較大的核酸。
（二）蛋白質還可根據其形狀分為纖維狀蛋白質和球狀蛋白質兩大類。
第三節 蛋白質的結構與功能的關系 Relationship of Protein Structure and Function
一、蛋白質的一級結構與功能的關系
（一）蛋白質的一級結構是空間構象的基礎
Anfinsen在研究核糖核酸酶時已發現，蛋白質的功能與其三級結構密切相關，而特定三級結構是以氨基酸順序為基礎的。核糖核酸酶是由124個氨基酸殘基組成的一條多肽鏈，分子中8個半胱氨酸的巰基構成四對二硫鍵(Cys26和Cys84, Cys40和Cys95, Cys58和Cys110, Cys65和Cys72)(圖1-17A)。進而形成具有一定空間構象的球狀蛋白質。用變性劑和還原劑β-巰基乙醇處理該酶溶液，分別破壞二硫鍵和次級鍵，使其空間結構被破壞。但肽鍵不受影響，一級結構仍保持完整，酶變性失去活性。如用透析方法除去尿素和β-巰基乙醇後，核糖核酸酶又從無序的多肽鏈捲曲折疊成天然酶的空間結構，酶從變性狀態復性，酶的活性又恢復至原來水平（圖1-17B見六版教材圖1-17）。這充分證明，只要其一級結構未被破壞，就可能恢復原來的三級結構，功能依然存在，所以多肽鏈中氨基酸的排列順序是蛋白質空間結構的基礎。
（二）一級結構與功能的關系
已有大量的實驗結果證明，一級結構相似的多肽或蛋白質，其空間構象以及功能也相似。
例如不同哺乳類動物的胰島素分子結構都由A和B兩條鏈組成，且二硫鍵的配對和空間構象也極相似，它們都執行著相同的調節糖代謝等的生理功能（表1-2）。
又例如垂體前葉分泌的促腎上腺皮質激素(ACTH)和促黑激素(α-MSH, β-MSH)共有一段相同的氨基酸序列(圖1-18)，因此，ACTH也可促進皮下黑色素生成，但作用較弱。
又例存在於生物界的蛋白質如細胞色素C(cytochrome C)，比較它們的一級結構，可以幫助了解物種進化間的關系(圖1-19)。
但有時蛋白質分子中起「關鍵」作用的氨基酸殘基缺失或被替代，都會嚴重影響空間構象乃至生理功能，甚至導致疾病產生。例如正常人血紅蛋白β亞基的第6位氨基酸是谷氨酸，而鐮刀形貧血患者的血紅蛋白中，谷氨酸變成了纈氨酸，即酸性氨基酸被中性氨基酸替代，僅此一個氨基酸之差，本是水溶性的血紅蛋白，就聚集成絲，相互粘著，導致紅細胞變形成為鐮刀狀而極易破碎，產生鐮刀形紅細胞性貧血（sickle cell anemia）。這種由蛋白質分子發生變異所導致的疾病，被稱之為「分子病」，其病因為基因突變所致。
二、蛋白質空間結構與功能的關系
體內蛋白質所具有的特定空間構象都與其發揮特殊的生理功能有著密切的關系。
（一）肌紅蛋白和血紅蛋白結構
肌紅蛋白(myoglubin， Mb)與血紅蛋白都是含有血紅素輔基的蛋白質。血紅素是鐵卟啉化合物(圖1-20)，它由4個吡咯環通過4個甲炔基相連成為一個環形，Fe2+ 居於環中。從X線衍射法分析獲得的肌紅蛋白的三維結構(圖1-13)中，可見它是一個只有三級結構的單鏈蛋白質，氨基酸殘基上的疏水側鏈大都在分子內部，富極性及電荷的則在分子表面，因此其水溶性較好。Mb分子內部有一個袋形空穴，血紅素居於其中。
血紅蛋白(hemoglubin，Hb)具有四個亞基組成的四級結構(圖1-16)，每個亞基結構中間有一個疏水局部，可結合1個血紅素並攜帶1分子氧，因此一分子Hb共結合4分子氧。成年人紅細胞中的Hb主要由兩條α肽鏈和兩條β肽鏈(α2β2)組成，α鏈含141個氨基酸殘基，β鏈含146個氨基酸殘基。胎兒期主要為α2γ2，胚胎期為α2ε2。Hb各亞基的三級結構與Mb極為相似。Hb亞基之間通過8對鹽鍵(圖1-21)，使四個亞基緊密結合而形成親水的球狀蛋白。
（二）血紅蛋白的構象變化與結合氧
Hb與Mb一樣可逆地與O2結合，氧合Hb占總Hb的百分數(稱百分飽和度)隨O2濃度變化而變化。圖1-22為Hb和Mb的氧解離曲線，前者為S狀曲線，後者為直角雙曲線。可見，Mb易與O2結合，而Hb與O2的結合在O2分壓較低時較難。為什麼？根據S形曲線的特徵可知，Hb中第一個亞基與O2結合以後，促進第二及第三個亞基與O2的結合，當前三個亞基與O2結合後，又大大促進第四個亞基與O2結合，這種效應稱為正協同效應(positive cooperativity)。協同效應的定義是指一個亞基與其配體(Hb中的配體為O2)結合後，能影響此寡聚體中另一亞基與配體的結合能力。如果是促進作用則稱為正協同效應; 反之則為負協同效應。還可根據Perutz等利用X線衍射技術分析Hb和氧合Hb結晶的三維結構圖譜，提出了解釋O2與Hb結合的正協同效應的理論。未結合O2時，Hb的α1/β1和α2/β2呈對角排列，結構較為緊密，稱為緊張態(tense state, T態)，T態Hb與O2的親和力小。隨著O2的結合，4個亞基羧基末端之間的鹽鍵（圖1-21）斷裂，其二級、三級和四級結構也發生變化，使α1/β1和α2/β2的長軸形成15°的夾角(圖1-23)，結構顯得相對鬆弛，稱為鬆弛態(relaxed state, R態)。圖1-24顯示Hb氧合與脫氧時T態和R態相互轉換的可能方式。此種一個氧分子與Hb亞基結合後引起亞基構象變化，稱為變構效應(allosteric effect)。小分子O2稱為變構劑或效應劑，Hb則被稱為變構蛋白。變構效應具有普遍生物學意義。
