Ⅰ 簡述酶法分析生物葯物和基因工程葯物的原理，主要有哪些方法
酶分析法在生物葯物分析中的應用主要有兩個方面：第一，以酶為分析對象，根據需要對生物葯物生產過程中所使用的酶和生物葯物樣品所含的酶進行酶的含量或酶活力的測定，稱為酶分析法；第二，利用酶的特點，以酶作為分析工具或分析試劑，用於測定生物葯物樣品中用一般化學方法難於儉測的物質，如底物、輔酶、抑制劑和激動劑(活化劑)或輔助因子含量的方法稱為酶法分析。
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特定及優勢
而如果有僅作用於被測物質的酶，利用酶的特異性，不需要分離就能辨別試樣中的被測組分，從而對被測物質進行定性和定量分析。所以，酶法分析常用於復雜組分中結構和物理化學性質比較相近的同類物質的分離簽定和分析，而且樣品一般不需要進行很復雜的預處理。酶法分析具有特異性強，干擾少，操作簡便，樣品和試劑用量少，測定快速精確，靈敏度高等特點。通過了解酶對底物的特異性。可以預料可能發生的干擾反應並設法糾正。在以酶作分析試劑測定非酶物質時，也可用偶聯反應；而且偶聯反應的特異性，可以增加反應全過程的持異性。此外，由於酶反應一般在溫和的條件下進行，不需使用強酸強鹼，它還是一種無污染或污染很少的分析方法。很多需紅使用氣相色譜儀、高壓液相色譜儀等貴重的大型精密分析儀器才能完成的分析檢驗工作，應用酶法分析方法即可簡便快速地進行。酶法分析目前主要廣泛應用於醫葯、臨床、食品和生化分析檢測中，如尿素、各種糖類、氨基酸類、有機酸類、維生素類、毒素等物質的定性和定量分析。
Ⅱ 典型生物葯物的一般製造流程是什麼
一般生物制葯的主要流程如下：1. 上游階段
1.1 目的基因的制備
目的工程的主要目的是使優良性狀相關的基因聚集在同一生物體中,創造出具有高度應用價值的新物種. 為此必須從現有生物群體中,根據需要分離出用於克隆的次類基因,這樣的基因稱之為目的基因. 基因工程中獲得的目的基因主要用於: (1).研究該基因,分析其結構,功能和表達的調空機制 (2).和正常基因比較,找出基因的異常點,探索疾病發生的分子生物學基礎. (3).研究生物種系的進化 (4).建立基因療法,將正常基因引入病人體內,治療遺傳性疾病(5).大量表達某種基因,生產出需要的蛋白和多肽 (6).對某些基因進行改選,改良動植物品種.
不同基因組類型的基因組大小不同,基因組和基因排列也各不相同,因此,分離目的基因應採用不同的途徑和方法
1.1.1 構建cDNA基因文庫分離法
cDNA文庫是以真核細胞中分離純化出所有的mRNA,在以mRNA為模板合成cDNA與適當的載體重組轉入宿主細胞,這樣建立起來的cDNA重組分子集合體稱為cDNA文庫.而cDNA文庫中插入片段的總和可代表某一種生物全部的mRNA序列.
1.1.1.1 cDNA文庫的構建
構建cDNA文庫主要包括以下步驟: (1).細胞總RNA的制備及mRNA的分離 (2).以mRNA為模板,合成cDNA第一條鏈 (3).雙鏈cDNA的合成,而將mRNA—DNA雜交分子轉變為雙鏈cDNA分子 (4). CDNA與載體的連接和噬菌體顆粒的包裝及傳染或質粒的轉化等
1.1.1.2 cDNA克隆的優越性
自20世紀70年代初說創cDNA克隆問世以來,以採用構建和篩選cDNA文庫的方法克隆了許多目的基因的cDN**段.在基因工程操作中,也長以cDNA為探針從基因文庫中分離相應的基因克隆.因此, cDNA克隆常常以基因分離和結構分析的著手點,在分子生物學研究和基因工程應用等方面具有十分重要的意義.
1.1.2 構建基因組文庫分離法
1.1.2.1 基因組文庫的概念
將某種生物的基因組DNA切割成一定大小的片段,分別與適合的載體重組後導入宿主細胞,這些重組分子中插入片段的總和可代表該生物全部基因組序列.這種通過重組,克隆方法保存在宿主細胞中的各種DNA重組分子的集合體稱為基因組文庫.
