熒光研究方法

A. 什麼是生物熒游標記法熒游標記法在制葯領域又有什麼應用

熒游標記法（Fluorescent Labeling）是利用熒光蛋白或熒光蛋白基因作為標志物對研究對象進行標記的分析方法。常用的熒光蛋白為綠色和紅色兩種，綠色熒光蛋白（GFP）常用的是來源於發光水母的一種功能獨特的蛋白質，分子量為27kD，具有238個氨基酸，藍光或近紫外光照射，發射綠色熒光。紅色熒光蛋白來源於珊瑚蟲，是一種與綠色熒光蛋白同源的熒光蛋白，在紫外光的照射下可發射紅色熒光，有著廣泛的應用前景。其中應用比較廣泛的還是綠色熒光蛋白。2008年，美國加州大學聖迭戈分校生物化學及化學系教授、美國國家科學院院士錢學森堂侄錢永健，美國哥倫比亞大學生物學教授馬丁·沙爾菲，日本有機化學家兼海洋生物學家下村修三人由於在綠色熒光蛋白上的貢獻而獲得化學諾貝爾獎，充分肯定了綠色熒光蛋白在生物研究中的重要地位。但如果應該標記的對象是，則常常是在5』-或3』-端標記熒光素（6-FAM），在熒光顯微鏡就能觀察到現象。

熒游標記法作為探究生物不同生理過程的方法，與同位素示蹤法的作用相似，但它有其後者所不能企及的優點。熒游標記法常用綠色熒光蛋白（GFP）為目標蛋白，通過轉基因技術一起構建到載體上，可跟蹤和判斷生物細胞的分子變化。GFP相對較小，與其他蛋白融合後不影響自身的發光功能；基因序列比較短，可以進行高效轉化；GFP基因沒有物種特異性，在原核、酵母、植物以及動物細胞中都獲得了成功表達，大量表達對細胞沒有毒性；GFP發光是蛋白質本身發光，無需底物，且熒光穩定，適用於定量測定與分析。在科學研究中利用這些特性已經加深了我們對細胞內一些過程的了解，如細胞分裂、染色體復制和分裂、發育和信號轉導等。綠色熒光蛋白不僅在細胞生物學與分子生物學領域得到廣泛的關注和應用，而且經過修飾的綠色熒光蛋白基因還可作為生物探針，對哺乳動物細胞、酵母菌細胞及細菌進行活細胞的基因定位[1]。

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B. 生物熒游標記法是什麼

熒游標記所依賴的化合物稱為熒光物質。熒光物質是指具有共軛雙鍵體系化學結構的化合物，受到紫外光或藍紫光照射時，可激發成為激發態，當從激發態恢復基態時，發出熒光。熒游標記技術指利用熒光物質共價結合或物理吸附在所要研究分子的某個基團上，利用它的熒光特性來提供被研究對象的信息。熒游標記的無放射物污染，操作簡便等優點，使得熒游標記物在許多研究領域的應用日趨廣泛。

熒游標記物質在蛋白的功能研究、葯物篩選等領域也有著廣泛的應用。人們利用利用熒游標記的多肽來檢測目標蛋白的活性，並將其發展的高通量活性篩選方法應用於疾病治療靶點蛋白的葯物篩選和葯物開發（例如，各種激酶、磷酸酶、肽酶等）。因此，多肽的熒光修飾，同樣是多肽合成領域的重要內容。

下面是一些常用的多肽修飾熒光物質：

C. 紫外可見分光光度法與熒光光度法的區別

一、指代不同

1、可見分光光度法：通過測定被測物質在特定波長處或一定波長范圍內光的吸收度，對該物質進行定性和定量分析的方法。

2、熒光光度法：根據物質的熒光譜線位置及其強度進行物質鑒定和含量測定的方法。

二、特性不同

1、可見分光光度法：具有靈敏度高、操作簡便、快速等優點，是生物化學實驗中最常用的實驗方法。許多物質的測定都採用分光光度法。在分光光度計中，將不同波長的光連續地照射到一定濃度的樣品溶液時，便可得到與不同波長相對應的吸收強度。

2、熒光光度法：由於不同的物質其組成與結構不同，所吸收的紫外-可見光波長和發射光的波長也不同，同一種物質應具有相同的激發光譜和熒光光譜，將未知物的激發光譜和熒光光譜圖的形狀、位置與標准物質的光譜圖進行比較，即可對其進行定性分析。

