酶聯免疫檢驗分析方法

❶ 免疫分析方法有哪些

（1）放射免疫分析法（radioimmunoassay，RIA）。RIA技術是使用以放射性同位素（如125I、32P、3H等）作標記的抗原或抗體，用γ－射線探測儀或液體閃爍計數器測定γ－射線或β－射線的放射性強度，來測定抗體或抗原量的技術。它包括以標記抗原為特點的放射免疫分析和以標記抗體為特點的免疫放射分析（immunoradiometricassay，IRMA）。前者以液相競爭結合法居多，既測大分子抗原又測小分子抗原；後者以固相法測大分子抗原為主。

RIA在早期建立的農葯免疫分析方法中佔了很大比重，建立了狄氏劑、艾氏劑、2，4－D和2，4，5－T、對硫磷和百草枯等農葯的放射免疫分析法。盡管該方法靈敏度非常敏銳（RIA通常為10-9g、10-12g，甚至10-15g），應用范圍廣，但進行RIA需使用昂貴的計數器，也存在放射線輻射和污染等問題，因此在農葯殘留檢測領域的應用和發展受到了一定的限制，並逐步為其他免疫分析方法所取代。

（2）酶免疫分析法（enzymeimmunoassay，EIA）。EIA是繼RIA之後發展起來的一項免疫分析技術。其檢測原理與放射免疫法類似，但所用的標記物為酶，它將抗原、抗體的特異性免疫反應和酶的高效催化作用有機結合起來，通過測定結合於固相的酶的活力來測定被測定物的量。用做標記物的酶有辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）和鹼性磷酸酶（alkalinephosphatase，AKP）、葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase，GO）、脲酶（urease）等。酶標記反應的固相支持物有聚苯乙烯塑料管、膜等。目前大多數採用96孔酶標板（MTP）作為固相支持物。這種板的檢測容量大，樣本數量多，只需有台簡單的酶標儀就可得出准確的檢測數據。也有學者採用磁珠作為固相材料進行EIA研究，其原理是將高分子材料（聚苯乙烯、聚氯乙烯等）包裹到金屬小顆粒（Fe2O3，Fe3O4）外面，再通過化學方法鍵合上氨基（－NH2）、羧基（－COOH）、羥基（－OH）等活性基團，再與抗體或抗原耦聯，製成免疫性微珠。該方法的優點是微珠比表面積大，吸附能力強，能懸浮在液相中快速均勻的捕獲樣品中的待測物，通過外加磁場後能夠實現微珠與樣品液的快速分離，從而減少檢測時間、提高檢測靈敏度。

由於酶標試劑制備容易、穩定、價廉，酶免疫分析的靈敏度接近放射免疫技術，故近年來EIA技術發展很快，已開發了多種EIA方法。其中酶聯免疫法（，ELISA）是目前農葯殘留檢測中應用最廣泛的酶免疫分析技術。

（3）熒光免疫分析法（fluorescenceimmunoassay，FIA）。FIA檢測的基本原理是將抗原抗體的高度特異性與熒光的敏感可測性有機地結合，以熒光物質作為示蹤劑標記抗體、抗原或半抗原分子，制備高質量的特異性熒光試劑。當抗原抗體結合物中的熒光物質受到紫外光或藍光照射時，能夠吸收光能進入激發態。當其從激發態回復基態時，能以電磁輻射形式放射出所吸收的光能，產生熒光。繪制農葯濃度－熒光強度曲線，可以定性、定量檢測樣品中的農葯殘留量。

適用於抗體、抗原或半抗原分子標記的熒光素須符合要求：①應具有能與蛋白質分子形成穩定共價鍵的化學基團，或易轉變成這類反應形式而不破壞其熒光結構；②標記後，熒光素與抗體或抗原各自的化學結構和性質均不發生改變；③熒光效率高，與蛋白質結合的需要量很少；④熒光素與蛋白質結合的過程簡單、快速，游離的熒光素及其降解產物容易除去；⑤結合物在一般儲存條件下性能穩定，可保存使用較長時間。

（4）化學發光免疫分析法（luminescentimmunoassay，LCIA）。LCIA又可分為化學發光免疫測定（chemiluminescentimmunoassay，CLCIA）和生物發光免疫測定（bio-luminescentImmunoassay，BLCIA）。