1.1.2.2 基因組文庫的大小
克隆片段的平均大小/bp 基因組的大小/bp
2×10^6(細菌) 2×10^7（真菌） 3×10^9（動物）
LN SJ LN SJ LN SJ
5×10^3 400 1831 4000 18418 600000 2736110
10×10^3 200 919 2000 9208 300000 1381550
20×10^3 100 458 1000 4603 150000 690774
40×10^3 50 278 500 2300 75000 345386
一個理想的基因組文庫因該是在克隆群體中包含完整基因組的所有DNA序列.這就要求在打斷基因組DNA時盡可能做到隨機切割,實際上,無論採用什麼方法的不能達到理論上的切割.應此構建的基因組文庫應包含的克隆子數理論值和經驗值之間相差比較大.幾類基因組文庫的大小見下表: 「2」
1.1.2.3 構建基因組文庫的類型
通過克隆，重組方法構建的基因組文庫主要有：
(1)構建λ噬菌體基因組文庫；（2）構建考斯質粒基因組文庫
(3) 構建YAC基因組文庫
1.1.3 直接分離法
1.1.3.1 限制性核酸內切酶酶切分離法
限制性核酸內切酶酶切分離法適於簡單基因組中分離目的基因。質粒和病毒等DNA分子小的只有幾千鹼基，大的也不超過幾萬鹼基，編碼的基因較少，獲得的目的基因方法比較簡單。
1.1.3.2 基因分離的物理化學法
這是基因工程在發展初期所用的方法，某些生物的rDNA基因最早都是利用該法分離獲得的，但目前很少採用。次方法主要有：密度梯度離心法、單鏈酶解法和分子雜交法等。1.1.3.3 雙抗體免疫法分離編碼蛋白的基因
雙抗體免疫法分離編碼蛋白的基因適於某一真核細胞的蛋白質已被分離純化，且足以產生抗體。
1.1.3.4 利用酶促反轉錄發直接從特定mRNA分離基因
酶促反轉錄主要用於合成分子質量較大，轉錄產物mRNA易分離目的基因。
目的基因的mRNA為模板 逆轉錄酶 cDNA DNA聚合酶雙鏈 雙鏈cDN**段
與合適載體重組並轉入受體菌 cDNA克隆
1.2 目的基因的分離
通過適當的方法構建上一個完整的基因組DNA文庫或CDNA文庫，意味著包含目的基因在內的所有基因都得以克隆，但並不等於完成了目的基因的分離。因為在基因文庫中，不論是CDNA文庫還是基因組文庫，含目的基因的克隆子都只是數以萬計的克隆子中的一個，其中究竟哪個克隆子含有我們所需要的目的基因序列還不清楚。因此，還需要下一個步驟要進行的就是目的基因的分離，主要方法有：
（1）目的基因的功能克隆 （2）序列克隆法
（3）利用差示分析法分離目的基因克隆 （4）功能結合法篩選目的基因
（5）DNA插入誘變法分離目的基因（6）應用基因定位克隆技術分離篩選目的基因
（7）基因的定位侯選克隆法（8）染色體顯微切割與微克隆法
（9）根據生物大分子內的相互作用分離目的的CDNA克隆
（10）篩選目的基因片段的差別雜交及減法雜交技術
1.3 基因克隆載體
載體是攜帶目的基因的DN**段進入受體細胞進行擴增和表達的工具。常用的載體是經過改造的細菌質粒，噬菌體，黏粒和病毒
1.3.1 質粒克隆載體
質粒是細菌染色體外的雙鏈環狀的能自我復制的小分子DNA，其對細胞本身的生長繁殖不是必需的，但可以賦予細菌一定的類型，如耐熱型等。
與構建克隆載體相關的質粒性質有：
（1） 粒的復（2） 制型（2）質粒的不（3） 相容性
（3）質粒的接合性
（4）質粒作為基因工程載體需要具備的條件：作為基因工程載體的質粒都是經過人工改造過的質粒，具備以下特點：
a, 相對分子質量小3—10kb b, 是鬆弛型復制質粒
c, 是非接合型質粒 c, 質粒上有多個限制酶的單一切點
d, 帶有雙選擇標記
1.3.2 病毒（噬菌體）克隆載體
病毒主要由DNA（或RNA）和外殼蛋白組成，經包裝後成為病毒顆粒。通過感染，病毒顆粒進入宿主細胞，利用宿主細胞的合成系統進行DNA(或RNA)復制的殼蛋白質的合成，實現病毒顆粒的增殖。人們利用這些性質構建了一小列分別適用於不同生物的病毒克隆載體。通過此種方法構建成的基因克隆載體主要有：
（1） 噬菌體克隆載體cosmid克隆技術（黏粒）（2）Μ13噬菌體克隆載體
（2） aMV克隆載體（4）煙草花葉病毒（ TMV）載體克隆
（5）SVCO克隆載體（6）反轉錄病毒克隆載體
（7）腺病毒克隆載體（8）痘苗病毒克隆載體
（9）桿狀病毒表達克隆載體
1.3.3 其他類型的克隆載體
（1）染色體定位整合克隆載體（2）人工染色體克隆載體
（3） 特殊用途克隆載體：如啟動子探針型，（4） 誘導型，（5） 反義表達組織特異表達，（6） 分泌型表達，（7） 雙啟動子，（8） 串族啟動子和含增強子表達克隆載體等等
1.4 目的基因和載體的連接（重組）
目的基因和載體連接前要先用同一種限制酶將目的基因和載體切割成黏性端或平端，也可以用物理方法切割後再用酶補成平端
體外連接是基因工程的重要環節，體外連接要減少載體的自身環化，提高重但子陽性率。主要的連接方法有：黏性末端連接、平端連接、定向插入和同源多聚尾。
1.5 重組體導入受體細胞
外源目的基因與載體在體外連接重組後形成重組的DNA分子。該重組DNA分子必須導入適宜的受體細胞在中才能使外源目的基因得以大量擴增或表達。隨著基因工程的發展，從低等的原核細胞，到簡單的真核細胞，進一步達到結構復雜的高等動，植物細胞都可以作為基因工程的受體細胞。選擇適宜的受體細胞已經成為重組基因高效克隆或表達的基本前提之一
1.5.1 受體細胞的選擇要求
目的基因獲得後,必須在合適的宿主細胞中才能進行表達,才能獲得目的產物.應此,宿主細胞必須滿足:容易獲得較高濃度的細胞;能利用易得廉價的材料;不致病、不產生內毒素;發熱量低,需氧低,適當的發酵溫度和細胞形態;容易進行代謝調控;容易進行DNA重組技術操作技術;產物的產量、產率高,產物容易提取純化.
1.5.2 受體細胞的類型
人們通過研究,根據需要獲得了一定的目的產物,而目的基因能否的到有效的表達,關鍵在與受體細胞的選擇.
1.5.2.1 原核生物細胞
由於原核生物作為基因工程受體具有其他生物所沒有的優點,而且人們對其遺傳背景清楚,所以早期開展的基因工程操作,都是以原核生物為受體細胞.目前研究比較多的有:大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈黴菌等.
1.5.2.2 真核生物細胞
由於真核生物的細胞結構、基因組成和基因表達較為復雜,適用於原核生物的轉基因方法大多數難以有效地用於真核生物.近年來經過探索,發現它可以對表達的蛋白質進行翻譯後加工過程,有利於保持天然結構和生物活性.並用這些方法有效的獲得了轉基因真核生物.研究較多的有:酵母菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞等等.