（三）蛋白質構象改變與疾病
若蛋白質的折疊發生錯誤，盡管其一級結構不變，但蛋白質的構象發生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導致疾病發生，有人將此類疾病稱為蛋白構象疾病。有些蛋白質錯折疊後相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的澱粉樣纖維沉澱，產生毒性而致病，表現為蛋白質澱粉樣纖維沉澱的病理改變，這類疾病包括人紋狀體脊髓變性病、老年痴呆症、亨丁頓舞蹈病（Huntington disease）、瘋牛病等。
第四節 蛋白質的理化性質及其分離純化 The Characters of Protein and its Purification
一、蛋白質的理化性質
（一）蛋白質的兩性電離
蛋白質是由氨基酸組成，其分子末端除有自由的α-NH2和α-COOH外，許多氨基酸殘基的側鏈上尚有可解離的基因，這些基團在溶液一定pH條件下可以解離成帶負電荷或正電荷的基團。當蛋白質溶液在某一pH時，蛋白質解離成正負離子的趨勢相等，即成兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質的等電點（isoelectric point,PI）。蛋白質溶液的pH大於等電點時，該蛋白質顆粒帶負電荷，小於等電點時則帶正電荷。
（二）蛋白質的膠體性質
蛋白質是生物大分子，分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達1～100nm，為膠粒范圍之內。（三）蛋白質的變性、沉澱和凝固
在某些物理和化學因素作用下，其特定的空間構象被破壞，也即有序的空間結構變成無序的空間結構，從而導致其理化性質的改變和生物活性的喪失，稱為蛋白質的變性(denaturation)。
1． 蛋白質變性的特徵：蛋白質變性的主要特徵是生物活性喪失。
2． 蛋白質變性的本質：一般認為蛋白質的變性主要發生二硫鍵和非共價鍵的破壞，蛋白質變性是蛋白質空間構象的改變或破壞，不涉及一級結構中氨基酸序列的改變。
3． 蛋白質變性的意義：在臨床醫學上，變性因素常被應用來消毒及滅菌。此外, 防止蛋白質變性也是有效保存蛋白質制劑(如疫苗等)的必要條件。
4. 若蛋白質變性程度較輕，去除變性因素後，有些蛋白質仍可恢復或部分恢復其原有的構象和功能，稱為復性(renaturation)。圖1-17所示。但是許多蛋白質變性後，空間構象嚴重被破壞，不能復原，稱為不可逆性變性。
5. 蛋白質經強酸、強鹼作用發生變性後，仍能溶解於強酸或強鹼溶液中，若將pH調至等電點，則變性蛋白質立即結成絮狀的不溶解物，此絮狀物仍可溶解於強酸和強鹼中。如再加熱則絮狀物可變成比較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶於強酸和強鹼中，這種現象稱為蛋白質的凝固作用(protein coagulation)。
（四）蛋白質的紫外吸收
蛋白質在280nm波長處有特徵性的紫外吸收，可作蛋白質定量測定。
（五）蛋白質的呈色反應
⒈茚三酮反應(ninhydrin reaction) 蛋白質經水解後產生的氨基酸也可發生茚三酮反應，詳見本章第一節。
⒉雙縮脲反應(biuret reaction) 蛋白質和多肽分子中肽鍵在稀鹼溶液中與硫酸銅共熱，呈現紫色或紅色，稱為雙縮脲反應。氨基酸不出現此反應。
二、蛋白質的分離和純化
（一） 透析及超濾法 （二）丙酮沉澱、鹽析及免疫沉澱（三）電泳（四） 層析（五） 分子篩（六） 超速離心
小 結 Summary
蛋白質是重要的生物大分子，在體內分布廣泛，含量豐富，種類繁多。每一種蛋白質都有其特定的空間構象和生物學功能。
組成蛋白質的基本單位為L-α-氨基酸，共有20種，可分為非極性疏水性氨基酸、極性中性氨基酸、酸性氨基酸和鹼性氨基酸四類。氨基酸屬於兩性電解質，在溶液的pH等於其pI時，氨基酸呈兼性離子。氨基酸可通過肽鍵相連而成肽。小於10個氨基酸組成的肽稱為寡肽，大於10個則稱為多肽。體內存在許多如GSH、促甲狀腺釋放激素和神經肽等重要的生物活性肽。
復雜的蛋白質結構可分成一級、二級、三級和四級結構四個層次。蛋白質一級結構是指蛋白質分子中氨基酸自N端至C端的排列順序，即氨基酸序列，其連接鍵為肽鍵，還包括二硫鍵的位置。形成肽鍵的6個原子處於同一平面，構成了所謂的肽單元。二級結構是指蛋白質主鏈局部的空間結構，不涉及氨基酸殘基側鏈構象。主要為α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規捲曲，以氫鍵維持其穩定性。在蛋白質分子中，空間上相互鄰近的二個或三個具有二級結構的肽段，完成特定的生物學功能，稱之為模體。三級結構是指多肽鏈主鏈和側鏈的全部原子的空間排布位置。三級結構的形成和穩定主要靠次級鍵。一些蛋白質的三級結構可形成1個或數個球狀或纖維狀的區域，各行其功能，稱為結構域。四級結構是指蛋白質亞基之間的締合，也主要靠次級鍵維系。根據蛋白質的形狀，可分成球狀蛋白質和纖維狀蛋白質。根據組成成分，還可分成單純蛋白質和結合蛋白質，前者僅含有氨基酸，後者除氨基酸外，還含有非蛋白質的輔基成分。