三、作用不同

1、可見分光光度法：在定量分析時，首先需要測定溶液對不同波長光的吸收情況（吸收光譜），從中確定最大吸收波長 ，然後以此波長 的光為光源（單色光），進行吸光度A的測定，是朗伯比爾定律用於定量分析的首要條件。

2、熒光光度法：測量物質的熒光強度可對其進行定量測定。熒光分析法的特點是靈敏度高、選擇性好、樣品用量少和操作簡便。

D. 熒光技術的應用

熒光技術在生物化學及分子生物學研究中應用主要包括以下幾個方面：
1、物質的定性：不同的熒光物質有不同的激發光譜和發射光譜，因此可用熒光進行物質的鑒別。與吸收光譜法相比，熒光法具有更高的選擇性。
2、定量測定：利用在較低濃度下熒光強度與樣品濃度成正比這一關系可以定量分析樣品中熒光組分的含量，常用於測定氨基酸、蛋白質、核酸的含量。熒光定量測定的一個優點是靈敏度高，例如維生素B2的測定限量可達1毫微克/毫升，這一優點使測定時所需要樣品量大大減少。
這種定量測定方法還可應用於酶催化的反應，只要反應前後有熒光強度的變化，就可用來測定酶的含量及酶反應的速率等。
3、研究生物大分子的物理化學特性及其分子的結構和構象：熒光的激發光譜、發射光譜、量子產率和熒光壽命等參數不僅和分子內熒光發色基團的本身結構有關，而且還強烈地依賴於發色團周圍的環境，即對周圍環境十分敏感。利用此特點可通過測定上述有關熒光參數的變化來研究熒光發色團所在部位的微環境的特徵及其變化。在此研究中，除了利用生物大分子本身具有的熒光發色團（如色氨酸、酪氨酸、鳥苷酸等，此類熒光稱為內源熒光）以外，可將一些特殊的熒光染料分子共價地結合或吸附在生物大分子的某一部位，通過測定該染料分子的熒光特性變化來研究生物大分子，這種染料分子被稱為「熒光探針」，它們發出的熒光一般稱為外源熒光。熒光探針的應用，大大地開拓了熒光技術在分子生物學中的應用范圍。
4、利用熒光壽命、量子產率等參數可以研究生物大分子中的能量轉移現象：通過該現象的研究，可以獲得生物大分子內部的許多信息，如分子內兩熒光基團D, A之間的臨界距離可根據弗爾斯特公式來測定，弗爾斯特(Förster)公式如（6）式所示：
即是兩熒光發色團之間的能量傳遞的速率KDA和它們之間的臨界距離Ro的六次方成反比。式中的KDA、K、J等均可由熒光壽命、量子產率及熒光強度的測定來推算，從而可以得知兩基團之間的距離。
以往人們常用熒光偏振做指標來研究生物大分子動力學。近年來人們趨於用熒光偏振隨時間的衰減來研究這些問題。在這種方法中，激發光不是一連續的面偏振光，而是一偏振的光脈沖，因此測得的F∥和F是在兩個不同方向上偏振的熒光隨時間的衰減，它既和熒光壽命τ有關，又與分子在溶液中的運動有關，因此常表示為F∥（t）和 F⊥（t）。由它們可得一相當重要的物理量——各向異性參數A（t）。
由A（t）可推測生物大分子的形狀、分子轉動弛豫時間（即從一個定向的狀態到一個無定向狀態所要的時間），進而可以推知生物大分子的大小、分子在溶液中的轉動角度和時間之間的函數關系。由這些結果可以研究分子之間的相互作用、分子間結合的緊密程度、蛋白質、核酸分子的解聚程度等等。
另外，熒光技術在免疫學中亦有廣泛的應用。最重要的就是熒光抗體法。將某些熒光染料與血清抗體相結合，這種標記的抗體仍可專一地與相應抗原發生結合，形成的復合體具有熒光特性，從而可以確定抗原或抗體的存在及其含量。
5、在醫療診斷中的應用之DNA測序熒光染料： DNA序列的破譯是新世紀基因工程研究的重要前提。近年來，DNA測序的新技術、新方法不斷涌現，熒光染料標記DNA的基因晶元技術使其中最引人注目的。在熒光染料標記DNA測序技術中所用的熒光染料要求是：吸收光譜應在可見光區發射，光譜盡量靠近紅光區，以避免DNA自身的藍色熒光干擾；能發射足夠強度的熒光；不影響DNA片段在電場中的泳動；染料本身無毒害。
目前用於DNA序列的熒光染料主要是咕噸類化合物、菁類化合物、1,8-萘醯亞胺類染料以及二吡咯烷硼二氟類染料，熒光多為黃、綠、紅色，熒光量子產率較高。
6、熒光技術在醫療診斷中的應用之光動力治療用色素： 將特定的光敏感材料注入體內，它富集在腫瘤組織內，在正常細胞組織被代謝排除體外。用適當的光激發，可以檢測出癌症病處，再用特定波長的激光激發，產生能破壞腫瘤組織的自由基物質或引發氧分子轉變為能殺滅癌細胞的單線態氧，達到治療的目的。
光動力療法是除手術、化療和放射療法之外的第四種治療腫瘤的方法。它副作用小，不會引起外貌損傷。由於光動力療法具有高度的選擇性，破壞腫瘤組織目前臨床使用的光敏化材料多為卟啉類化合物。由於光動力療法的優異性能，目前已成為世界各國的研究熱點。

