色譜分析方法驗證包括

Ⅰ 高效液相色譜(HPLC)系統適用性試驗是指哪些內容進行該試驗的目的是什麼

一、在高效液相色譜法系統適用性試驗中，有常用的四個內容：分離度、柱效、重復性和拖尾因子。

1、分離度（resolution，R）——相鄰兩峰的保留時間之差與平均峰寬的比值。也叫解析度，表示相鄰兩峰的分離程度。R≥1.5稱為完全分離。

2、柱效：色譜柱是色譜儀最重要的部件（心臟）。柱子內徑一般為1～6 mm。常用的標准柱型是內徑為4.6 或3.9mm ，長度為15 ～30cm 的直形不銹鋼柱。填料顆粒度5 ～10μm ，柱效以理論塔板數計大約 7000 ～10000。減小填料粒度和柱徑以提高柱效。

3、拖尾因子（tailing factor，T），用以衡量色譜峰的對稱性。也稱為對稱因子或不對稱因子。

二、目的：按各品種項下要求對儀器進行適用性試驗，即用規定的對照品對儀器進行試驗和調整，應達到規定的要求；或規定分析狀態下色譜柱的最小理論板數、分離度和拖尾因子。

(1)色譜分析方法驗證包括擴展閱讀

高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography HPLC）又稱「高壓液相色譜」、「高速液相色譜」、「高分離度液相色譜」、「近代柱色譜」等。

LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決於K，K大的組分保留值大；但也有不同之處，GPC中，流動相對K影響不大，LLPC流動相對K影響較大。