1.5.3 重組子的篩選
在重組DNA分子的轉化、轉染和轉導過程中,並非所有的的受體細胞 都能被導入重組DNA分子.一般僅有少數重組DNA分子能進入受體細胞,同時也只有極少數的受體細胞在吸納重組DNA分子之後能良好增殖.因此,如何將被轉化細胞從大量受體菌細胞中初步篩選出來,然後進一步檢測到含有期待重組DNA分子的克隆子將直接關繫到基因克隆和工程操作紅極為重要的環節.
重組子的篩選可以根據載體的類型、受體細胞種類以及外源DNA分子導入受體細胞的手段等採用不同的方法,一般包括以方面:
(1).遺傳直接篩選法; (2),核算分子雜交檢測法; (3)依賴於重組子結構特徵分析的篩選法;
(4)免疫化學檢測法; (5)轉譯篩選法; (6)亞克隆法; (7)插入失活法;
(8)電子顯微鏡作圖檢測法; (9)基因表達產物分析法; (10)DNA序列分析法.
1.6、外源基因的表達
基因工程技術的核心是基因表達技術。迄今為止，已構建了多種基因表達系統，包括原核生物和真核生物基因表達系統，不同的表達系統具有各自的特點。
1.6.1 基因表達的機制（過程）
1.6.1.1 外源基因的起始轉錄
外源基因在宿主細胞中的有效表達是基因工程的核心問題，而外源基因的起始轉錄又是基因表達的關鍵。
1.6.1.2 mRNA的延伸與穩定性
外源基因起始轉錄後，保持mRNA的有效延伸、終止及穩定存在是外源基因有效表達的關鍵。
mRNA的穩定性直接導致決定翻譯產物的多少，對原核細胞來說，最佳的方法是選擇一個RNase缺失受體前。對真核細胞來說則需考慮增加mRNA的正確加工，提高成熟mRNA的穩定性。
1.6.1.3 外源基因mRNA的有效翻譯
翻譯是mRNA指導多肽鏈生成的過程，翻譯的起始是多種因子協同作用的過程，其中包括mRNA,16SrRNA,fMet-tRNA之間的鹼基配對，還有mRNA序列上的終止密碼對正確翻譯的效率有很大影響。
1.6.1.4 表達蛋白在細胞中的穩定性
外源基因的表達產物能否在宿主細胞中穩定積累而不被內源蛋白水解酶所水解是基因有效表達的一個重要因素，因此，為了避免此現象的發生可從以下幾個方面考慮：
（一）構建融合蛋白表達系統; （二）構建分子體蛋白表達系統;
（三）構建包涵體表達系統; （四）選擇蛋白水解酶基因缺陷型的受體系統.
1.6.1.5 目的基因沉默
基因沉默是導致外源基因不能正常表達的重要因素。它的作用機制主要有三種：位置效應的基因沉默、轉錄水平的基因沉默和轉錄後水平的基因沉默。基因沉默現象主要表現在轉基因動物和植物中。
目的基因沉默是在核酸水平上DNA與DNA,DNA與RNA,RNA與RNA相互作用的結果。由於重復序列或同源系列是基因沉默的普通原因之一，因而在構建表達載體時，應盡可能避免與內源序列具有較高的同源性。此外，可以通過選擇甲幾基化酶活性較弱的受體細胞或以化學物質處理受體細胞抑制甲基化作用。
1.6.2 基因表達的調控元件
通過研究發現主要的基因表達調控元件有：啟動子、增強子、終止子、衰減子、絕緣子和反義子
1.6.3 外源基因表達系統
外源基因表達系統泛指目的基因與表達載體重組後，導入合適的受體細胞，並能在其中有效的表達，產生目的基因產物（目的蛋白）。由此可知，外源基因表達系統由基因表達載體和相應的受體細胞兩部分組成。基因表達系統有原核生物表達系統和真核生物表達系統。目前，利用較多的是原核生物表達系統，因其遺傳背景清楚，繁殖快，表達率高等特點。近年來，真核生物基因表達系統發展很快，因其可以對表達的蛋白質進行翻譯後加工過程，有利於保持天然結構和生物活性等優點。目前主要應用的表達系統有：大腸桿菌基因表達系統、芽孢桿菌表達系統、鏈黴菌表達系統、藍藻表達系統、酵母表達系統、哺乳動物細胞基因表達系統、植物細胞基因表達系統；還有最新研究的兩個新的表達系統[3]：巴斯德畢赤酵母表達系統和動物乳腺生物反應器——全新的生產模式。
2、下游階段
基因工程只要的過程關鍵在於上游階段，因它可以獲得有效的工程菌，但下游純化階段也必不可少。因此為了獲得合格的目的產物，必須建立相應的醫葯生物技術產品的分離純化工藝。
2.1、基因工程菌發酵：
良好的發酵工藝對表達外源蛋白至關重要，直接影響下游純化工藝，形象到產品的質量和生產成本，決定產品在市場上的競爭力。目前，基因工程菌培養常用方法有：補料分批培養、連續培養、透析培養、固定培養。近年來，生物葯品已進入生物技術時代，對基因工程菌的培養設備要求十分嚴格，主要採用新型自動化發酵罐。
2.2、分離純化的基本過程：
分離純化是基因工程葯物生產中極其重要的
一環,這是由於工程菌經過大規模培養後，產生的
有效成分含量低，雜質含量高；另外由於基因工
程葯物是從轉化細胞，而不是從正常細胞生產的，
所以對產品的純度要求也高於傳統產品，主要的
步驟如右表：[4]
2.2.1、建立分離純化工藝根據
主要根據：（1）含目的產物的起始物料特點;
（2）物料中雜志的種類和性質;
（3）目的產物特性;
（4）產品質量的要求.
2.2.2、選擇分離純化方法的依據：
主要依據：
(1) 根據產物表達形式來選擇;
(2) 根據分離單元之間的銜接選擇;
(3) 根據分離純化工藝的要求來選擇.