E. 紫外分光光度法和熒光分析法的區別和各自的優缺點

1、原理不同：

（1）紫外分光光度計，就是根據物質的吸收光譜研究物質的成分、結構和物質間相互作用的有效手段。

（2）熒光分光光度法是根據物質的熒光譜線位置及其強度進行物質鑒定和含量測定。可根據不同的物質其組成與結構調整所吸收的紫外-可見光波長和發射光的波長。

2、應用范圍不同：

（1）紫外分光光度計主要用於實驗室。例如：鑒定物質：根據吸收光譜圖上的一些特徵吸收，特別是最大吸收波長λmax和摩爾吸收系數ε是檢定物質的常用物理參數。這在葯物分析上就有著很廣泛的應用。與標准物及標准圖譜對照等。

（2）熒光分光光度法的靈敏度通常比分光光度法高2〜3個數量級。在衛生檢驗、環境及食品分析、葯物分析、生化和臨床檢測等方面有著廣泛的應用。

3、所用燈不同：

（1）紫外光區通常用氫燈或氘燈。

（2）熒光分光光度法通常用鎢燈或鹵鎢燈。

4、優缺點：

（1）紫外分光光度計高自動化程度，維護方便、操作簡便、效率高。

（2）熒光分光光度法具有檢測靈敏度高、專屬性較強和使用簡便等特點，常用於微量甚至痕量毒物的定量分析。

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紫外-可見分光光度計的結構與功能：

由光源、單色器、吸收池、檢測器和信號顯示系統五大部分組成。

（1）光源：是提供符合要求的入射光的裝置，有熱輻射光源和氣體放電光源兩類。熱輻射光源用於可見光區，一般為鎢燈和鹵鎢燈，波長范圍是350~1000nm；氣體放電光源用於紫外光區，一般為氫燈和氘燈，連續波長范圍是180~360nm。

（2）單色器：功能是將光源產生的復合光分解為單色光和分出所需的單色光束，它是分光光度計的心臟部分。

（3）吸收池：又稱比色皿，供盛放試液進行吸光度測量之用，其底及兩側為毛玻璃，另兩面為光學透光面，為減少光的反射損失，吸收池的光學面必須完全垂直於光束方向。根據材質可分為玻璃池和石英池兩種，前者用於可見光光區測定，後者用於紫外光區。

（4）檢測器：是將光信號轉變為電信號的裝置，測量吸光度時，並非直接測量透過吸收池的光強度，而是將光強度轉換為電流信號進行測試，這種光電轉換器件稱為檢測器。

（5）信號顯示系統：是將檢測器輸出的信號放大，並顯示出來的裝置。

F. 什麼是熒游標記法

熒光物標記法，神經纖維的末梢可以吸收很多熒光化合物或熒光染料,經軸突逆向運輸到細胞體內,從而建立逆行熒游標記法。例如:Kuypers等(1977)用這種方法在熒光顯微鏡下根據所用熒光物標記物特有的波長顯示吸收熒光物的神經細胞。

目前用於神經元標定的熒光物質有十多種。可以根據實驗的要求進行單熒光物、雙標定和三標定。後者可以用來做神經元軸突側枝投射的追蹤。

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1. SYBR green I染料

反應體系中，加入過量SYBR

熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈後，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的擴增完全同步。

其優點是對模板沒有選擇性，使用方便，非常方便，但也易與非特異性雙鏈DNA結合，產生假陽性，可以通過溶解曲線的分析，優化反應條件。

2. Taqman 探針

目前在Real-time

Q-PCR中最廣泛使用的Tagman系統就是運用了這個原理。它能被DNA合成酶（例如Taq酶）的5'-3'活性所降解，探針的5'端有一熒光報告基團，3'端有一熒光淬滅基團。