Ⅱ 如何對一種分析方法做驗證試驗

1. 緒論
本指南旨在為申請者提供建議，以幫助其提交分析方法，方法驗證資料和樣品用於支持原料葯和制劑的認定，劑量，質量，純度和效力方面的文件。
本指南旨在幫助申請者收集資料，遞交樣品並資料以支持分析方法。這些建議適用於NDA，ANDA，BLA，PLA及其它們的補充中所涉及的原料葯和制劑。
這些原則同樣適用於二類DMF所涉及的原料葯和制劑。如果使用了其它方法，鼓勵申請者事先和FDA葯品評審中心的官員進行討論，以免出現這種情況，那就是花了人力物力所准備起來的遞交資料後來發現是不可用的。
本指南中所述的分析方法驗證的原則適用於各種類型的分析方法。但是，本指南中特定的建議可能不適用於有些產品所用的特殊分析方法，如生物葯，生物技術葯，植物葯或放射性葯物等。
比如說，許多生物分析是建立在動物挑戰模式，免疫原性評估或其它有著獨特特性的免疫分析基礎上的，在遞交分析方法和分析方法驗證資料時需考慮這些獨特的性質。
而且，許多原料葯和制劑的界定和質量控制所需的生物和免疫化學檢測並不在本指南的范圍之內。
盡管本指南並不專門敘述原料，中間體，賦形劑，包裝材料及原料葯和制劑生產中所用的其它物料的分析方法及分析方法驗證資料的遞交，但是應該應用驗證過的分析方法來分析檢測這些物質。
對於本指南中未提及的關於分析方法驗證和資料提交方面的問題，請向FDA相關的化學評審人員咨詢。
本指南，一旦定稿，將取代FDA於1987年2月份發布的工業指南：分析方法驗證所需提交的樣品和分析資料。
II. 背景
每個NDA和ANDA都必需包括必要的分析方法以確保原料葯和制劑的認定，劑量，質量，純度和效力，還包括制劑的生物利用度(21 CFR 314.50(d)(1) 和314.94(a)(9)(i))。
FDA驗證文件現場備查，可以不與DMF一起交。
必須要有資料來論證所用的分析方法是符合一定的准確度和可靠性標準的。
分析方法驗證是論證某一分析方法適用於其用途的過程。分析方法的驗證過程是從申請者有計劃地系統性收集驗證資料以支持分析方法開始的。
審評化學家會對NDA或ANDA中的分析方法和驗證資料進行評審。
一旦FDA有要求，則NDA或ANDA的申請者必須提交制劑，原料葯，非葯典對照品和空白以使FDA實驗室能對申請者所用分析方法進行評審(21 CFR 314.50(e) and 314.94(a)(10))。
FDA實驗室的分析會論證該分析方法在實驗室內是可以重現的。審評化學家和實驗室分析家會從法規的角度確定該分析方法的適用性。
FDA檢查官會對分析實驗室進行檢查確保用於放行和穩定性實驗的分析方法符合現行的GMP（21CFR part 211)和GLP (21 CFR part 58)。
每個BLA和PLA都必須要有詳細的生產工藝描述，包括分析方法，以說明所生產的產品是符合規定睥安全，純充和效力標準的(21 CFR 601.2(a) and 601.2(c)(1)(iv))。
必須要有資料證明所用的分析方法是符合一定的准確度和可靠性要求的(21 CFR 81211.194(a)(2))。對於BLA，PLA及它們的補充，在所提交的許可證申請中應當要有分析方法和方法驗證這部分的資料，審評委員會會對這部分資料進行評審。
需提供代表性樣品及該樣品所代表批號的檢測結果總結(21 CFR 601.2(a) and 601.2(c)(1)(vi))。評審委員會主席會要求CBER實驗室的分析人員進行分析實驗對申請者的分析方法進行評估，並確認其分析結果。
從驗證的角度來看，所有的分析方法有著同樣的重要性。一般來說，應當要應用已驗證過的分析方法，而不論其是被用於過程式控制制，放行，合格或穩定性實驗。高等每個定量分析方法時都應當要減少其分析誤差。
分析方法和驗證資料應當擺在申請的分析方法和控制章節中提交。本指南的第III到IX章和XI章給出了所需提供資料方面的建議。向FDA實驗室提供樣品和遞交NDA和ANDA中的分析方法驗證資料的信息見第X章。
III分析方法的類型
A. 法定分析方法
法定分析方法是被用來評估原料葯或制劑的特定性質的。USP/NF中的分析方法是法定的用於葯典項目檢測的分析方法。為了確認符合法規，需使用法定分析方法。
B. 替代分析方法
替代分析方法是申請者提出用於代替法定分析方法的分析方法。只有當一替代分析方法相當於或優於法定分析方法時，才可以應用驗證過的替代分析方法。
I如果提交了替代分析方法，申請者還應當提供其理由，並標明其用途（如，放行，穩定性實驗），驗證資料及其與法定分析方法的對比資料。
C. 穩定性指示分析
穩定性指示分析是能檢測出原料葯或制劑的某些性質隨著時間的延長而出現的變化的定量分析方法。
穩定性指示分析能不受降解產物，工藝雜質，賦形劑或其它潛在雜質的影響而准確測定其中的活性成分。
如果申請者遞交了用於放行檢測的非穩定性指示分析方法，則應當要有能定性和定量地監測雜質，包括降解產物，的分析方法對其進行補充。穩定性試驗中所用的含量分析方法應當要有穩定性指示能力，除非有科學的理由能證明其合理性。
IV 標准品
A．標准品的類型
可以從USP/NF處或其它官方(比如說，CBER，21CFR 610.20)獲得標准品 (也就是一級對照品)。如果不能確定一標准品的來源是否會被FDA認為是官方來源，申請者應當要向適當的化學評審人員咨詢。如果沒有官方來源，則被用來作標准品的物質應當要有盡可能高的純度，並得到充分界定。