2.2.3、常用的分離純化方法（見下表）[5]
方法 目的
離心/過濾 去除細胞、細胞碎片、顆粒性雜質(如病毒)
陰離子交換層析 去除雜質蛋白、脂質、DNA和病毒等
陽離子交換層析 去除牛血清蛋白或轉鐵蛋白等
超濾 去除沉澱物及病毒
疏水層析 去除殘余的雜蛋白
凝膠過濾 與多聚體分離
0.22μm微孔濾膜過濾 除菌
3、基因工程葯物：
自20世紀80年代初第一種基因工程產品——人胰島素投放市場以來，以基因工程葯物為主導的基因工程應用已成為全球發展最快的產業之一。隨著生物技術的快速發展，基因工程葯物將擁有越來越廣闊的發展前景。基因工程葯物主要包括細胞因子、抗體、疫苗、激素和寡核苷酸葯物等，它對預防和治療人類的腫瘤、心血管疾病、遺傳病、各種傳染病、糖尿病、類風濕疾病等有重要作用。
3.1、基因工程激素類葯物
激素是一類由生物體內分泌腺或特異性細胞產生的微量有機物，通過體液或細胞外液運送到特定的作用部位，能引起特殊的生理效應。基因工程的激素類主要指通過基因工程方法合成的蛋白多肽類激素。目前被批准上市的激素類葯物有胰島素、人生長激素、人促卵泡激素等。
3.2、基因工程細胞因子類葯物
細胞因子是由細胞分泌的能夠調節生物有機體生理功能，參與細胞的增殖，分化和凋亡的小分子多肽類物質。目前被批准上市的產品有十多種。主要有：干擾素（IFN）、集落刺激因子（CSF）、白細胞介素（IL）、腫瘤壞死因子（TNF），趨化因子和生長因子（GF）等。它們的生物學功能主要表現為：調節免疫應答、抗病毒、抗腫瘤、調節機體造血功能和促進炎症反應等。
3.3、基因工程疫苗：
直接利用微生物制備疫苗來治療疾病取得了巨大的成就，但由於各種傳染病在世界范圍內廣泛存在，並不斷有新的致病微生物被發現，它們對人類的健康造成巨大威脅。利用基因工程方法制備疫苗對控制傳染病的復發和治療新的傳染病有重要意義。目前研究的基因工程疫苗包括：痢疾菌苗、霍亂菌苗、結核菌苗、流感菌苗、狂犬病疫苗、瘧疾疫苗、口蹄疫疫苗。
3.4 特殊基因工程葯物—防禦素
防禦素是一類在生物界廣泛存在的、富含半胱氨酸,具有微生物和一些惡性細胞抗性的小分子短肽.它的抗性譜十分廣泛,目前以發現它不但對細菌、真菌和被膜病毒(如愛滋病病毒)有廣泛的毒殺效應,對某些惡性腫瘤細胞也有毒殺作用.最近,對一些長期存活的愛滋病感染者的研究發現,他們體內的愛滋病抑制因子就是一類防禦素.這一研究發現給人們戰勝愛滋病帶來希望.
4. 基因工程研究發展前景
基因工程問世以來短短的二十幾年,顯示出了巨大的活力,使傳統的生產方式和產業結構發生了變化.特別是在醫葯行業,利用人工的方法合成了許多有用的葯物及人體器官等,取得了很大的經濟效益.今後,基因工程將重點開展基因組學、基因工程葯物、動植物生物反應器和環保等方面的研究.通過這方面的研究、開發,對人類的生活、生存環境從根本上優化做出巨大的貢獻.因此,我們相信基因工程的前景將是更加燦爛輝煌.
Ⅲ 關於生物制葯的工藝流程論文
【摘要】 目的 建立脂肪中醋酸美侖孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸氯地孕酮殘留量的測定方法。方法 色譜柱：Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-水（65:35）；流速：1.0ml/min；柱溫：35℃；檢測波長：292nm；進樣量：40μl。結果 樣品的室內加標平均回收率為86.7％～91.8％，室內相對標准偏差為4.5％～6.0％，室間加標平均回收率為81.4％～95.0％，室間相對標准偏差3.7％～7.1％，定量測定低限（LOQ）為10μg/kg。結論 本方法簡便，准確，可用於脂肪中醋酸美侖孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸氯地孕酮殘留含量的測定。
【關鍵詞】 高效液相色譜法;脂肪;醋酸美侖孕酮;醋酸甲地孕酮;醋酸氯地孕酮
醋酸美侖孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮為合成的孕激素類葯物，有明顯的孕激素和抗雄激素作用，可抑制排卵。孕激素對垂體促性腺激素的釋放有一定的抑製作用，動物實驗表明有死胎率增加和致畸作用，副作用有：(1)惡心、頭暈、倦怠；(2)突破性出血；(3)孕期服用，會增加女性後代的男性化作用。孕激素類葯物能增強體內物質沉積和改善生產性能，可以很快產生顯著和直接的經濟效益，因此，對生產者有很大的吸引力。畜牧業中使用孕激素類葯物(非治療用途)已有很長的歷史，但人類長期食用含有激素的肉制食品，即使含量甚微，亦會明顯影響機體的激素平衡，而且有致癌危險，對幼兒造成發育異常等危害。因此，開發一種能檢測孕酮殘留量的方法是十分必要的。
檢測孕激素類葯物的方法有很多，如液相色譜/質譜法（LC/MS）〔1〕、氣相色譜/質譜法（GC/MS）〔2，3〕和液相色譜法〔4～6〕等。本文採用高效液相色譜法對牛和豬脂肪樣品中的孕酮進行檢測。
1 試劑與儀器
1.1 試劑 醋酸美侖孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮標准品（Sigama公司），乙腈（HPLC級），甲醇（HPLC級），乙酸乙酯（HPLC級），其他試劑為分析純。水由Milli-Q凈化系統（Millipore公司）製得。
（1）標准儲備液：1000μg/ml，分別准確稱取0.050g醋酸美侖孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮標准品於50ml容量瓶中，用甲醇定容。於4℃保存，可使用一年。