Ⅳ 核酸的檢測方法和含量測定

不知道誰知道順便也告訴我下

康恩健核酸膠囊
本品是以現代分子生物學為理論基礎，採用酶切等高新技術精製而成的功能保健食品，富含核酸及蛋白多肽和多種微量元素及維生素，本品具有廣泛的生理活性，是天然的代謝激活劑與能量補充劑，能夠有效調節新陳代謝，激發體內潛能，使智力和體力更加活躍，充沛；顯著提高機體免疫力；增強體質，改善微循環，及時消除體內有害物質，具有益智、安神、抗疲勞、抗衰老、防病健身的作用。服用康恩健核酸（基因營養素）。能夠促進病體的自主康復進程，提高自身的健康狀況，從而達到不葯而愈，不葯而康的科學保健目的。
脫氧核糖核酸 核糖核酸 核酸是什麼 核酸的功能 小分子核酸 正分子核酸 核酸膠囊 康恩健核酸 核酸肽酶
核酸ppt 核酸保健品 核酸的基本單位 核酸酶 核酸的作用

【功效成份及含量】每100g含：核糖核酸大於60g、維生素C 11.8g
【保健功能】免疫調節
【適宜人群】免疫力低下者
【不適宜人群】痛風患者
【食用方法及食用量】每日2次，每次2粒
【規格】400mg／粒
【保質期】24個月
【貯藏方法】置陰涼乾燥處
【注意事項】本品不能代替葯物
脫氧核糖核酸 核糖核酸 核酸是什麼 核酸的功能 小分子核酸 正分子核酸 核酸膠囊 康恩健核酸 核酸肽酶
核酸ppt 核酸保健品 核酸的基本單位 核酸酶 核酸的作用

1.含量高的核酸

每100克含核酸大於60g；(核酸類產品主要是補充核酸)

2.更高品質的核酸
康恩健核酸主要原料是核酸、維生素C，同時借鑒美國配方中大豆低聚肽和核酸酶的協調作用，品質更高，效果更好。

3.好吸收的核酸
採用了最先進的工藝，酶解、酶切技術(預消化處理)，在活性酶、小分子肽和輔酶促進作用下、臨床試驗吸收率高達97%以上。

4.更全面更均衡的核酸
由核酸酶解(預消化處理)而成的小分子核苷酸、寡核苷酸、鹼基，營養基因更全面更均衡。

5.更便宜的核酸
康恩健核酸採用技術授權，指定GMP廠加工分裝等先進的生產經營模式，減低成本，產品更具優勢，使消費者花同樣的錢，買更多的產品。
脫氧核糖核酸 核糖核酸 核酸是什麼 核酸的功能 小分子核酸 正分子核酸 核酸膠囊 康恩健核酸 核酸肽酶
核酸ppt 核酸保健品 核酸的基本單位 核酸酶 核酸的作用

Ⅵ 關於多肽的結構分析

化學的方法是埃德曼降解法,這種方法是瑞典科學家埃德曼創立的連續測定蛋白質或肽鏈N端氨基酸殘基序列的經典方法.用異硫氰酸苯酯(PTH)等與多肽反應,逐個水解N端氨基酸殘基,依次生成各種PTH-氨基酸,層析鑒定PTH-氨基酸就可從N端逐個確定被測肽段的氨基酸殘基排列順序. 對於含有氨基酸殘基較多的蛋白質,一般採用質譜的方法.質譜轟擊蛋白質是指稱為碎片,根據碎片在電場中的運動情況確定質荷比,在根據計算機軟體分析和資料庫確定蛋白質的氨基酸序列.

Ⅶ 急需以下物質的分析方法。氣相或者液相。

你說的這個原因有點難以解決了!現在的專家們還沒有研究出來呢?你要是想看到真正的解釋!請到以下的網站了!我給你介紹一個:
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氣相色譜
揮發性不好的用HPLC
高效液相色譜
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問題補充1：這是同學（化學波士）給的答案。
問題補充2：我對化學是一點都不懂，同學給我提供答案的時候，簡直是雞同鴨講，所以不知道從何問起啊！！！他有時間的時候我再問吧。址會幫助你的!