工作對照品 (也就是內部標准品或二級標准品)是根據一級對照品標定的，並用來代替一級對照品的。
B．分析報告單
對於非官方標准品，在申請的分析方法和控制章節中應當要提供該標准品的分析報告單。對於從官方獲得的標准品，用戶應當要確保標准品的適用性。應當正確儲存標准品並在已確定的時間段內使用該標准品。
C．標准品的界定
從USP/NF及其它官方來源獲得的標准品是不需要進一步界定的。非官方對照品要有盡可能高的純度，並進行充分地界定以確保其結構，劑量，質量，純度和效力。
T用於界定標准品的定性和定量分析方法應當要不同於用於控制原料葯或制劑的結構，劑量，質量，純度和效力的分析方法，要比它們更深入。用於標准品界定的分析方法不應僅僅是和先前的指定標准品進行比較實驗。
一般來說，界定資料應當要包括：
標准品的簡單工藝描述，如果其生產工藝是否於其相應的原料葯的話。應當要敘述制備標准品時所用的補充精製過程。
相關光譜圖，色譜圖，TLC照片及其它儀器輸出的清晰復印件。建立純度的資料。應當要應用適當的檢測方法來獲得這些資料，比如說TLC，GC，HPLC，相溶解分析，適當的熱分析方法及其它必要的分析方法。
適當的化學性質資料，比如結構式，經驗式和分子量等。結構確證資料應當要包括適當的分析測試，比如元素分析，IR，UV,NMR和MS，及適用的官能團分析。還應當要提供具體的結構解析資料。
物理性質的描述，包括顏色和物理形態。 適當的物理常數，比如說熔程，沸程，折射率，離解常數(pK值)和旋光度。用於界定標准品的分析程序的詳細敘述。
至於生物技術/生物產品的標准品，應當要考慮上述建議，可能可以應用。然而，其它確定物理化學性質，結構特性，生物活性和/或免疫化學活性的補充檢測和/或其它檢測將是非常重要的。
物理化學性質包括異構體，電泳和液相色譜行為及光譜性質等。結構界定可能包括氨基酸序列，氨基酸組成，縮氨酸圖和碳水結構。確定生物和/或免疫化學活性的分析方法應當要和用來確定產品效力的分析方法一樣。
Th這些分析方法可以包括基於動物的，細胞培養的，生物化學的或配位體/接受體螯合的分析方法。如果這些檢測需用於某些標准品的界定，生物和免疫化學檢測的分析方法驗證方面的特殊建議並不在本指南的范圍之內。
V．IND中的分析方法驗證
對於IND而言，每個階段的研究都需要有足夠的資料以確保合適的認定，質量，純度，劑量和/或效力。所需的分析方法和方法驗證方面的資料會隨著研究的階段變化而變化(21CFR312.23(a)(7))。
N關於在第1階段研究所需提交的分析方法和方法驗證資料方面的指南，發起人可以參考FDA的指南：葯品（包括結構確定的，有療效的，生物技術產品）第1階段研究的IND申請的內容和格式（1995年11月）。
第2和第3階段研究所需提交的分析方法和方法驗證資料方面的指南，發起人將可以參考FDA的指南：葯品（包括結構確定的，有療效的，生物技術產品）第1階段研究的IND申請的CMC內容和格式（草案，1999年4月）。
在遞交NDA，ANDA，BLA或PLA時，所有的分析方法都應當要開發出來，並得到驗證。
VI．NDA，ANDA，BLA和PLA中分析方法的內容和格式
NDA，ANDA，BLA和PLA中所提交的任一分析方法都應當要有詳細的描述，以使合格的分析人員能重現出所需的實驗條件並獲得和申請者相當的實驗結果。應當要敘述分析方法中需要特殊注意的地方。
如果所用的分析方法是USP/NF或其它FDA認可參考文獻（如，<>）中且所參考的分析方法未經過修改的話，則需提供該分析方法的參引，而不用提供該分析方法的描述（21 CFR 211.194）。
對於從其它公開發表的文獻上獲得的分析方法，應當要對其進行敘述，因為評審官可能並不能很方便的獲得這些文獻。
分析方法描述中需要包括的典型內容如下所示：
A．基本方法
HPLC進行分離的，檢測器為UV檢測器。
B．取樣
需要敘述的有：所選樣品的數目（比如，瓶，片等），它們是如何使用的（也就是，單獨的或是混合樣品），每個樣品分析的重復次數。
C．儀器和儀器參數
需要敘述的有：儀器列表（比如，儀器類型，檢測器，柱子類型，尺寸等）和儀器參數（比如，流速，溫度，運行時間和設定波長等）。如果必要的話，還要提供實驗結構示意圖（比如，闡述噴灑式分析方法的位置）。
D．試劑
需要敘述的有：試劑列表及其相應的規格（比如：USP/NF，美國化學社（ACS）分析試劑）。如果使用的是自製試劑或更改過的商業試劑，則應當要有其制備方法。對於不穩定的或有潛在危險的試劑，應標明其儲存條件，安全使用說明和使用周期。
E．系統適應性實驗
系統適應性實驗參數和合格標準是建立基礎是：儀器，電子元件，分析操作和待測樣品是個不可分割的整體。系統適應性實驗確保系統在樣品分析的時候能很好地運行。在分析方法中應當要包括適當的系統適應性合格標准。
所有的色譜分析方法都應當要有系統適應性實驗及相應的合格標准。CDER評審官指南<<色譜分析方法的驗證>>（1994年11月）對用於評估系統適應性的典型參數進行了定義和討論。
建議系統適應性實驗應成為所有分析方法的一部分，而不僅僅是色譜分析方法。無論是哪類分析方法，都要採用實驗來證實該系統能不受環境條件的影響而正確地運行。比如說，滴定法一般來說需要進行空白實驗。
F．標准品的制備
要有所有標准品溶液（比如，儲備液，工作對照品溶液，內部對照品溶液）的配製方法。
G.操作過程
應當要按操作步驟對操作過程進行逐步敘述。敘述應當要適當包括如下信息：平衡時間，樣品進樣順序和系統適應性或啟動參數。需標明不常見的危險。