1976年，Shroeder首先用生物素（B）－親和素（A）系統建立了均相化學發光免疫測定技術，爾後Halman和Velan又將其引伸到非均相體系，現已滲入到生物學研究的各個領域。其原理是以發光指示抗原與抗體的結合，當發游標記物與相應的抗體或抗原結合後，底物與酶作用，或與發光劑產生氧化還原反應，或使熒光物質（例如紅熒烯等）激發，釋放光能。最後用光度計測定其發光強度，進行定量分析。常用發游標記物有辣根過氧化物酶（HRP）、魯米諾（luminol）、異魯米諾（isoluminol）、咯粉鹼（lophine）、光澤精（lucigen）、雙（2、4、6－三氯苯）草酸酯、聯苯三酚和6[N-（4－二氨基丁基）－N－乙基]－氨基-2，3－二氫吩嗪-1，4－二酮（ABEI）等。用上述發游標記物標記的抗體（或抗原）在一定的pH緩沖溶液中與相應的抗原（或抗體）結合時，在協同因子（例如H2O2等）的作用下發光，其發光強度與被測物的濃度成正比，故可以用於定量分析。

發光免疫測定具有特異性強、靈敏度高（檢測限量達10-15mol/L）、快速（1～3h）、發光材料易得等優點。但其發光過程和強度常受到發光物質本身的化學結構、介質的pH、協同發光物質和金屬離子雜質等影響。

（5）金免疫層析分析法（goldimmuno-chromatographyassay，GICA）。GICA檢測原理是將配體（抗體或抗原）以線狀包被固化於硝酸纖維素膜等微孔薄膜上，膠體金標記另以配體或其他物質並以干態固定在吸水材料上，通過毛細作用，使樣品溶液在層析條上泳動，當泳動至膠體金標記物處時，如樣品中含有待檢受體，則發生第一步高度特異性的免疫反應，形成的免疫復合物繼續泳動至線狀包被區時，發生第二步高度特異性的免疫反應，形成的免疫復合物被截留在包被的線狀區，通過標記的膠體金而顯紅色條帶（檢測帶），而游離的標記物則越過檢測帶，與結合的標記物自動分離。通過檢測帶上顏色的有無或色澤深淺來實現定性或定量測定2。

2金標試紙條檢測

GICA法具有快速（5～20min）、廉價、結果明確、無需復雜操作技巧和特殊設備、攜帶方便等優點。但相對於其他免疫分析方法，該方法檢測靈敏度稍低，主要適合現場快速定性或半定量測定。目前該方法已被應用於醫學和生物學等眾多研究領域，尤其在發達國家已經得到了廣泛的應用。

（6）免疫分析與儀器分析技術的聯用技術。使用單一的IA技術進行農葯殘留分析獲得的信息量少，而理化分析方法的選擇性又比較差。Kramer等人將免疫分析法和液相色譜法（LC）聯合起來使用，從而簡化了分析方法，提高了檢測效率。LC-IA的聯用，將LC的高分離能力和IA的高靈敏性和高特異性融為一體。該分析法尤其適合多組分殘留分析和微量分析。免疫分析與氣相色譜/質譜（GC/MS）的聯用可減少結構相似的農葯或代謝產物分析中的交叉反應，以降低假陽性。

❷ 什麼是酶聯免疫

酶聯免疫法，簡稱ELISA。它的中心就是讓抗體與酶復合物結合，然後通過顯色來檢測。步驟其實很簡單：ELISA用血清來檢測，首先血液要經過至少半個小時的凝集，然後取血清（這是有些網友不理解為什麼醫院抽完了血對血置之不理的原因，其實是誤會）。將酶復合物用稀釋液稀釋後，加血清及陰性、陽性對照，還有就是質控品（這是嚴格的要求，它的范圍必須在質控范圍內）。經過一個小時的孵育，然後洗板，加底物，半個小時避光反應後加終止液即完成反應部分，然後就是讀數。由數值來判斷結果的陰性或陽性。嚴格的講，如果第一次檢測為陽性的話，無論是哪個實驗室，必須按照CDC的HIV操作規程來進行第二次檢測，第二次的方法必須與第一次的不同，如還是陽性，將送確認實驗室確認。有的醫院很不負責，將初篩陽性的報告發出後就不管了，這是不對的。必須經過確認實驗室確認後才可出陽性診斷。祝大家。PS，第一次檢測為陽性的話，一定要去確認實驗室再做一次，勇敢的去面對，也許結果就不一樣了。