Ⅷ 生物技術制葯的目錄

第1章 生物技術制葯總論第1節基因工程與基因工程制葯
步驟
一、基因工程
二、基因工程制葯的基本步驟
三、基因工程制葯的具體步驟
第2節細胞工程制葯
一、細胞工程
二、細胞工程制葯
第3節酶工程制葯
一、酶與酶工程
二、酶工程制葯
第4節發酵工程制葯
一、發酵與發酵工程
二、發酵工程制葯
第5節蛋白質工程制葯
一、蛋白質與蛋白質工程
二、蛋白質工程制葯
第6節生物醫學工程與生物信息
工程
一、生物醫學工程
二、生物信息工程
思考題
參考文獻
第2章 基因工程制葯第1節基因克隆表達
一、大腸桿菌表達系統
二、酵母表達系統
三、昆蟲細胞表達系統
第2節各種產物表達形式採用的
分離純化方法
一、大腸桿菌細胞內不溶性表達產物
二、分泌型的表達產物
三、大腸桿菌細胞內可溶性表達產物
四、大腸桿菌細胞周質表達蛋白
第3節表達產物的活性、安全性
評價、穩定性考察
一、生物活性（效價）測定
二、安全性評價
三、穩定性
四、產品
思考題
參考文獻
第3章 細胞工程制葯第1節細胞、細胞工程與細胞
工程制葯
一、細胞
二、細胞工程
三、細胞工程制葯
第2節動物細胞工程制葯
一、動物細胞的全能性
二、動物細胞工程制葯中的轉基因
與細胞培養技術
第3節植物細胞工程制葯
一、植物細胞的特點
二、植物細胞工程葯物研究
三、植物細胞融合與核移植技術
四、轉基因植物葯物技術
五、植物細胞培養工程
六、植物細胞的染色體工程
第4節細胞工程制葯的應用、前景
和存在的問題
一、臨床用細胞工程葯物
二、人源化抗體的研製與「分子葯田」
工程
三、細胞工程葯物的安全性
思考題
參考文獻
第4章 酶工程制葯第1節酶工程制葯概述
一、酶及酶催化特性
二、影響酶催化反應的主要因素
三、酶的分類
四、酶工程和酶工程制葯
第2節酶工程制葯技術
一、葯用酶的生產技術
二、葯物的酶法生產技術
第3節酶工程制葯的現狀與前景
思考題
參考文獻
第5章 發酵工程制葯第1節發酵工程制葯基礎
一、微生物發酵生產的葯物
二、發酵制葯工業中的微生物
第2節微生物制葯發酵工藝
第3節微生物發酵工藝過程的控制
思考題
參考文獻
第6章 蛋白質工程制葯第1節蛋白質工程制葯的概念
一、蛋白質工程制葯研究的核心內容
和基本概念及方法
二、改造蛋白質的一些方法
第2節蛋白質工程制葯方法
一、隨機誘變
二、體外重組
三、蛋白質工程制葯方法的常用目的
第3節蛋白質工程制葯現狀
一、蛋白質定點突變改造
思考題
參考文獻
第7章 核酸類葯物第1節反義核酸葯物
一、反義葯物的作用機制
二、反義葯物的設計策略
三、反義葯物的作用特點
四、反義核酸葯物的合成與純化
第2節短小干擾RNA（siRNA）
一、RNAi的作用機制
二、RNAi的特點
三、siRNA的制備方法
第3節miRNA
一、miRNA的基本特徵
二、miRNA的作用機制
三、siRNA和miRNA的異同
第4節核酸類葯物的臨床試驗現狀
與前景
一、反義核酸類葯物的臨床試驗現狀
與前景
二、RNAi的臨床試驗現狀與前景
思考題
參考文獻
第8章 多肽類葯物第1節多肽類葯物的概念和優點
一、多肽、多肽葯物的概念
二、多肽葯物的優點
第2節多肽葯物的制備
一、固相合成法
二、液相合成法
三、多肽合成儀法
四、酶解法制備多肽
第3節多肽葯物的穩定性、檢測、
制劑與給葯途徑
一、多肽葯物的穩定性
二、多肽類葯物制劑的分析方法
三、多肽類葯物的緩釋制劑研究
四、多肽葯物的給葯途徑
第4節多肽葯物的應用
一、多肽疫苗
二、抗腫瘤多肽
三、抗病毒多肽
四、多肽導向葯物
五、抗菌性活性肽
六、細胞因子模擬肽
七、用於心血管疾病的多肽
八、其他葯用小肽
九、診斷用多肽
思考題
參考文獻
第9章 治療性抗體葯物第1節抗體概述
一、抗體的基本結構
二、抗體的基因組成
三、抗原識別特異性的產生
四、親和力與結合力
五、類別轉換
六、葯物代謝動力學
七、效應功能
第2節治療性小型化抗體
第3節單鏈抗體(ScFv)、單域抗體
第4節重組人鼠嵌合單克隆抗體
第5節重組人源化單克隆抗體
一、人單克隆抗體
第6節抗體葯物與化療葯物
的聯合應用
思考題
參考文獻
Ⅸ……………………Ⅹ第10章 治療性細胞株第1節治療性細胞株——幹細胞
療法
第2節樹突狀細胞共培養的細胞
因子
第3節治療性克隆
第4節核移植與重編程
參考文獻
第11章 細胞因子類葯物第1節重組人干擾素
一、概述
二、IFN的性質、結構和功能
三、IFN的生物學活性和作用機制
四、IFN的基因工程制備
五、IFN的臨床應用及不良反應
第2節重組人白細胞介素
一、概述
二、各類IL
第3節粒細胞集落刺激因子
一、結構與性質
二、G?CSF、GM?CSF的臨床應用
三、G?CSF、GM?CSF的不良反應
四、基因重組人G?CSF和GM?CSF
第4節促紅細胞生成素
一、EPO基因和分子結構
二、EPO的產生及性質
三、重組人EPO的制備
四、臨床應用
五、EPO的不良反應
第5節組織型纖溶酶原激活劑
一、概述
二、性質、結構和功能
三、生物學活性及作用機制
四、基因工程制備t?PA
五、重組t?PA的臨床應用
第6節腫瘤壞死因子
一、概述
二、TNF的分子結構與功能
三、TNF的生物活性和臨床應用
四、TNF的制備
思考題
參考文獻
第12章 基因治療第1節基因治療研究現狀
一、基因治療的現狀
二、目前基因治療存在的問題
第2節基因轉移的方法
一、基因治療的概念及步驟
二、基因轉移方法
第3節基因治療的應用與安全性
一、基因治療的應用
二、基因治療的安全性
思考題
參考文獻
第13章 動物基因工程葯物第1節動物細胞培養
一、動物細胞培養的幾個基本概念
二、動物細胞培養的基本條件
三、動物細胞形態
四、哺乳動物細胞冷凍保存
五、動物細胞的解凍復甦
六、動物細胞的傳代培養
第2節動物轉基因技術
一、動物細胞轉基因技術
二、轉基因動物制備技術
第3節動物反應器與動物基因
工程葯物
一、轉基因動物細胞生物反應器
二、乳腺生物反應器
思考題
參考文獻
第14章 植物基因工程葯物第1節植物基因工程
一、植物表達載體的構建
二、植物轉化
第2節植物基因工程葯物
一、植物基因工程重組蛋白葯物
二、植物次生代謝工程
思考題
參考文獻
第15章 分子靶向葯物第1節概述
第2節細胞信號轉導通路分子靶向
葯物
一、Ras/MAPK通道抑制劑
二、蛋白激酶C抑制劑
三、環氧合酶?2選擇性抑制劑
四、端粒酶抑制因子
五、法基尼轉移酶抑制劑
第3節原癌基因和抑癌基因
的分子靶向葯物
一、原癌基因表達的特點
二、原癌基因的結構改變形式及其
表達激活
第4節細胞因子受體分子靶向葯物
第5節抗腫瘤血管形成分子靶向葯物
第6節小型化抗體靶向葯物
第7節自殺基因
參考文獻
第16章 融合蛋白葯物第1節重組人腫瘤壞死因子受體—
Fc融合蛋白
一、腫瘤壞死因子
第2節重組抗腫瘤融合蛋白
一、融合蛋白與腫瘤
二、融合蛋白與惡性腫瘤的演進
三、融合蛋白在腫瘤治療、預防研究
中的應用
第3節重組人血清清蛋白?干擾素
一、干擾素的產生及其結構特點
二、干擾素的治病原理
三、已上市的衍生干擾素產品
第4節重組人成纖維細胞生長因子
一、αFGF及FGFR的結構和功能
二、生物學功能
三、基因工程表達αFGF現狀
四、αFGF用於臨床應注意的問題
第5節重組人粒細胞巨噬細胞
集落刺激因子
一、人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子
的分子生物學特徵
二、人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子
的臨床應用
三、人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子
轉基因表達研究
第6節白細胞介素
一、種類和結構
二、生物學活性
三、IL的功能
思考題
參考文獻
Ⅺ……………………Ⅻ第17章 治療性激素第1節胰島素
一、胰島素分子
二、胰島素受體與信號轉導
三、重組DNA技術制備胰島素產品
四、用胰島素合成細胞治療糖尿病
第2節人生長激素
一、生長激素釋放因子與抑制因子
二、GH受體、GH的生理作用與
GH的治療作用
三、重組huGH與垂體性矮小
四、huGH的代謝作用
五、GH、泌乳與排卵
第3節促性腺激素
一、重組促性腺激素
二、促性腺激素在獸醫學中的應用
三、促性腺激素釋放激素
第4節其他批准用於臨床的重組
激素
一、重組人甲狀旁腺激素
二、重組降鈣素
三、重組促甲狀腺素
思考題
參考文獻
第18章 血液製品和治療性酶第1節血液代用品
一、右旋糖酐
二、清蛋白
三、明膠蛋白
四、攜氧血液替代品
第2節凝血因子和血友病
一、凝血因子Ⅷ
二、凝血因子Ⅸ、Ⅶa
第3節治療用酶
一、抗凝血酶（AT）
二、溶栓劑
三、超氧化物歧化酶
四、其他治療用酶
思考題
參考文獻
第19章 疫苗技術和分子診斷技術第1節疫苗技術
一、傳統疫苗制劑
二、基因工程疫苗技術與DNA疫苗
三、艾滋病疫苗
四、腫瘤疫苗
五、佐劑技術及作用模式
第2節分子診斷技術
一、分子診斷的概念及原理
二、分子診斷的常用技術方法
第3節分子診斷的臨床應用
一、分子診斷與遺傳疾病
二、分子診斷與傳染性疾病
三、分子診斷與腫瘤
四、分子診斷與個性化治療
思考題
參考文獻