Ⅲ 氣相色譜面積歸一法分析方法怎樣做方法驗證

在同一推動力下氣相色譜分析(chromatography)是使混合物中各組分在兩相間進行分配。按流動相可分為氣相色譜(GC)和液相色譜(LC) ，其中一相是不動的（固定相），不同組分在固定相中滯留的時間不同，又稱色層法或者層析法，與固定相發生作用，依次從固定相中流出,另一相（流動相）攜帶混合物流過此固定相

Ⅳ 色譜法分幾種

2. 液相色譜法 (liquid chromatography 簡稱 LC)用液體作流動相的色譜法。 3. 超臨界流體色譜法 (SFC) 用超臨界狀態的流體作流動相的色譜法。 超臨界狀態的流體不是一般的氣體或流體 , 而是臨界壓力和臨界溫度以上高度壓縮的氣體 , 其密度比一般氣體大得多而與液體相似 , 故又稱為 「 高密度氣相色譜法 」 （二）按分離原理分 1. 吸附色譜法（ adsorption chromatography ）： 根據吸附劑表面對不同組分物理吸附能力的強弱差異進行分離的方法。 如：氣一固色譜法、液-固色譜法——吸附色譜 2. 分配色譜法 （partition chromatography ）： 根據不同組分在固定相中的溶解能力和在兩相間分配系數的差異進行分離的方法。 如：氣-液色譜法、液-液色譜法——分配色譜 3. 離子交換色譜法（ion exchange chromatography ） 根據不同組分離子對固定相親和力的差異進行分離的方法。 4. 排阻色譜法（ size exclusion chromatography）： 又稱凝膠色譜法 （gel chromatography ）, 根據不同組分的分子體積大小的差異進行分離的方法。 其中：以水溶液作流動相的稱為凝膠過濾色譜法 ；以有機溶劑作流動相的稱為凝膠滲透色譜法。 5. 親合色譜法 (affinity chromatography) 利用不同組分與固定相共價鍵合的高專屬反應進行分離的方法。 （三）按固定相的形式 1. 柱色譜法（column chromatography ）： 固定相裝在柱中 , 試樣沿著一個方向移動而進行分離。 包括 填充柱色譜法：固定相填充滿玻璃管和金屬管中 開管柱色譜法：固定相固定在細管內壁（毛細管柱色譜法） 2. 平板色譜法 （planer chromatography ）： 固定相呈平面狀的色譜法。 包括 紙色譜法： 以吸附水分的濾紙作固定相； 薄層色譜法：以塗敷在玻璃板上的吸附劑作固定相。|||色譜法（又稱層析法）根據其分離原理可分為：吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜與排阻色譜等。吸附色譜法是利用被分離物質在吸附劑上被吸附能力的不同，用溶劑或氣體洗脫使組分分離；常用的吸附劑有氧化鋁、硅膠、聚醯胺等有吸附活性的物質。分配色譜是利用被分離物質在兩相中分配系數的不同使組分分離；其中一相被塗布或鍵合在固體載體上，稱為固定相,另一相為液體或氣體,稱為流動相。常用的載體有硅膠、硅藻土、硅鎂型吸附劑與纖維素粉等。離子交換色譜是利用被分離物質在離子交換樹脂上交換能力的不同使組分分離；常用的有不同強度的陽、陰離子交換樹脂，流動相為水或含有機溶劑的緩沖液。分子排阻色譜法又稱凝膠色譜法，是利用被分離物質分子量大小的不同導致在填料上滲透程度不同使組分分離；常用的填料有分子篩、葡聚糖凝膠、微孔聚合物、微孔硅膠或玻璃珠等，根據固定相和供試品的性質選用水或有機溶劑作為流動相。 色譜法又可根據分離方法分為：紙色譜法、薄層色譜法、柱色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等。所用溶劑應與供試品不起化學反應,純度要求較高。分析時的溫度,除氣相色譜法或另有規定外，系指在室溫操作。分離後各成分的檢出，應採用各品種項下所規定的方法。採用紙色譜法、薄層色譜法或柱色譜法分離有色物質時，可根據其色帶進行區分，分離無色物質時，可在短波(254nm)或長波(365nm)紫外光燈下檢視，其中紙色譜或薄層色譜也可噴以顯色劑使之顯色，或在薄層色譜中用加有熒光物質的薄層硅膠，採用熒光猝滅法檢視；柱色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法可用接於色譜柱出口處的各種檢測器檢測；柱色譜法還可分部收集流出液後用適宜方法測定。|||氣相色譜法系採用氣體為流動相（載氣）流經裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法。物質或其衍生物氣化後，被載氣帶入色譜柱進行分離，各組分先後進入檢測器，用記錄儀、積分儀或數據處理系統記錄色譜信號。 高效液相色譜法是用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，經進樣閥注入供試品，由流動相帶入柱內，在柱內各成分被分離後，依次進入檢測器，色譜信號由記錄儀或積分儀記錄。 氣相色譜和液相色譜各有其優缺點和應用范圍： 氣相色譜採用氣體作為流動相，由於物質在氣相中的流速比在液相中快得多，氣體又比液體的滲透性強，因而相比液相色譜，氣相色譜柱阻力小，可以採用長柱，例如毛細管柱，所以分離效率高。 由於氣相色譜毋需使用有機溶劑和價格昂貴的高壓泵，因此氣相色譜儀的價格和運行費用較低，且不易出故障。 能和氣相色譜分離相匹配的檢測器種類很多，因而可用於各種物質的分離與檢測。特別是當使用質譜儀作為檢測器時，氣相色譜很容易把分離分析與定性鑒定結合起來，成為未知物質剖析的有力工具。 氣相色譜不能分析在柱工作溫度下不汽化的組分，例如，各種離子狀態的化合物和許多高分子化合物 氣相色譜也不能分析在高溫下不穩定的化合物，例如蛋白質等。 液相色譜則不能分析在色譜條件下為氣體的物質，但卻能分離不揮發、在某溶劑中具有一定溶解度的化合物，例如高分子化合物、各種離子型化合物以及受熱不穩定的化合物（蛋白質、核酸及其它生化物質）。|||色譜法分類 （一）按兩相物理狀態分 1. 氣相色譜法 (gas chromatography 簡稱 GC)用氣體作流動相的色譜法。 2. 液相色譜法 (liquid chromatography 簡稱 LC)用液體作流動相的色譜法。 3. 超臨界流體色譜法 (SFC) 用超臨界狀態的流體作流動相的色譜法。 超臨界狀態的流體不是一般的氣體或流體 , 而是臨界壓力和臨界溫度以上高度壓縮的氣體 , 其密度比一般氣體大得多而與液體相似 , 故又稱為 「 高密度氣相色譜法 」（二）按分離原理分 1. 吸附色譜法（ adsorption chromatography ）： 根據吸附劑表面對不同組分物理吸附能力的強弱差異進行分離的方法。 如：氣一固色譜法、液-固色譜法——吸附色譜 2. 分配色譜法 （partition chromatography ）： 根據不同組分在固定相中的溶解能力和在兩相間分配系數的差異進行分離的方法。 如：氣-液色譜法、液-液色譜法——分配色譜 3. 離子交換色譜法（ion exchange chromatography ） 根據不同組分離子對固定相親和力的差異進行分離的方法。 4. 排阻色譜法（ size exclusion chromatography）： 又稱凝膠色譜法 （gel chromatography ）, 根據不同組分的分子體積大小的差異進行分離的方法。 其中：以水溶液作流動相的稱為凝膠過濾色譜法 ；以有機溶劑作流動相的稱為凝膠滲透色譜法。 5. 親合色譜法 (affinity chromatography) 利用不同組分與固定相共價鍵合的高專屬反應進行分離的方法。 （三）按固定相的形式 1. 柱色譜法（column chromatography ）： 固定相裝在柱中 , 試樣沿著一個方向移動而進行分離。 包括 填充柱色譜法：固定相填充滿玻璃管和金屬管中 開管柱色譜法：固定相固定在細管內壁（毛細管柱色譜法） 2. 平板色譜法 （planer chromatography ）： 固定相呈平面狀的色譜法。 包括 紙色譜法： 以吸附水分的濾紙作固定相； 薄層色譜法：以塗敷在玻璃板上的吸附劑作固定相。|||還有一種現在常用的色譜即：高速逆流色譜，它屬於液－液分配色譜。利用樣品中各組分在兩相溶劑間分配比的差異，進行分離。它是不用固態載體的全液態的液-液分配色譜技術.優點：高效提純，能將樣品中有效成分提純至98％以上理論回收率為100％ ，不存在樣品的不可逆吸附，極大地避免了樣品的變性問題操作簡單，無需太多樣品前處理等。相對於HPLC,溶質的分離原理僅於分配有關，避免了HPLC柱子與柱子之間的重現性差的現象。現在廣泛用於天然產物的制備分離。相關書籍參考《高速逆流色譜分離技術及應用》曹學麗 編著 化學工業出版社|||一）按兩相所處的狀態分類 液體作為流動相，稱為「液相色譜」（liquid chromatograp-hy）；用氣體作為流動相，稱為「氣相色譜」（gas chromatogr-aphy）。固定相也有兩種狀態，以固體吸附劑作為固定相和以附載在固體上的液體作為固定相，所以層析法按兩相所處的狀態可以分為： 液－固色譜（liquid-solid chromatography）液－液色譜（liquid-liquid chromatography） 氣－固色譜（gas-solid chromatography） 氣－液色譜（gas-liquid chromatography）（二）按層析過程的機理分類 吸附層析（adsorption chromatography ）利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異，達到分離鑒定的目的。分配層析（partition chromatography）利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數（或溶解度）不同，而使之分離的方法。 離子交換層析（ion-exchange chromatography ）利用不同組分對離子交換劑親和力的不同，而進行分離的方法。凝膠層析（gelchromatography）利用某些凝膠對於不同組分因分子大小不同而阻滯作用不同的差異，進行分離的技術。 （三）按操作形式不同分類 柱層析（colum chromatography）將固定相裝於柱內，使樣品沿一個方向移動而達到分離。紙層析（paper chrmatography）用濾紙作液體的載體（擔體support），點樣後，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的。薄層層析（thin layper chromatography）將適當粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進行物質的分離和鑒定。 >|||色譜法根據其分離原理可分為：吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜與排阻色譜等 色譜法又可根據分離方法分為：紙色譜法、薄層色譜法、柱色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等。