當兩個基團相互先靠近的時候，由於發生能量傳遞作用，報告基團不能發出熒光，但隨著擴增反應的進行，5'端得報告基團隨著探針的水解而脫落下來，不再與淬滅發生能量傳遞作用，從而能發出熒光，被信號探測器所捕獲。

3. Scorpions

它由兩個寡核苷酸分子組成，一個是引物，另一個是帶熒光分子的探針，但是此探針也具有引物的功能。引物與形成發夾結構的探針相連，在探針上由於熒光報告基團與淬滅基團相互靠近，不發熒光。

變性階段，探針的發夾結構會解開，在退火時則與模板相結合，形成線性分子，報告基團同淬滅基團分離而發射熒光。在探針的設計上，要求絕對保守，長度為25-32bp，Tm在68-70度之間，探針的5'端不能為G，避免多個鹼基同時出現，尤其要避免4個G同時出現，另外，探針應靠近上游引物。

4. 分子信標

分子信標是（Molecular

beacon）是一種呈發夾結構的莖環雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，因此標記在一端的熒光基團與標記在另一端的淬滅基團緊緊靠近。

熒光基團被激發後產生的光子被淬滅劑淬滅，由熒光基團產生的能量以紅外光而不是可見光形式釋放出來。在復性溫度下，因為模板不存在時形成莖環結構。

當加熱變性會互補配對的莖環雙鏈解開，如果有模板存在環序列將與模板配對。與模板配對後，分子信標將成鏈狀而非發夾裝，使得熒光基團與淬滅劑分開。當熒光基團被激發時，淬滅作用被解除，發出激光分子。

G. 熒光分析法為什麼比紫外-可見分光光度法有更高的靈敏度

熒光分析法的最大特點是靈敏度高，對某些物質的微量分析可以檢測到10⁻¹⁰克數量級，如污水中的銀含量用熒光分析法可以檢測到10⁻¹⁰克，汞可以檢測到10⁻¹⁰克。對一些激素亦可檢測到10⁻¹⁰克。

熒光分析的靈敏度比分光光度法的靈敏度高2~3個數量級，這是由於熒光分析的熒光和入射光之間成直角，而不在一條直線上，所以是在黑背景下檢測熒光。而分光光度法的接收器與入射光在一條直線上，所以它是在亮背景下檢測。因此熒光分析法比分光光譜法靈敏度高。

分光光譜法的靈敏度一般只能檢測到10⁻⁸克，兩者相差三個數量級。當然熒光分析法比起帶電子顯微鏡的電子探針法靈敏度又低一些，然而電子探針儀器價格昂貴，使用不方便。

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熒光分析法

由於有些物質本身不發射熒光（或熒光很弱），這就需要把不發射熒光的物質轉化成能發射熒光的物質。例如用某些試劑（如熒光染料），使其與不發射熒光的物質生成絡合物，各種絡合物能發射熒光，再進行測定。因此熒光試劑的使用，對一些原來不發熒光的無機物質和有機物質進行熒光分析打開了大門，擴展了分析的范圍。

紫外-可見分光光度法應用范圍包括：

1、定量分析，廣泛用於各種物料中微量、超微量和常量的無機和有機物質的測定。

2、定性和結構分析，紫外吸收光譜還可用於推斷空間阻礙效應、氫鍵的強度、互變異構、幾何異構現象等。

3、反應動力學研究，即研究反應物濃度隨時間而變化的函數關系，測定反應速度和反應級數，探討反應機理。

4、研究溶液平衡，如測定絡合物的組成，穩定常數、酸鹼離解常數等。

H. 熒游標記法是什麼

熒光物標記法，神經纖維的末梢可以吸收很多熒光化合物或熒光染料,經軸突逆向運輸到細胞體內,從而建立逆行熒游標記法。

例如：Kuypers等(1977)用這種方法在熒光顯微鏡下根據所用熒光物標記物特有的波長顯示吸收熒光物的神經細胞。

相關信息：

熒游標記所依賴的化合物稱為熒光物質。熒光物質是指具有共軛雙鍵體系化學結構的化合物，受到紫外光或藍紫光照射時，可激發成為激發態，當從激發態恢復基態時，發出熒光。

熒游標記技術指利用熒光物質共價結合或物理吸附在所要研究分子的某個基團上，利用它的熒光特性來提供被研究對象的信息。熒游標記的無放射物污染，操作簡便等優點，使得熒游標記物在許多研究領域的應用日趨廣泛。