（2）混合中間溶液I：100μg/ml，分別吸取10.0ml醋酸美侖孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮標准儲備液於100ml容量瓶中，用甲醇定容。於4℃保存，可使用一年。
（3）混合中間溶液II：1.0μg/ml，取1.00ml混合中間溶液I於100ml容量瓶中，用甲醇定容。於4℃保存，可使用半年。
（4）混合標准工作液：分別吸取10、20、40、80、100μl混合中間溶液II添加到980、970、950、910、890μl的乙腈-水（65:35）中，再加入10μl 0.2%鹽酸溶液，混勻，得到濃度為0.010μg/ml、0.020μg/ml、0.040μg/ml、0.080μg/ml和0.10μg/ml混合標准工作液，供液相色譜測定，當日使用。
1.2 儀器 Waters液相色譜系統，510泵體，486紫外-可見光檢測器，Emprower pro色譜軟體。氮氣吹乾儀（Organomation Associates，Jnc.公司）；固相萃取裝置（Supelco公司）；低溫離心機（德國Eppendorf公司）；渦旋混勻器（XW-80A型，上海醫大儀器廠）；CN固相萃取柱（3ml，Waters公司）。
2 測定步驟
2.1 試樣的制備與保存
2.1.1 試樣的制備 把大約5g的豬或牛脂肪組織切成小塊，然後放入底部塞有玻璃棉的漏斗中，放入150ml的燒杯中，將燒杯置於微波爐內。根據所熬制脂肪量，使用最大功率，加熱30～60s，如果脂肪沒有融化，可在間隔30～60s以後重復加熱30～60s，直到有液體脂肪流出，通過漏斗滴入燒杯中。把熬制好的脂肪油放入樣品瓶中，密封，並做上標記。
2.1.2 樣品的保存 把熬制好的脂肪油樣品置於-18℃中，冷凍保存。
2.2 提取 稱取熬制好的脂肪油2.00±0.01g，置於50ml具塞離心管中，加入5ml乙腈，於60℃水浴中保溫3min以使固體脂肪溶化，渦旋振搖1min，在-5℃下離心7min（離心力1160g），吸取上清液至15ml帶塞聚丙烯離心管，再在沉澱物中加入5ml乙腈重復提取一次，合並上清液。在合並的乙腈提取液中加入2×2ml正己烷，渦旋振搖1min，於-5℃中離心5min（離心力1160g），棄去正己烷層。乙腈提取液於60℃中用氮氣吹乾儀吹乾，殘渣待皂化。
2.3 皂化 在殘渣（2.2項）中依次加入4ml正己烷、1ml 0.1mol/L 氫氧化鈉溶液和0.5ml1.0mol/L氯化鎂溶液，於渦旋混勻器上快速混勻10s，在60℃水浴中保溫15min，於-5℃中離心5min（離心力1160g），吸取上清液至15ml玻璃試管。在沉澱物中再加入4ml正己烷混勻後，在60℃水浴中加熱15min後，在-5℃中離心5min（離心力1160g），合並上清液。於60℃中用氮氣吹乾儀吹乾，用1.0ml正己烷溶解殘渣，待凈化。
2.4 凈化 將皂化後的樣液（2.3項）倒入經5ml乙酸乙酯和6ml正己烷預處理過的CN柱中，用2×1ml正己烷潤洗玻璃試管，洗液倒入到CN柱中。待樣液流過後，依次用5ml正己烷和6ml 5%乙酸乙酯的正己烷溶液淋洗柱子，隨後打開真空泵將小柱中液體抽干，保持抽氣2min。最後用3.5ml 20%乙酸乙酯的正己烷溶液洗脫，洗脫液收集於15ml玻璃試管中，於60℃中用氮氣吹乾儀吹乾。殘余物用990μl乙腈-水（65:35）渦旋溶解，靜止15min後，加入10μl 0.2%鹽酸溶液，混勻，供液相色譜測定。
2.5 測定
2.5.1 液相色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；預柱：C18柱（12.5mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-水（65:35）；流速：1.0ml/min；柱溫：35℃；檢測波長：292nm；進樣量：40μl。
2.5.2 液相色譜測定 根據樣液中3種孕酮的含量情況，選定濃度相近的標准工作液，標准工作液和樣液中3種孕酮的響應值均應在儀器檢測的線性范圍內。標准工作液和樣液等體積參插進樣測定。在上述色譜條件下，標准品的色譜圖見圖1。
圖1 醋酸美侖孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮的色譜圖（100ng/ml）1-醋酸甲地孕酮，2-醋酸氯地孕酮，3-醋酸美侖孕酮
液相色譜法測定豬和牛脂肪中孕酮殘留量 來自: 免費論文網
3 結果與討論
3.1 線性范圍 醋酸美侖孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮濃度在0.010～0.10μg/ml范圍內，峰面積與濃度呈良好的線性關系，其相關系數（γ2）均大於0.998。
3.2 回收率、精密度和定量檢測限 本實驗以2種脂肪（牛脂肪和豬脂肪）作為樣本。取適量標准品加入到2.0g樣品中，使添加量相當於10、20和50μg/kg，每個添加水平各取24份試樣（每種脂肪各12份）。圖2為空白脂肪樣品和添加樣品（10μg/kg）的色譜圖。表1為醋酸美侖孕酮，醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮外標法測得的室內回收率和精確度。表2為8家實驗室的室間回收率和精確度結果。根據回收率試驗，能可靠測得的最低濃度確定定量檢測限（LOQ），LOQ為10μg/kg，滿足殘留限量的檢測要求。
（A）
（B）
（C）
（D）