Ⅳ 高效液相色譜法研究分析方法學有哪些

方法驗證有很多了，論述如下，來源CDE黃曉龍部長的文章

在進行質量研究的過程中，一項重要的工作就是要對質量標准中所涉及到的分析方法進行方法學驗證，以保證所用的分析方法確實能夠用於在研葯品的質量控制。為規范對各種分析方法的驗證要求，我國已於2005年頒布了分析方法驗證的指導原則。該指導原則對需要驗證的分析方法及驗證的具體指標做了比較詳細的闡述。但是文中未涉及各具體指標在驗證時的可接受標准，國際上已頒布的指導原則中也未發現相關的要求。另一方面，大多數葯品研發單位在進行質量研究時，已逐步認識到分析方法驗證的必要性與重要性，大都也在按照指導原則的要求進行分析方法驗證，但驗證完後卻因沒有一個明確的可接受標准，而難以判斷該分析方法是否符合要求。本文結合國外一些大型葯品研發企業在此方面的要求，提出了在對含量測定方法進行驗證時的可接受標准，供國內的葯品研發單位在進行研究時參考。
1．准確度
該指標主要是通過回收率來反映。驗證時一般要求分別配製濃度為80％、100％和120％的供試品溶液各三份，分別測定其含量，將實測值與理論值比較，計算回收率。
可接受的標准為：各濃度下的平均回收率均應在98.0%-102.0%之間，9個回收率數據的相對標准差（RSD）應不大於2.0%。
2．線性
線性一般通過線性回歸方程的形式來表示。具體的驗證方法為：
在80％至120％的濃度范圍內配製6份濃度不同的供試液，分別測定其主峰的面積，計算相應的含量。以含量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸分析。
可接受的標准為：回歸線的相關系數（R）不得小於0.998，Y軸截距應在100％響應值的2％以內，響應因子的相對標准差應不大於2.0%。
3．精密度
1）重復性
配製6份相同濃度的供試品溶液，由一個分析人員在盡可能相同的條件下進行測試，所得6份供試液含量的相對標准差應不大於2.0%。
2）中間精密度
配製6份相同濃度的供試品溶液，分別由兩個分析人員使用不同的儀器與試劑進行測試，所得12個含量數據的相對標准差應不大於2.0%。
4．專屬性
可接受的標准為：空白對照應無干擾，主成分與各有關物質應能完全分離，分離度不得小於2.0。以二極體陣列檢測器進行純度分析時，主峰的純度因子應大於980。
5．檢測限
主峰與噪音峰信號的強度比應不得小於3。
6．定量限
主峰與噪音峰信號的強度比應不得小於10。另外，配製6份最低定量限濃度的溶液，所測6份溶液主峰的保留時間的相對標准差應不大於2.0%。
7．耐用性
分別考察流動相比例變化±5％、流動相pH值變化±0.2、柱溫變化±5℃、流速相對值變化±20％時，儀器色譜行為的變化，每個條件下各測試兩次。可接受的標准為：主峰的拖尾因子不得大於2.0，主峰與雜質峰必須達到基線分離；各條件下的含量數據（n=6）的相對標准差應不大於2.0%。
8、系統適應性
配製6份相同濃度的供試品溶液進行分析，主峰峰面積的相對標准差應不大於2.0%，主峰保留時間的相對標准差應不大於1.0%。另外，主峰的拖尾因子不得大於2.0，主峰與雜質峰必須達到基線分離，主峰的理論塔板數應符合質量標準的規定。