Ⅸ 求一種多糖的分離和葯物活性

2.1 概述
 在自然科學，尤其是生命科學高度發展的今天，蛋白質、酶和核酸等生物大分子的結構與功能的研究是探求生命奧秘的中心課題，而生物大分子結構與功能的研究，必須首先解決生物大分子的制備問題，有能夠達到足夠純度的生物大分子的制備工作為前題，結構與功能的研究就無從談起。然而生物大分子的分離純化與制備是一件十分細致而困難的工作。

 與化學產品的分離制備相比較，生物大分子的制備有以下主要特點：
 ⑴生物材料的組成極其復雜，常常包含有數百種乃至幾千種化合物。
 ⑵許多生物大分子在生物材料中的含量極微，分離純化的步驟繁多，流程長。
 ⑶許多生物大分子一旦離開了生物體內的環境時就極易失活，因此分離過程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制備最困難之處。
 ⑷生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進行的，溫度、pH值、離子強度等各種參數對溶液中各種組成的綜合影響，很難准確估計和判斷。

 生物大分子的制備通常可按以下步驟進行：
 ①確定要制備的生物大分子的目的和要求，是進行科研、開發還是要發現新的物質。
 ②建立相應的可靠的分析測定方法，這是制備生物大分子的關鍵。
 ③通過文獻調研和預備性實驗，掌握生物大分子目的產物的物理化學性質。
 ④生物材料的破碎和預處理。
 ⑤分離純化方案的選擇和探索，這是最困難的過程。
 ⑥生物大分子制備物的均一性（即純度）的鑒定，要求達到一維電泳一條帶，二維電泳一個點，或HPLC和毛細管電泳都是一個峰。
 ⑦產物的濃縮，乾燥和保存。


 分析測定的方法主要有兩類：
 即生物學和物理、化學的測定方法。
 生物學的測定法主要有：酶的各種測活方法、蛋白質含量的各種測定法、免疫化學方法、放射性同位素示蹤法等；
 物理、化學方法主要有：比色法、氣相色譜和液相色譜法、光譜法（紫外／可見、紅外和熒光等分光光度法）、電泳法、以及核磁共振等。
 實際操作中盡可能多用儀器分析方法，以使分析測定更加快速、簡便。

要了解的生物大分子的物理、化學性質主要有：
 ①在水和各種有機溶劑中的溶解性。
 ②在不同溫度、pH 值和各種緩沖液中生物大分子的穩定性。
 ③固態時對溫度、含水量和凍干時的穩定性。
 ④各種物理性質：如分子的大小、穿膜的能力、帶電的情況、在電場中的行為、離心沉降的表現、在各種凝膠、樹脂等填料中的分配系數。
 ⑤其他化學性質：如對各種蛋白酶、水解酶的穩定性和對各種化學試劑的穩定性。
 ⑥對其他生物分子的特殊親和力。

 制備生物大分子的分離純化方法多種多樣，主要是利用它們之間特異性的差異，如分子的大小、形狀、酸鹼性、溶解性、溶解度、極性、電荷和與其他分子的親和性等。
 各種方法的基本原理可以歸納為兩個方面：
 ①利用混合物中幾個組分分配系數的差異，把它們分配到兩個或幾個相中，如鹽析、有機溶劑沉澱、層析和結晶等；
 ②將混合物置於某一物相（大多數是液相）中，通過物理力場的作用，使各組分分配於不同的區域，從而達到分離的目的，如電泳、離心、超濾等。
 目前純化蛋白質等生物大分子的關鍵技術是電泳、層析和高速與超速離心。

 2.2 生物大分子制備的前處理
 2.2.1 生物材料的選擇
 制備生物大分子，首先要選擇適當的生物材料。材料的來源無非是動物、植物和微生物及其代謝產物。
 選擇的材料應含量高、來源豐富、制備工藝簡單、成本低，盡可能保持新鮮，盡快加工處理。
 動物組織要先除去結締組織、脂肪等非活性部分，絞碎後在適當的溶劑中提取，如果所要求的成分在細胞內，則要先破碎細胞。
 植物要先去殼、除脂。
 微生物材料要及時將菌體與發酵液分開。
 生物材料如暫不提取，應冰凍保存。動物材料則需深度冷凍保存。

 2.2.2 細胞的破碎
 不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織，其細胞破碎的難易不一，使用的方法也不相同，如動物臟器的細胞膜較脆弱，容易破碎，植物和微生物由於具有較堅固的纖維素、半纖維素組成的細胞壁，要採取專門的細胞破碎方法。
 (1)機械法：
 1) 研磨：將剪碎的動物組織置於研缽或勻漿器中，加入少量石英砂研磨或勻漿。
 2) 組織搗碎器：這是一種較劇烈的破碎細胞的方法，通常可先用家用食品加工機將組織打碎，然後再用10000r/min～20000r/min的內刀式組織搗碎機(即高速分散器)將組織的細胞打碎。

 (2)物理法：
 1) 反復凍融法：將待破碎的細胞冷至－15℃到－20℃，然後放於室溫(或40℃)迅速融化，如此反復凍融多次，由於細胞內形成冰粒使剩餘胞液的鹽濃度增高而引起細胞溶脹破碎。
 2) 超聲波處理法：此法是藉助超聲波的振動力破碎細胞壁和細胞器。破碎微生物細菌和酵母菌時，時間要長一些。
 3) 壓榨法：這是一種溫和的、徹底破碎細胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa 的高壓下使細胞懸液通過一個小孔突然釋放至常壓，細胞將徹底破碎。
 4) 冷熱交替法：從細菌或病毒中提取蛋白質和核酸時可用此法。在90℃左右維持數分鍾，立即放入冰浴中使之冷卻，如此反復多次，絕大部分細胞可以被破碎。