❸ 化學發光法和酶聯免疫法的區別，哪個更准確

1、原理上的區別

化學發光法依據化學檢測體系中待測物濃度與體系的化學發光強度在一定條件下呈線性定量關系的原理，利用儀器對體系化學發光強度的檢測，而確定待測物含量。

酶聯免疫法原理是在測定時把受檢標本和酶標抗原或抗體與固相載體表面的抗原或抗體起反應加入酶反應的底物後，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺來進行定性或定量分析。

2、分類上的區別

化學發光法依據供能反應的特點，可將化學發光分析法分為普通化學發光分析法，供能反應為一般化學反應；生物化學發光分析法，供能反應為生物化學反應；電致化學發光分析法，供能反應為電化學反應。根據測定方法又可分為直接測定CL分析法、偶合反應CL分析法等。

酶聯免疫法根據測定方法可分為雙抗體夾心法；雙位點一步法；間接法測抗體法，利用酶標記的抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體；競爭法，以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合，因此結合於固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。

3、作用上的區別

化學發光法在痕量金屬離子、各類無機化合物、有機化合物分析及生物領域都有廣泛的應用。

酶聯免疫法可用於測定抗原，也可用於測定抗體，ELISA現在已成為目前分析化學領域中的前沿課題 。

❹ 酶聯免疫檢測的幾種方法及其原理

（1）酶聯免疫吸附試驗（enzyme
linked
immunosorbent
assay,ELISA）：是將抗原或抗體吸附在固相載體表面。使抗原抗體反應在固相載體表面進行。可用間接法、雙抗體夾心法或競爭法測定抗原或抗體。
（2）夾心法（sandwich
assay）:將已知的特異抗體包裝在固相載體（塑料板凹孔或紙片上），加入待檢標本，標本中的抗原即可與載體上的抗原結合，洗去未結合的材料後加入該抗原的酶標記抗體，洗去未結合的酶標抗體，加底物顯色，用酶免疫檢測儀測量顏色的光密度，可定量測定抗原。
間接法（indirecr
ELISA）常用於檢查特異抗體。先將已知特異抗原包被固相載體，加入待檢標本（可能含有相應抗體），再加入酶標抗Ig的抗全（即第二抗體），經加底物顯色後，根據顏色的光密度計算出標本中抗體的含量。
（3）BAS-ELISA：近年來對酶免設分析法的改進是使用生物素-親合素-過氧化物酶復合物作為指示劑，組成一新的生物放大系統進一步提高檢測的敏感度。可用來檢測多種抗原抗體系統如細菌、病毒、腫瘤細胞表面抗原等。一個親合素（avidin）分子可以結合4個生物素分子（biotin）。結合非常穩定。親合素和生物素都可與抗全、酶、熒光素等分子結合，而不影響後者的生物活性。一個抗體分子可偶聯90個生物素分子，通過生物素又可連接多個親合素。因此大提高檢測的敏感度。目前應用生物-酶標親合素系統（biotinavidin
system-
ELISA,BAS-ELISA），它是通過生物素標記抗體連接免疫反應系統，同時藉助生物素化酶或酶標親合素引入酶與底物反應系統。

❺ 酶聯免疫斑點法檢測分析是什麼

酶聯免疫法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是目前較為常用的除色譜/質譜法以外的農葯殘留檢測方法之一。一、基本原理1971年Engvall和Perlmann發表了酶聯免疫吸附劑測定（，ELISA）用於IgG定量測定的文章，使得1966年開始用於抗原定位的酶標抗體技術發展成液體標本中微量物質的測定方法。這一方法的基本原理是：①使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，並保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最後結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物後，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺刊物定性或定量分析。由於酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。 ………………
詳細資料請參考：on
http://proct.bio1000.com/101875/