圖2 空白脂肪樣品和添加樣品（10g/kg）的色譜圖A：牛脂肪空白樣；B：豬脂肪空白樣；C:牛脂肪添加樣；D:豬脂肪添加樣
表1 室內回收率和精確度的結果 (每一添加量，n=24)
表2 8家實驗室室間回收率和精確度的結果 (每一添加量，n=32)
Ⅳ 如何對一種分析方法做驗證試驗
1. 緒論
本指南旨在為申請者提供建議，以幫助其提交分析方法，方法驗證資料和樣品用於支持原料葯和制劑的認定，劑量，質量，純度和效力方面的文件。
本指南旨在幫助申請者收集資料，遞交樣品並資料以支持分析方法。這些建議適用於NDA，ANDA，BLA，PLA及其它們的補充中所涉及的原料葯和制劑。
這些原則同樣適用於二類DMF所涉及的原料葯和制劑。如果使用了其它方法，鼓勵申請者事先和FDA葯品評審中心的官員進行討論，以免出現這種情況，那就是花了人力物力所准備起來的遞交資料後來發現是不可用的。
本指南中所述的分析方法驗證的原則適用於各種類型的分析方法。但是，本指南中特定的建議可能不適用於有些產品所用的特殊分析方法，如生物葯，生物技術葯，植物葯或放射性葯物等。
比如說，許多生物分析是建立在動物挑戰模式，免疫原性評估或其它有著獨特特性的免疫分析基礎上的，在遞交分析方法和分析方法驗證資料時需考慮這些獨特的性質。
而且，許多原料葯和制劑的界定和質量控制所需的生物和免疫化學檢測並不在本指南的范圍之內。
盡管本指南並不專門敘述原料，中間體，賦形劑，包裝材料及原料葯和制劑生產中所用的其它物料的分析方法及分析方法驗證資料的遞交，但是應該應用驗證過的分析方法來分析檢測這些物質。
對於本指南中未提及的關於分析方法驗證和資料提交方面的問題，請向FDA相關的化學評審人員咨詢。
本指南，一旦定稿，將取代FDA於1987年2月份發布的工業指南：分析方法驗證所需提交的樣品和分析資料。
II. 背景
每個NDA和ANDA都必需包括必要的分析方法以確保原料葯和制劑的認定，劑量，質量，純度和效力，還包括制劑的生物利用度(21 CFR 314.50(d)(1) 和314.94(a)(9)(i))。
FDA驗證文件現場備查，可以不與DMF一起交。
必須要有資料來論證所用的分析方法是符合一定的准確度和可靠性標準的。
分析方法驗證是論證某一分析方法適用於其用途的過程。分析方法的驗證過程是從申請者有計劃地系統性收集驗證資料以支持分析方法開始的。
審評化學家會對NDA或ANDA中的分析方法和驗證資料進行評審。
一旦FDA有要求，則NDA或ANDA的申請者必須提交制劑，原料葯，非葯典對照品和空白以使FDA實驗室能對申請者所用分析方法進行評審(21 CFR 314.50(e) and 314.94(a)(10))。
FDA實驗室的分析會論證該分析方法在實驗室內是可以重現的。審評化學家和實驗室分析家會從法規的角度確定該分析方法的適用性。
FDA檢查官會對分析實驗室進行檢查確保用於放行和穩定性實驗的分析方法符合現行的GMP（21CFR part 211)和GLP (21 CFR part 58)。
每個BLA和PLA都必須要有詳細的生產工藝描述，包括分析方法，以說明所生產的產品是符合規定睥安全，純充和效力標準的(21 CFR 601.2(a) and 601.2(c)(1)(iv))。
必須要有資料證明所用的分析方法是符合一定的准確度和可靠性要求的(21 CFR 81211.194(a)(2))。對於BLA，PLA及它們的補充，在所提交的許可證申請中應當要有分析方法和方法驗證這部分的資料，審評委員會會對這部分資料進行評審。
需提供代表性樣品及該樣品所代表批號的檢測結果總結(21 CFR 601.2(a) and 601.2(c)(1)(vi))。評審委員會主席會要求CBER實驗室的分析人員進行分析實驗對申請者的分析方法進行評估，並確認其分析結果。
從驗證的角度來看，所有的分析方法有著同樣的重要性。一般來說，應當要應用已驗證過的分析方法，而不論其是被用於過程式控制制，放行，合格或穩定性實驗。高等每個定量分析方法時都應當要減少其分析誤差。
分析方法和驗證資料應當擺在申請的分析方法和控制章節中提交。本指南的第III到IX章和XI章給出了所需提供資料方面的建議。向FDA實驗室提供樣品和遞交NDA和ANDA中的分析方法驗證資料的信息見第X章。
III分析方法的類型
A. 法定分析方法
法定分析方法是被用來評估原料葯或制劑的特定性質的。USP/NF中的分析方法是法定的用於葯典項目檢測的分析方法。為了確認符合法規，需使用法定分析方法。
B. 替代分析方法
替代分析方法是申請者提出用於代替法定分析方法的分析方法。只有當一替代分析方法相當於或優於法定分析方法時，才可以應用驗證過的替代分析方法。
I如果提交了替代分析方法，申請者還應當提供其理由，並標明其用途（如，放行，穩定性實驗），驗證資料及其與法定分析方法的對比資料。
C. 穩定性指示分析
穩定性指示分析是能檢測出原料葯或制劑的某些性質隨著時間的延長而出現的變化的定量分析方法。
穩定性指示分析能不受降解產物，工藝雜質，賦形劑或其它潛在雜質的影響而准確測定其中的活性成分。
如果申請者遞交了用於放行檢測的非穩定性指示分析方法，則應當要有能定性和定量地監測雜質，包括降解產物，的分析方法對其進行補充。穩定性試驗中所用的含量分析方法應當要有穩定性指示能力，除非有科學的理由能證明其合理性。
IV 標准品
A．標准品的類型
可以從USP/NF處或其它官方(比如說，CBER，21CFR 610.20)獲得標准品 (也就是一級對照品)。如果不能確定一標准品的來源是否會被FDA認為是官方來源，申請者應當要向適當的化學評審人員咨詢。如果沒有官方來源，則被用來作標准品的物質應當要有盡可能高的純度，並得到充分界定。