 (3)化學與生物化學方法：
 1) 自溶法：將新鮮的生物材料存放於一定的pH和適當的溫度下，細胞結構在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下發生溶解，使細胞內含物釋放出來。
 2) 溶脹法：細胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由於存在滲透壓差，溶劑分子大量進入細胞，將細胞膜脹破釋放出細胞內含物。
 3) 酶解法：利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶和酯酶等，於37℃，pH8，處理15分鍾，可以專一性地將細胞壁分解。
 4) 有機溶劑處理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或SDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細胞，可將細胞膜溶解，從而使細胞破裂，此法也可以與研磨法聯合使用。


 2.2.3 生物大分子的提取
 「提取」是在分離純化之前將經過預處理或破碎的細胞置於溶劑中，使被分離的生物大分子充分地釋放到溶劑中，並盡可能保持原來的天然狀態不丟失生物活性的過程。
 影響提取的因素主要有：
 目的產物在提取的溶劑中溶解度的大小；
 由固相擴散到液相的難易；
 溶劑的pH值和提取時間等。
 通常：
 極性物質易溶於極性溶劑，非極性物質易溶於非極性溶劑；
 鹼性物質易溶於酸性溶劑，酸性物質易溶於鹼性溶劑；
 溫度升高，溶解度加大；
 遠離等電點的pH值，溶解度增加。
 提取時所選擇的條件應有利於目的產物溶解度的增加和保持其生物活性。

 ⑴ 水溶液提取：
 蛋白質和酶的提取一般以水溶液為主。稀鹽溶液和緩沖液對蛋白質的穩定性好，溶解度大，是提取蛋白質和酶最常用的溶劑。用水溶液提取生物大分子應注意的幾個主要影響因素是：
 1) 鹽濃度（即離子強度）：
 離子強度對生物大分子的溶解度有極大的影響，有些物質，如DNA-蛋白復合物，在高離子強度下溶解度增加。
 絕大多數蛋白質和酶，在低離子強度的溶液中都有較大的溶解度，如在純水中加入少量中性鹽，蛋白質的溶解度比在純水時大大增加，稱為「鹽溶」現象。鹽溶現象的產生主要是少量離子的活動，減少了偶極分子之間極性基團的靜電吸引力，增加了溶質和溶劑分子間相互作用力的結果。
 為了提高提取效率，有時需要降低或提高溶劑的極性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其極性降低，增加離子強度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4）可以增加溶液的極性。


 2) pH值：蛋白質、酶與核酸的溶解度和穩定性與pH值有關。過酸、過鹼均應盡量避免，一般控制在pH=6～8范圍內，提取溶劑的pH應在蛋白質和酶的穩定范圍內，通常選擇偏離等電點的兩側。
 3) 溫度：為防止變性和降解，制備具有活性的蛋白質和酶，提取時一般在0℃～5℃的低溫操作。
 4) 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：加入抑制劑或調節提取液的pH、離子強度或極性等方法使相應的水解酶失去活性，防止它們對欲提純的蛋白質、酶及核酸的降解作用。

 5) 攪拌與氧化：攪拌能促使被提取物的溶解，一般採用溫和攪拌為宜，速度太快容易產生大量泡沫，增大了與空氣的接觸面，會引起酶等物質的變性失活。因為一般蛋白質都含有相當數量的巰基，有些巰基常常是活性部位的必需基團，若提取液中有氧化劑或與空氣中的氧氣接觸過多都會使巰基氧化為分子內或分子間的二硫鍵，導致酶活性的喪失。在提取液中加入少量巰基乙醇或半胱氨酸以防止巰基氧化。

 ⑵ 有機溶劑提取
 一些和脂類結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶難溶於水、稀鹽、稀酸、或稀鹼中，常用不同比例的有機溶劑提取。
 常用的有機溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮等，這些溶劑可以與水互溶或部分互溶，同時具有親水性和親脂性。
 有些蛋白質和酶既溶於稀酸、稀鹼，又能溶於含有一定比例的有機溶劑的水溶液中，在這種情況下，採用稀的有機溶液提取常常可以防止水解酶的破壞，並兼有除去雜質提高純化效果的作用。
例如，胰島素（見講義p36）。

 2.3 生物大分子的分離純化
 由於生物體的組成成分是如此復雜，數千種乃至上萬種生物分子又處於同一體系中，因此不可能有一個適合於各類分子的固定的分離程序，但多數分離工作關鍵部分的基本手段是相同的。
 為了避免盲目性，節省實驗探索時間，要認真參考和借鑒前人的經驗，少走彎路。常用的分離純化方法和技術有：
 沉澱法（包括：鹽析、有機溶劑沉澱、選擇性沉澱等）、離心、吸附層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析、快速制備型液相色譜以及等電聚焦制備電泳等。本章以介紹沉澱法為主。

 2.3.1 沉澱法
 沉澱是溶液中的溶質由液相變成固相析出的過程。沉澱法（即溶解度法）操作簡便，成本低廉，不僅用於實驗室中，也用於某些生產目的的制備過程，是分離純化生物大分子，特別是制備蛋白質和酶時最常用的方法。通過沉澱，將目的生物大分子轉入固相沉澱或留在液相，而與雜質得到初步的分離。
 其基本原理是根據不同物質在溶劑中的溶解度不同而達到分離的目的，不同溶解度的產生是由於溶質分子之間及溶質與溶劑分子之間親和力的差異而引起的，溶解度的大小與溶質和溶劑的化學性質及結構有關，溶劑組分的改變或加入某些沉澱劑以及改變溶液的pH值、離子強度和極性都會使溶質的溶解度產生明顯的改變。

 在生物大分子制備中最常用的幾種沉澱方法是：
 ⑴中性鹽沉澱（鹽析法）：多用於各種蛋白質和酶的分離純化。
 ⑵有機溶劑沉澱：多用於蛋白質和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分離純化。
 ⑶選擇性沉澱（熱變性沉澱和酸鹼變性沉澱）：多用於除去某些不耐熱的和在一定pH值下易變性的雜蛋白。
 ⑷等電點沉澱：用於氨基酸、蛋白質及其他兩性物質的沉澱，但此法單獨應用較少，多與其他方法結合使用。
 ⑸有機聚合物沉澱： 是發展較快的一種新方法， 主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作為沉澱劑。