Ⅵ 氣相色譜的方法驗證怎麼做

轉載《分析測試網路網》

色譜方法通常用於原料、葯物、葯物制劑和生物體液中化合物的定性和定量。涉及的成分包括手性的或非手性的葯物、過程雜質、殘留溶媒、附加劑如防腐劑、分解產物、從容器和密閉包裝或製造過程中帶入的可提取和可過濾的雜質、植物葯中的農葯和代謝物等。
試驗方法的目的是得到可信賴的和准確的數據，無論是用於驗收、出廠、穩定性或葯物動力學研究。得到的數據用於葯品開發或批准後的定性和定量，試驗包括原料的驗收、葯物和葯物制劑的出廠、過程檢驗(In- process testing)的質量保證和失效期的建立。
方法的驗證是由葯品的開發者或使用者來檢驗其方法是否達到預期的可靠性、准確度和精密度的過程。得到的數據成為方法的驗證資料的一部分交給CDER.。
方法的驗證對於完成機構滿足檔案要求不是一次性的，開發者和使用者都應驗證其方法的耐用度或耐久性(ruggedness or robustness.)，其他的分析者、用其它相當的儀器，在其它的日期或地點，在葯品生產期限(有效期)全過程，方法都應能夠重現。如果產生數據的方法是可靠的，那麼所得到的驗收、出廠、穩定性或葯物動力學的數據就是可信賴的。驗證的過程和方法的設計應在開發過程中重要的數據產生之前，如果方法改變了，還應該再驗證。
. 色譜類型
色譜是一種技術，通過該技術，樣品中的組分載入液相或氣相中，通過在固定相上由吸附—解吸附來完成。
A. 高效液相色譜 (HPLC)
HPLC分離是基於在樣品在流動相液體和固定相之間的不同分配。一般地說HPLC大體分為以下幾種(未考慮其重要性順序)
1. 手性液相色譜
2. 離子交換色譜
3. 離子對/親和色譜
4. 正相色譜
5. 反相色譜
6. 分子排阻色譜
1. 手性液相色譜
分離光學異構體可在手性固定相上，用衍生化試劑或在非手性固定相上用流動相添加劑形成非對對映體來實現。用作雜質試驗方法時，如果光學異構體雜質在光學異構體葯物之前洗脫，要增加靈敏度。
2. 離子交換色譜
分離基於荷電功能團，樣品負離子(X - )為陰離子，樣品正離子((X + )為陽離子，一般用pH程序洗脫。
3. 離子對/親和色譜
分離基於與目標樣品的專一的化學相互作用。更普遍的反相型用緩沖液和加入的對離子(與被分離的樣品荷相反電荷)分離。分離受pH、離子強度、溫度、濃度和共存的有機溶劑類型的影響。親和色譜，一般用於大分子，使用配合體(共價結合在固體基質上的生物活性分子)，與其同類的抗原(分析介質)反應，生成可逆轉的復合物，通過改變緩沖條件洗脫。
4. 正相色譜
正相色譜為用有機溶劑為流動相和極性的固定相。此時較小極性的組分比較大極性組分更快地洗脫。
5. 反相色譜
報給CDER的最通常的實驗方法是反相HPLC方法， 最通常用紫外檢測器。
反相色譜，一種鍵合相的色譜技術，用水作基本溶劑，選擇性也受溶劑強度、柱溫和pH的影響，一般來說較大極性比較小極性組分洗脫更快。
紫外檢測器可以用於所有色譜，這類檢測器要注意的是燈老化後的靈敏度降低，其靈敏度因(儀器)的設計和/或者製造廠家的不同有小的變異。需要指出，用紫外檢檢測器和反相HPLC組合得到的色譜圖不一定能真實的反映事實，原因是：
•極性比目標化合物大得多的化合物可能被掩蓋(在溶劑前沿或死體積時同時洗脫)。
•極性比目標化合物小得多的化合物洗脫出來晚，甚至保留在柱上。
•紫外吸收系數較低和最大吸收不同的化合物在檢測相對較低濃度的目標分析物時不能被檢出，因為通常只有一個檢測波長。
6. 排阻色譜
也叫凝膠滲漉(permeation)或濾過，分離基於化合物分子大小或水動力學(hydrodynamic)容積。比多孔柱填料孔徑大得多的分子最先洗脫，小分子進入孔隙洗脫晚，其餘的洗脫速率取決於其分子的相對大小。
B. 氣相色譜(GC)
氣相色譜基於揮發性樣品由作為流動相的載氣運載，通過色譜柱內的固定相時發生吸附和解吸附過程進行分離。
通常氣相色譜分析的樣品是低分子量化合物，這些化合物是易揮發的和高溫時穩定的。在這一方面，葯物和葯物制劑中的殘留溶劑適於氣相色譜分析。生成化學衍生物可達到易揮發和熱穩定的目的。
常用的檢測器是用於含碳化合物的火焰離子化檢測器(FID)，用於鹵代化合物的電子捕獲式檢測器(ECD)，用於含硫和含磷化合物的火焰光度檢測器 (FPD)，以及用於含氮或磷化合物的氮磷檢測器(NPD)。氣相色譜也能實現手性分離。填充柱迅速被毛細管取代來改進分離度和分析時間，在氣相色譜上分析物位置與HPLC一樣，用保留時間(Rt)表示。
C. 薄層色譜(TLC)
薄層色譜是一種最簡便普通的色譜技術，分離基於在一端浸於溶劑混合物(流動相)中的薄層板(固定相)上點的樣品移動進行分離，整個系統在密封的缸中進行。
對於本身沒有顏色的化合物，檢出技術包括熒光、紫外和噴霧顯色劑(通用的和專一的)。 分析物在薄層板上的位置用Rf值來表示，Rf值為化合物的移動距離與溶劑前沿的比值。
三種方法，氣相、液相和薄層中，薄層色譜是最普通的試驗方法，因為薄層板上所有的組分都可用適宜的檢測技術檢出。然而通常不如HPLC那麼准確和靈敏。雖然選用適宜的檢測技術，TLC法能見到分析的「全圖」(whole picture) ，但比HPLC分析變異較大。
. 參考標准品(對照品)
參考標准品為經充分鑒定的高純度化合物，色譜方法更大程度上依賴參考標准品來提供准確的數據。因而參考標准品的質量和純度是很重要的，有二類參考標准品，化學的和放射性的。後者應考慮放射標記純度和化學純度。
按照提交方法驗證的樣品和分析數據，指南中的二類化學參考標准品如下：
• USP / NF參考標准品，不需要鑒定。
• 非總目錄標准品，應用合理方法制備，並經充分鑒定，以保證其鑒別、含量、質量和純度達到最高。
應該指出
• 大多數USP / NF參考標准品未標示化合物純度。
• 對非USP參考標准品，提出純度的校正數應包括在試驗方法的計算中。
• 提供的參考標准品中沒有以下雜質，諸如合成過程的結構相似的雜質和其它的過程雜質，如重金屬、殘留溶劑、水分(結合的和非結合的)、植物來源制劑中的農葯和分解產物等。
• 如果在方法中規定，用前參考標准品要乾燥除去殘留溶劑、非結合水分和有時是結合水(取決於乾燥條件)，對易潮解的化合物總是包括乾燥步驟的。但另一方面乾燥可能導致結晶水的損失或引起熱敏感化合物的降解。
色譜方法用外標法和內標法進行定量。
A. 外標法
當參考標准品與樣品在不同的色譜圖上進行分析時，用外標法。定量基於樣品的峰面積/高(HPLC或GC)或強度(TLC)與分析對象、參考標准品的比值。
更適合用外標法的樣品如下：
1.樣品具有單一的目標濃度和狹窄的濃度范圍 ，例如驗收和出廠檢驗。