工作對照品 (也就是內部標准品或二級標准品)是根據一級對照品標定的，並用來代替一級對照品的。
B．分析報告單
對於非官方標准品，在申請的分析方法和控制章節中應當要提供該標准品的分析報告單。對於從官方獲得的標准品，用戶應當要確保標准品的適用性。應當正確儲存標准品並在已確定的時間段內使用該標准品。
C．標准品的界定
從USP/NF及其它官方來源獲得的標准品是不需要進一步界定的。非官方對照品要有盡可能高的純度，並進行充分地界定以確保其結構，劑量，質量，純度和效力。
T用於界定標准品的定性和定量分析方法應當要不同於用於控制原料葯或制劑的結構，劑量，質量，純度和效力的分析方法，要比它們更深入。用於標准品界定的分析方法不應僅僅是和先前的指定標准品進行比較實驗。
一般來說，界定資料應當要包括：
標准品的簡單工藝描述，如果其生產工藝是否於其相應的原料葯的話。應當要敘述制備標准品時所用的補充精製過程。
相關光譜圖，色譜圖，TLC照片及其它儀器輸出的清晰復印件。建立純度的資料。應當要應用適當的檢測方法來獲得這些資料，比如說TLC，GC，HPLC，相溶解分析，適當的熱分析方法及其它必要的分析方法。
適當的化學性質資料，比如結構式，經驗式和分子量等。結構確證資料應當要包括適當的分析測試，比如元素分析，IR，UV,NMR和MS，及適用的官能團分析。還應當要提供具體的結構解析資料。
物理性質的描述，包括顏色和物理形態。 適當的物理常數，比如說熔程，沸程，折射率，離解常數(pK值)和旋光度。用於界定標准品的分析程序的詳細敘述。
至於生物技術/生物產品的標准品，應當要考慮上述建議，可能可以應用。然而，其它確定物理化學性質，結構特性，生物活性和/或免疫化學活性的補充檢測和/或其它檢測將是非常重要的。
物理化學性質包括異構體，電泳和液相色譜行為及光譜性質等。結構界定可能包括氨基酸序列，氨基酸組成，縮氨酸圖和碳水結構。確定生物和/或免疫化學活性的分析方法應當要和用來確定產品效力的分析方法一樣。
Th這些分析方法可以包括基於動物的，細胞培養的，生物化學的或配位體/接受體螯合的分析方法。如果這些檢測需用於某些標准品的界定，生物和免疫化學檢測的分析方法驗證方面的特殊建議並不在本指南的范圍之內。
V．IND中的分析方法驗證
對於IND而言，每個階段的研究都需要有足夠的資料以確保合適的認定，質量，純度，劑量和/或效力。所需的分析方法和方法驗證方面的資料會隨著研究的階段變化而變化(21CFR312.23(a)(7))。
N關於在第1階段研究所需提交的分析方法和方法驗證資料方面的指南，發起人可以參考FDA的指南：葯品（包括結構確定的，有療效的，生物技術產品）第1階段研究的IND申請的內容和格式（1995年11月）。
第2和第3階段研究所需提交的分析方法和方法驗證資料方面的指南，發起人將可以參考FDA的指南：葯品（包括結構確定的，有療效的，生物技術產品）第1階段研究的IND申請的CMC內容和格式（草案，1999年4月）。
在遞交NDA，ANDA，BLA或PLA時，所有的分析方法都應當要開發出來，並得到驗證。
VI．NDA，ANDA，BLA和PLA中分析方法的內容和格式
NDA，ANDA，BLA和PLA中所提交的任一分析方法都應當要有詳細的描述，以使合格的分析人員能重現出所需的實驗條件並獲得和申請者相當的實驗結果。應當要敘述分析方法中需要特殊注意的地方。
如果所用的分析方法是USP/NF或其它FDA認可參考文獻（如，<>）中且所參考的分析方法未經過修改的話，則需提供該分析方法的參引，而不用提供該分析方法的描述（21 CFR 211.194）。
對於從其它公開發表的文獻上獲得的分析方法，應當要對其進行敘述，因為評審官可能並不能很方便的獲得這些文獻。
分析方法描述中需要包括的典型內容如下所示：
A．基本方法
HPLC進行分離的，檢測器為UV檢測器。
B．取樣
需要敘述的有：所選樣品的數目（比如，瓶，片等），它們是如何使用的（也就是，單獨的或是混合樣品），每個樣品分析的重復次數。
C．儀器和儀器參數
需要敘述的有：儀器列表（比如，儀器類型，檢測器，柱子類型，尺寸等）和儀器參數（比如，流速，溫度，運行時間和設定波長等）。如果必要的話，還要提供實驗結構示意圖（比如，闡述噴灑式分析方法的位置）。
D．試劑
需要敘述的有：試劑列表及其相應的規格（比如：USP/NF，美國化學社（ACS）分析試劑）。如果使用的是自製試劑或更改過的商業試劑，則應當要有其制備方法。對於不穩定的或有潛在危險的試劑，應標明其儲存條件，安全使用說明和使用周期。
E．系統適應性實驗
系統適應性實驗參數和合格標準是建立基礎是：儀器，電子元件，分析操作和待測樣品是個不可分割的整體。系統適應性實驗確保系統在樣品分析的時候能很好地運行。在分析方法中應當要包括適當的系統適應性合格標准。
所有的色譜分析方法都應當要有系統適應性實驗及相應的合格標准。CDER評審官指南<<色譜分析方法的驗證>>（1994年11月）對用於評估系統適應性的典型參數進行了定義和討論。
建議系統適應性實驗應成為所有分析方法的一部分，而不僅僅是色譜分析方法。無論是哪類分析方法，都要採用實驗來證實該系統能不受環境條件的影響而正確地運行。比如說，滴定法一般來說需要進行空白實驗。
F．標准品的制備
要有所有標准品溶液（比如，儲備液，工作對照品溶液，內部對照品溶液）的配製方法。
G.操作過程
應當要按操作步驟對操作過程進行逐步敘述。敘述應當要適當包括如下信息：平衡時間，樣品進樣順序和系統適應性或啟動參數。需標明不常見的危險。
Ⅳ 求 生物制葯工藝流程
微生物制葯技術