❻ 什麼叫酶聯免疫分析法

酶聯免疫吸附劑測定法，簡稱酶聯免疫法，或者ELISA法。
它的中心就是讓抗體與酶復合物結合，然後通過顯色來檢測。
步驟
ELISA用血清來檢測，首先血液要經過至少半個小時的凝集，然後取血清。將酶復合物用稀釋液稀釋後，加血清及陰性、陽性對照，還有就是質控品（這是嚴格的要求，它的范圍必須在質控范圍內）。經過一個小時的孵育，然後洗板，加底物，半個小時避光反應後加終止液即完成反應部分，然後就是讀數。由數值來判斷結果的陰性或陽性。
基本原理
①使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，並保持其免疫活性。
②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最後結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物後，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺刊物定性或定量分析。由於酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。
ELISA可用於測定抗原，也可用於測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：
①固相的抗原或抗體
②酶標記的抗原或抗體
③酶作用的底物。根據試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。

http://ke..com/view/1462993.htm

❼ 酶聯免疫法的檢測方法

雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：
一、將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質。
二、加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。
三、加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。
四、加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。
根據同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。
在臨床檢驗中，此法適用於檢驗各種蛋白質等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用於包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用於包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作一步法檢測。
在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物。類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象，此時反應後顯色的吸光值（位於抗原過剩帶上）與標准曲線（位於抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，所得結果將低於實際的含量，這種現象被稱為鉤狀效應（hook effect），因為標准曲線到達高峰後呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應注意可測范圍的最高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。
假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型，顯然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。
雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份，同時與固相抗體和酶標抗體結合，表現出假陽性反應。採用F（ab'）或Fab片段作酶結合物的試劑，由於去除了Fc段，從而可消除RF的干擾。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項考核指標（參見6.2）。
雙抗體夾心法適用於測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用於測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。
雙抗原夾心法測抗體
反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用於測定，因此其敏感度相對高於間接法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常採用本法。本法關鍵在於酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。 在雙抗體夾心法測定抗原時，如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步並作一步。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應時間，如應用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法測定中，應注意鉤狀效應（hookeffect），類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物，所得結果將低於實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現假陰性結果。 間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：
⑴將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結合的抗原及雜質。
⑵加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後，固相載體上只留下特異性抗體。其他抗體及血清中的雜質由於不能與固相抗原結合，在洗滌過程中被洗去。
⑶加酶標抗抗體：與固相復合物中的抗體結合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌後，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體，可用酶標羊抗人IgG抗體。
⑷加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。
本法主要用於對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。
間接法成功的關鍵在於抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，但應盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應注意除去能與一般健康人血清發生反應的雜質，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗體發生反應。抗原中也不能含有與酶標抗人Ig反應的物質，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗中也發生假陽性反應。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因競爭吸附而影響包被效果。
間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性抗體。病人血清中受檢的特異性IgG只佔總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被後一般用無關蛋白質（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空餘間隙。另外，在檢測過程中標本須先行稀釋（1:40~1:200），以避免過高的陰性本底影響結果的判斷。 競爭法可用於測定抗原，也可用於測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合，因此結合於固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：
⑴將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。
⑵待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合，競爭性地佔去了酶標抗原與固相載體結合的機會，使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原，保溫後，酶標抗原與固相抗體的結合可達最充分的量。洗滌。
⑶加底物顯色：參考管中由於結合的酶標抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。一般情況，是通過方波伏安法，檢測培養體系的峰電流，通過峰電流與抗原抗體的線性關系來最終確定體系的最終檢測目標的濃度。
當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。標本中抗體量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺於陰性反應。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質，直接包被不易成功，可採用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應的抗體，然後加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質，然後再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應。競爭法測抗體有多種模式，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結合，抗HBc ELISA一般採用此法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合，洗滌後再加入酶標抗體，與結合在固相上的抗原反應。抗HBe的檢測一般採用此法。 血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，後者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗體多用捕獲法，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG後再測定特異性IgM。操作步驟如下：
⑴將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。
⑵加入稀釋的血清標本：保溫反應後血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。
⑶加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結合。洗滌。
⑷加入針對特異性的酶標抗體：使之與結合在固相上的抗原反應結合。洗滌。
⑸加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在，是為陽性反應。 親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個分子由4個亞基組成，可以和4個生物素分子親密結合。維生素H，分子量244.31，存在於蛋黃中。用化學方法製成的衍生物，生物素－羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產物。親和素與生物素的結合，雖不屬免疫反應，但特異性強，親和力大，兩者一經結合就極為穩定。由於1個親和素分子有4個生物素分子的結合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復合體。因此把親和素和生物素與ELISA偶聯起來，就可大提高ELISA的敏感度。
親和素－生物素系統在ELISA中的應用有多種形式，可用於間接包被，亦可用於終反應放大。可以在固相上先預包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結合，通過親和素－生物素反應而使生物素化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結合點充分暴露。另外，在常規ELISA中的酶標抗體也可用生物素化的抗體替代，然後連接親和素－酶結合物，以放大反應信號。 在臨床檢驗中一般採用商品試劑盒進行測定。ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結合物和酶的底物等。完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：
⑴已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；⑵酶標記的抗原或抗體（結合物）；
⑶酶的底物；
⑷陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），參考標准品和控制血清（定量測定中）；
⑸酶聯物（結合物）及標本的稀釋液；
⑹洗滌液；
⑺酶反應終止液。