2.簡便的樣品制備操作。
3. 增加走基線的時間，為檢測可能的額外峰，如雜質試驗。
B. 內標法
加入一種已知純度並且在分析中不產生干擾的化合物至樣品混合液中，定量基於被分析的化合物與內標的響應比值與參考標准品得到的比值進行比較。這一方法很少用於TLC。
更適合用內標法的樣品如下：
1.復雜的樣品制備過程，如多次提取。
2.低濃度的樣品(靈敏度是確定的)，如葯代動力學的研究。
3.在樣品分析中預計是很寬的濃度范圍，如葯物動力學研究。
雖然CDER不規定方法應該用內標或外標法用於定量，但一般的看法是用於驗收、穩定性和TLC用外標法，對生物體液和GC用內標法。
工作濃度為方法中規定的被分析對象的目標濃度。保持樣品濃度與標準的濃度相近可以改善方法的准確性。
建議
1.如果參考標准品的純度校正因子已知，那麼在計算中應該包括。
2.在方法中要規定標准品和樣品的工作濃度。
. 葯物和葯物制劑HPLC驗證的參數
雖然許多種HPLC都可採用，但最普遍上報的方法都是用紫外檢測器的反相HPLC法，以此作為驗證參數的例子。這一方法驗證的規定可以擴展到其它檢測器和其它色譜。對於驗收、出廠或穩定性試驗，准確性應最佳化，因為要表明實測值和真值的差異是最為關注的。
A. 准確性
准確性是衡量測量實驗值和真值的接近程度。推薦葯物和葯物制劑的准確性研究在標示量的80%、100%和120%的水平上來進行的，這與「The Guideline for Submitting Samples and Analytical Data for method Validation」的規定是一致的。
對於葯物制劑，准確性試驗通常是將已知量的葯物 [按重量或體積(溶於稀釋劑)] 以分析對象檢測濃度的線性范圍量加到空白處方內來完成的。對於液體制劑，這是真實的回收率；而對於諸如片劑、栓劑、透皮吸收制劑等，這不能檢測稀釋劑中的賦形劑與活性成分間可能產生的作用。實際上要做一個已知活性葯物量的單個劑量單位(single unit)來進行回收試驗是困難的。准確性試驗評價在賦形劑存在時，在分析葯物制劑的色譜條件下，試驗方法的專屬性。但這只是樣品制備過程和色譜過程中的回收率，而不是製造過程的影響。
在每個推薦檢測濃度重復進樣，其重復進樣的RSD提供了分析方法的變動性，或是試驗方法的精密程度。重復性的均值以標示量的%來表示

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Ⅶ 色譜分析有哪些方法

色譜定性分析的方法：包括純物質對照法、利用保留值經驗規律定性、利用其它方法定性這三種。

色譜分析法的分類比較復雜。根據流動相和固定相的不同，色譜法分為氣相色譜法和液相色譜法。按色譜操作終止的方法可分為展開色譜和洗脫色譜。按進樣方法可分為區帶色譜、迎頭色譜和頂替色譜。

色譜法分離效率高、分離速度快、靈敏度高、可進行大規模的純物質制備。

色譜定性的依據，是在同一特定的色譜條件下，不同的物質在固定相上保留的能力不一樣，因此它們的保留時間不同，也就是說他們的出峰時間不同，可以通過保留時間來進行定性，目前各種色譜定性方法都是基於保留值的。但是不同物質在同一色譜條件下，可能具有相似或相同的保留值。在精度高的色譜上，保留時間可以精確到零點幾秒。從色譜圖中可以得到定性的信息有：被測樣品中有幾種物質，它們大概的比例，從出峰的出峰順度可以粗略的判斷化合物的極性。