 2.3.1.1 中性鹽沉澱（鹽析法）
 在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉澱析出的過程稱為「鹽析」。除了蛋白質和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用鹽析法進行沉澱分離。
 鹽析法應用最廣的還是在蛋白質領域，已有八十多年的歷史，其突出的優點是：
 ①成本低，不需要特別昂貴的設備。
 ②操作簡單、安全。
 ③對許多生物活性物質具有穩定作用。

 ⑴ 中性鹽沉澱蛋白質的基本原理
 蛋白質和酶均易溶於水，因為該分子的－COOH、－NH2和－OH都是親水基團，這些基團與極性水分子相互作用形成水化層，包圍於蛋白質分子周圍形成1nm～100nm顆粒的親水膠體，削弱了蛋白質分子之間的作用力，蛋白質分子表面極性基團越多，水化層越厚，蛋白質分子與溶劑分子之間的親和力越大，因而溶解度也越大。親水膠體在水中的穩定因素有兩個：即電荷和水膜。因為中性鹽的親水性大於蛋白質和酶分子的親水性，所以加入大量中性鹽後，奪走了水分子，破壞了水膜，暴露出疏水區域，同時又中和了電荷，破壞了親水膠體，蛋白質分子即形成沉澱。鹽析示意圖如下頁「圖 4」所示。

 ⑵ 中性鹽的選擇
 常用的中性鹽中最重要的是（NH4）2SO4，因為它與其他常用鹽類相比有十分突出的優點：
 1) 溶解度大：尤其是在低溫時仍有相當高的溶解度，這是其他鹽類所不具備的。由於酶和各種蛋白質通常是在低溫下穩定，因而鹽析操作也要求在低溫下（0～4℃）進行。由下表可以看到， 硫銨在0℃時的溶解度，遠遠高於其它鹽類：
 表2-1 幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克/100毫升水）
 0℃ 20℃ 80℃ 100 ℃
（NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103
 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2
 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101






 2) 分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨
鹽析，一步就可以除去75％的雜蛋白，純
度提高了四倍。
 3) 不易引起變性，有穩定酶與蛋白質結構的
作用。有的酶或蛋白質用2～3mol/L濃度的
（NH4）2SO4保存可達數年之久。
 4) 價格便宜，廢液不污染環境。

 ⑶ 鹽析的操作方法
 最常用的是固體硫酸銨加入法。將其研成細粉，在攪拌下緩慢均勻少量多次地加入，接近計劃飽和度時，加鹽的速度更要慢一些，盡量避免局部硫酸銨濃度過大而造成不應有的蛋白質沉澱。鹽析後要在冰浴中放置一段時間，待沉澱完全後再離心與過濾。
 在低濃度硫酸銨中鹽析可採用離心分離，高濃度硫酸銨常用過濾方法。
 各種飽和度下需加固體硫酸銨的量可由附錄中查出。

 ⑷ 鹽析曲線的製作
 如果要分離一種新的蛋白質和酶，沒有文獻數據可以借鑒，則應先確定沉澱該物質的硫酸銨飽和度。具體操作方法如下(講義p39)：

蛋白質量(mg)或酶活力

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫銨飽
和度％

 ⑸鹽析的影響因素
 1) 蛋白質的濃度：高濃度的蛋白質用稍低的硫酸銨飽和度沉澱，若蛋白質濃度過高，易產生各種蛋白質的共沉澱作用。低濃度的蛋白質，共沉澱作用小，但回收率降低。較適中的蛋白質濃度是2.5％～3.0％，相當於25 mg/mL～30mg/mL。
 2) pH值對鹽析的影響：在等電點處溶解度小，pH值常選在該蛋白質的等電點附近。
 3) 溫度的影響：對於蛋白質、酶和多肽等生物大分子，在高離子強度溶液中，溫度升高，它們的溶解度反而減小。在低離子強度溶液或純水中蛋白質的溶解度大多數還是隨濃度升高而增加的。一般情況下，可在室溫下進行。但對於某些對溫度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力喪失。


 2.3.1.2 有機溶劑沉澱法
 ⑴基本原理
 有機溶劑對於許多蛋白質（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質都能發生沉澱作用，是較早使用的沉澱方法之一。其原理主要是：
 ①降低水溶液的介電常數，向溶液中加入有機溶劑能降低溶液的介電常數，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質分子間的相互作用力，導致蛋白質溶解度降低而沉澱。
 ②由於使用的有機溶劑與水互溶，它們在溶解於水的同時從蛋白質分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質分子的水膜，因而發生沉澱作用。


 有機溶劑沉澱法的優點是：
 ①分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質或其他溶質只在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內沉澱。
 ②沉澱不用脫鹽，過濾比較容易（如有必要，可用透析袋脫有機溶劑）。因而在生化制備中有廣泛的應用。
 其缺點是對某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進行。
 ⑵有機溶劑的選擇和濃度的計算
 用於生化制備的有機溶劑的選擇首先是要能與水互溶。沉澱蛋白質和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。
 為了獲得沉澱而不著重於進行分離，可用溶液體積的倍數：如加入一倍、二倍、三倍原溶液體積的有機溶劑，來進行有機溶劑沉澱。

 ⑶有機溶劑沉澱的影響因素
 1) 溫度：多數生物大分子如蛋白質、酶和核酸在有機溶劑中對溫度特別敏感，溫度稍高就會引起變性，且有機溶劑與水混合時產生放熱反應，因此必須預冷，操作要在冰鹽浴中進行，加入有機溶劑時必須緩慢且不斷攪拌以免局部過濃。
 一般規律是溫度越低，得到的蛋白質活性越高。
 2) 樣品濃度：低濃度樣品回收率低，要使用比例更大的有機溶劑進行沉澱。高濃度樣品，可以節省有機溶劑，減少變性的危險，但雜蛋白的共沉澱作用大。
 通常使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白質初濃度為宜。