❽ 酶聯免疫吸附測定的方法類型和操作步驟

ELISA可用於測定抗原，也可用於測定抗體。該法適於測定細胞培養上清、血清、血漿及組織液中的樣本，干擾小可以測到每毫升納克水平的細胞因子（或受體）的水平。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體，②酶標記的抗原或抗體，③酶作用的底物。根據試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。 雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：
（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質。
（2）用脫脂奶粉或BSA進行封閉。洗滌除去多餘的脫脂奶粉或BSA。
（3）加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。
（4）加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。
（5）加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。
根據同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。 在雙抗體夾心法測定抗原時，如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步並作一步（圖15-5）。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應時間，如應用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法測定中，應注意鉤狀效應（hookeffect），類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物，所得結果將低於實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現假陰性結果。 間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：
（1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結合的抗原及雜質。
（2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質由於不能與固相抗原結合，在洗滌過程中被洗去。
（3）加酶標抗抗體：與固相復合物中的抗體結合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌後，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體，可用酶標羊抗人IgG抗體。
（4）加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。
本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體。 競爭法可用於測定抗原，也可用於測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合，因此結合於固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：
（1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。
（2）待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合，競爭性地佔去了酶標抗原與固相載體結合的機會，使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原，保溫後，酶標抗原與固相抗體的結合可達最充分的量。洗滌。 （3）加底物顯色：參考管中由於結合的酶標抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。 血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，後者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗本多用捕獲法，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG後再測定特異性IgM。操作步驟如下：
（1）將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。
（2）加入稀釋的血清標本：保溫反應後血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。
（3）加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結合。洗滌。
（4）加入針對特異性的酶標抗體：使之與結合在固相上的抗原反應結合。洗滌。
（5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在，是為陽性反應。 親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個分子由4個亞基組成，可以和4個生物素分子親密結合。現在使用更多的是從鏈黴菌中提取的鏈霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又稱維生素H，分子量244.31，存在於蛋黃中。用化學方法製成的衍生物，生物素－羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產物。親和素與生物素的結合，雖不屬免疫反應，但特異性強，親和力大，兩者一經結合就極為穩定。由於1個親和素分子有4個生物素分子的結合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復合體。因此把親和素和生物素與ELISA偶聯起來，就可大提高ELISA的敏感度。
親和素－生物素系統在ELISA中的應用有多種形式，可用於間接包被，亦可用於終反應放大。可以在固相上先預包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結合，通過親和素－生物素反應而使生物素化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結合點充分暴露。另外，在常規ELISA中的酶標抗體也可用生物素化的抗體替代，然後連接親和素－酶結合物，以放大反應信號。
ELISA 普遍用作非放射性同位素的成鍵化驗. 在這種方法中, 通常標准配體是固定的, 通過加入溶液相受體或蛋白質來使之成鍵. 通過加入與受體特異性反應的抗體來定量成鍵的受體, 而且最初抗體的量以加入第二種能顯色的抗體測量. 第二種抗體能識別抗體的末端, 在其末端的鹼性磷酸酯或過氧化物酶等與酶發生反應, 從而使溶液顯色.