Ⅷ 氣相檢驗方法驗證要做哪些驗證內容

檢驗方法的驗證內容：

一、准確度。指用該方法測定的結果與真實值或參考值接近的程度，一般用回收率（%）表示

二、精密度。指在規定的測試條件下，同一個均勻供試品，經多次取樣測定所得結果之間的接近程度，一般用偏差、標准偏差或相對標准偏差表示。

三、專屬性。指在其他成分（如雜質、降解產物、輔料等）可能存在下，採用的方法能正確測定出被測物的特性。色譜法應附代表性圖譜，並標明諸成分在圖中的位置，分離度應符合要求。

四、檢測限。指試樣中被測物能被檢測出的最低量。色譜法一般採用信噪比法。一般以信噪比為3：1或2：1時相應濃度或注入儀器的量確定檢測限。

五、定量限。指試樣中被測物能被定量測定的最低量。其測定結果應具一定準確度和精密度。常用信噪比法確定定量限。一般以信噪比為10：1時相應濃度或注入儀器的量確定定量限。

六、線性。指在設計的范圍內，測量結果與試樣中被測物濃度直接呈正比關系的程度。要求列出回歸方程、相關系數和線性圖。

七、范圍。指能達到一定精密度、准確度和線性，測試方法適用的高低限濃度或量的區間。

八、耐用性。指測定條件有小的變動時，測定結果不受影響的承受程度。氣相色譜法變動因素有：不同品牌或不同批號的同一類型色譜柱、固定相、不同類型的擔體、柱溫、進樣口檢測器溫度等。

Ⅸ 氣相色譜法的分析方法

氣相色譜法的分析方法分為以下幾個步驟：

1、樣品的來源和預處理方法

GC能直接分析的樣品必須是氣體或液體，固體樣品在分析前應當溶解在適當的溶劑中，而且還要保證樣品中不含GC不能分析的組分（如無機鹽），可能會損壞色譜柱的組分。這樣，我們在接到一個未知樣品時，就必須了解的來源，從而估計樣品可能含有的組分，以及樣品的沸點范圍。如能確認樣品可直接分析。如果樣品中有不能用GC直接分析的組分，或樣品濃度太低，就必須進行必要的預處理，包括採用一些預分離手段，如各種萃取技術、濃縮和稀釋方法、提純方法等。

2、確定儀器配置

所謂儀器配置就是用於分析樣品的方法採用什麼進樣裝置、什麼載氣、什麼色譜柱以及什麼檢測器。

3、確定初始操作條件

當樣品准備好，且儀器配置確定之後，就可開始進行嘗試性分離。這時要確定初始分離條件，主要包括進樣量、進樣口溫度、檢測器溫度、色譜柱溫度和載氣流速。進樣量要根據樣品濃度、色譜柱容量和檢測器靈敏度來確定。樣品濃度不超過mg/mL時填充柱的進樣量通常為1-5uL，而對於毛細管柱，若分流比為50：1時，進樣量一般不超過2uL。進樣口溫度主要由樣品的沸點范圍決定,還要考慮色譜柱的使用溫度。原則上講，進樣口溫度高一些有利，一般要接近樣品中沸點的組分的沸點，但要低於易分解溫度。

4、分離條件優化

分離條件優化目的就是要在*短的分析時間內達到符合要求的分離結果。在改變柱溫和載氣流速也達不到基線分離的目的時，就應更換更長的色譜柱，甚至更換不同固定相的色譜柱，因為在GC中，色譜柱是分離成敗的關鍵。

5、定性鑒定

所謂定性鑒定就是確定色譜峰的歸屬。對於簡單的樣品，可通過標准物質對照來定性。就是在相同的色譜條件下，分別注射標准樣品和實際樣品，根據保留值即可確定色譜圖上哪個峰是要分析的組分。定性時必須注意，在同一色譜柱上，不同化合物可能有相同的保留值，所以，對未知樣品的定性僅僅用一個保留數據是不夠的，雙柱或多柱保留指數定性是GC中較為可靠的方法，因為不同的化合物在不同的色譜柱上具有相同保留值的幾率要小得多。

6、定量分析

要確定用什麼定量方法來測定待測組分的含量。常用的色譜定量方法不外乎峰面積（峰高）百分比法、歸一化法、內標法、外標法和標准加入法（又叫疊加法）。峰面積（峰高）百分比法*簡單，但*不準確。只有樣品由同系物組成、或者只是為了粗略地定量時該法才是可選擇的。相比而言，內標法的定量精度，因為它是用相對於標准物（叫內標物）的響應值來定量的，而內標物要分別加到標准樣品和未知樣品中，這樣就可抵消由於操作條件（包括進樣量）的波動帶來的誤差。至於標准加入法，是在未知樣品中定量加入待測物的標准品，然後根據峰面積（或峰高）的增加量來進行定量計算。其樣品制備過程與內標法類似但計算原理則完全是來自外標法。標准加入法定量精度應該介於內標法和外標法之間。

7、方法的驗證

所謂的方法驗證，就是要證明所開發方法的實用性和可靠性。實用性一般指所用儀器配置是否全部可作為商品購得，樣品處理方法是否簡單易操作，分析時間是否合理，分析成本是否可被同行接受等。可靠性則包括定量的線性范圍、檢測限、方法回收率、重復性、重現性和准確度等。