 3) pH值：選擇在樣品穩定的pH值范圍內，通常是選在等電點附近，從而提高此沉澱法的分辨能力。
 4) 離子強度：鹽濃度太大或太小都有不利影響，通常鹽濃度以不超過5％為宜，使用乙醇的量也以不超過原蛋白質水溶液的2倍體積為宜，少量的中性鹽對蛋白質變性有良好的保護作用，但鹽濃度過高會增加蛋白質在水中的溶解度，降低了沉澱效果，通常是在低濃度緩沖液中沉澱蛋白質。
 沉澱所得的固體樣品，如果不是立即溶解進行下一步的分離，則應盡可能抽干沉澱，減少其中有機溶劑的含量，如若必要可以裝透析袋透析脫有機溶劑，以免影響樣品的生物活性。

 2.3.1.3 選擇性變性沉澱法
 這一方法是利用生物大分子與非目的生物大分子在物理化學性質等方面的差異，選擇一定的條件使雜蛋白等非目的物變性沉澱而得到分離提純。
 ⑴ 熱變性
 利用生物大分子對熱的穩定性不同，加熱升高溫度使非目的生物大分子變性沉澱而保留目的物在溶液中。
 ⑵ 表面活性劑和有機溶劑變性
 使那些對表面活性劑和有機溶劑敏感性強的雜蛋白變性沉澱。通常在冰浴或冷室中進行。
 ⑶ 選擇性酸鹼變性
 利用對pH值的穩定性不同而使雜蛋白變性沉澱。通常是在分離純化流程中附帶進行的分離純化步驟。

 2.3.1.4 等電點沉澱法
 利用具有不同等電點的兩性電解質，在達到電中性時溶解度最低，易發生沉澱，從而實現分離的方法。氨基酸、蛋白質、酶和核酸都是兩性電解質，可以利用此法進行初步的沉澱分離。
 由於許多蛋白質的等電點十分接近，而且帶有水膜的蛋白質等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉澱析出，因此，單獨使用此法解析度較低，因而此法常與鹽析法、有機溶劑沉澱法或其他沉澱劑一起配合使用，以提高沉澱能力和分離效果。
 此法主要用於在分離純化流程中去除雜蛋白，而不用於沉澱目的物。

 2.3.1.5 有機聚合物沉澱法
 有機聚合物是六十年代發展起來的一類重要的沉澱劑，最早應用於提純免疫球蛋白和沉澱一些細菌和病毒。近年來廣泛用於核酸和酶的純化。其中應用最多的是
「聚乙二醇」【HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n ＞4)】( Polyethylene Glycol 簡寫為 PEG )，它的親水性強，溶干水和許多有機溶劑，對熱穩定，有廣泛圍的分子量，在生物大分子制備中，用的較多的是分子量為6000～20000的 PEG。
 本方法的優點是：
 ①操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。
 ②沉澱效能高，使用很少量的P「EG即可以沉澱相當多
的生物大分子。
 ③沉澱後有機聚合物容易去除。

 2.3.2 透析
 自Thomas Graham 1861年發明透析方法至今已有一百多年。透析已成為生物化學實驗室最簡便最常用的分離純化技術之一。在生物大分子的制備過程中，除鹽、除少量有機溶劑、除去生物小分子雜質和濃縮樣品等都要用到透析的技術。
 透析只需要使用專用的半透膜即可完成。保留在透析袋內未透析出的樣品溶液稱為「保留液」，袋（膜）外的溶液稱為「滲出液」或「透析液」。截留分子量MwCO通常為1萬左右。
 用1％ BaCl2檢查(NH4)2SO4，用1％ AgNO3 檢查NaCl、KCl等。

 2.3.3 超濾
 超過濾即超濾，自20年代問世後，直至60年代以來發展迅速，很快由實驗室規模的分離手段發展成重要的工業單元操作技術。超濾現已成為一種重要的生化實驗技術，廣泛用於含有各種小分子溶質的各種生物大分子（如蛋白質、酶、核酸等）的濃縮、分離和純化。
 超濾是一種加壓膜分離技術，即在一定的壓力下，使小分子溶質和溶劑穿過一定孔徑的特製的薄膜，而使大分子溶質不能透過，留在膜的一邊，從而使大分子物質得到了部分的純化。

 超濾根據所加的操作壓力和所用膜的平均孔徑的不同，可分為微孔過濾、超濾和反滲透三種。
 微孔過濾所用的操作壓通常小於4×104Pa，膜的平均孔徑為500埃～14微米（1微米＝104埃），用於分離較大的微粒、細菌和污染物等。
 超濾所用操作壓為4×104Pa～7×105Pa，膜的平均孔徑為10—100埃，用於分離大分子溶質。
 反滲透所用的操作壓比超濾更大，常達到35×105Pa～140×105Pa，膜的平均孔徑最小，一般為10埃以下，用於分離小分子溶質，如海水脫鹽，制高純水等。

 超濾技術的優點是操作簡便，成本低廉，不需增加任何化學試劑，尤其是超濾技術的實驗條件溫和，與蒸發、冰凍乾燥相比沒有相的變化，而且不引起溫度、pH的變化，因而可以防止生物大分子的變性、失活和自溶。
 在生物大分子的制備技術中，超濾主要用於生物大分子的脫鹽、脫水和濃縮等。
 超濾法也有一定的局限性，它不能直接得到乾粉制劑。對於蛋白質溶液，一般只能得到10～50％的濃度。

 超濾技術的關鍵是膜。
 常用的膜是由乙酸纖維或硝酸纖維或此二者的混合物製成。近年來發展了非纖維型的各向異性膜，例如聚碸膜、聚碸醯胺膜和聚丙烯腈膜等。這種膜在pH 1～14都是穩定的，且能在90℃下正常工作。超濾膜通常是比較穩定的，能連續用1～2年。
 超濾膜的基本性能指標：水通量（cm3/(cm2•h)）；截留率（以百分率％表示）；化學物理穩定性（包括機械強度）等。
 超濾裝置由若干超濾組件構成。分為板框式、管式、螺旋卷式和中空纖維式四種主要類型。
 由於超濾法處理的液體多數是含有水溶性生物大分子、有機膠體、多糖及微生物等。這些物質極易粘附和沉積於膜表面上，造成嚴重的濃差極化和堵塞，這是超濾法最關鍵的問題，要克服濃差極化，通常可加大液體流量，加強湍流和加強攪拌。

 2.3.4 冰凍乾燥
 冰凍乾燥機是生化與分子生物學實驗室必備的儀器之一，因為大多數生物大分子分離純化後的最終產品多數是水溶液，要從水溶液中得到固體產品，最好的辦法就是冰凍乾燥