工業微生物技術是可持續發展的一個重要支撐，是解決資源危機、生態環境危機和改造傳統產業的根本技術依託。工業微生物的發展使現代生物技術滲透到包括醫葯、農業、能源、化工、環保等幾乎所有的工業領域，並扮演著重要角色。歐美日等國已不同程度地制定了今後幾十年內用生物過程取代化學過程的戰略計劃，可以看出工業微生物技術在未來社會發展過程中重要地位。
微生物制葯技術是工業微生物技術的最主要組成部分。微生物葯物的利用是從人們熟知的抗生素開始的，抗生素一般定義為：是一種在低濃度下有選擇地抑制或影響其他生物機能的微生物產物及其衍生物。(有人曾建議將動植物來源的具有同樣生理活性的這類物質如魚素、蒜素、黃連素等也歸於抗生素的范疇，但多數學者認為傳統概念的抗生素仍應只限於微生物的次級代謝產物。)近年來，由於基礎生命科學的發展和各種新的生物技術的應用，報道的微生物產生的除了抗感染、抗腫瘤以外的其他生物活性物質日益增多，如特異性的酶抑制劑、免疫調節劑、受體拮抗劑和抗氧化劑等，其活性已超出了抑制某些微生物生命活動的范圍。但這些物質均為微生物次級代謝產物，其在生物合成機制、篩選研究程序及生產工藝等方面和抗生素都有共同的特點，但把它們通稱為抗生素顯然是不恰當的，於是不少學者就把微生物產生的這些具有生理活性（或稱葯理活性）的次級代謝產物統稱為微生物葯物。微生物葯物的生產技術就是微生物制葯技術。可以認為包括五個方面的內容：
第一方面 菌種的獲得
根據資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；從大自然中分離篩選新的微生物菌種。
分離思路 新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產的要求、菌種的特性，採用各種篩選方法，快速、准確地把所需要的菌種挑選出來。實驗室或生產用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進行分離純化。具體分離操作從以下幾個方面展開。
定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養特性。
采樣：有針對性地採集樣品。
增殖：人為地通過控制養分或培條件，使所需菌種增殖培養後，在數量上占優勢。
分離：利用分離技術得到純種。
發酵性能測定：進行生產性能測定。這些特性包括形態、培養特徵、營養要求、生理生化特性、發酵周期、產品品種和產量、耐受最高溫度、生長和發酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。
第二方面 高產菌株的選育
工業上生產用菌株都是經過選育過的。工業菌種的育種是運用遺傳學原理和技術對某個用於特定生物技術目的的菌株進行的多方位的改造。通過改造，可使現存的優良性狀強化，或去除不良性質或增加新的性狀。
工業菌種育種的方法：誘變、基因轉移、基因重組。
育種過程包括下列3個步驟： (1)在不影響菌種活力的前提下，有益基因型的引入。(2)希望基因型的選出。(3)改良菌種的評價(包括實驗規模和工業生產規模)。
選擇育種方法時需綜合考慮的因素(1)待改良性狀的本質及與發酵工藝的關系(例如分批或者連續發酵試驗)；(2)對這一特定菌種的遺傳和生物化學方面認識的明了程度；(3)經濟費用。如果對特定菌種的基本性狀及其工藝知曉甚少，則多半採用隨機誘變、篩選及選育等技術；如果對其遺傳及生物化學方面的性狀已有較深的認識，則可選擇基因重組等手段進行定向育種。
工業菌種具體改良思路：(1)解除或繞過代謝途徑中的限速步驟（通過增加特定基因的拷貝數或增加相應基因的表達能力來提高限速酶的含量；在代謝途徑中引伸出新的代謝步驟，由此提供一個旁路代謝途徑。） (2)增加前體物的濃度。 (3)改變代謝途徑，減少無用副產品的生成以及提高菌種對高濃度的有潛在毒性的底物、前體或產品的耐受力。(4)抑制或消除產品分解酶。 (5)改進菌種外泌產品的能力。(6)消除代謝產品的反饋抑制。如誘導代謝產品的結構類似物抗性。
Ⅵ 生物制葯工藝流程分析題怎麼分析
生物技術制葯包括基因工程制葯,細胞工程制葯,酶工程制葯和發酵工程制葯.基因工程制葯的工藝流程可分為以下幾步:1.目的基因的獲得 這可通過多種方法獲得,如反轉錄法,鳥槍法,化學合成或由已有基因來改造 2.目的基因與載體的結合,構建工程菌 這時要注意載體必須符合以下要求:有多個克隆位點.有較強的啟動子和終止子,能夠獨立復制 俯償碘鍛鄢蹬碉拳冬嘩 3.發酵培養 即在發酵罐中培養 4.外源目的基因的表達 5.外源表達產物的純化分離 分離一般也要以下步驟:細胞破碎,固液分離,濃縮,初步提純和高度提純. 細胞工程制葯,分動物細胞制葯和植物細胞制葯.目前動物細胞制葯主要製取單抗,疫苗.植物細胞制葯主要是為獲得植物細胞的此生代謝產物.此種方法的有點是條件容易控制,產量大.缺點是遺傳不夠穩定. 酶工程制葯 它是利用酶工程和原生質體融合,誘導和基因重組等技術相結合,不僅可使微生物轉化的效率成倍增加,而且可以使整個生產過程連續,自動化. 發酵工程制葯 此法又稱微生物工程. 它在原有的發酵技術的基礎上又採用了新技術使工藝水平大大提高.可以看成是基因工程制葯的一部分,這兩種方法都是經過細胞大規模培養來獲得大量目標產品.此法要先找到菌種,在放大培養即可.
Ⅶ 生物制葯技術包括哪些方法
生物葯物是指運用生物學、醫學、生物化學等的研究成果，綜合利用物理學、化學、生物化學、生物技術和葯學等學科的原理和方法，利用生物體、生物組織、細胞、體液等製造的一類用於預防、治療和診斷的製品。生物葯物，包括生物技術葯物和原生物制葯。
指包括生物製品在內的生物體的初級和次級代謝產物或生物體的某一組成部分，甚至整個生物體用作診斷和治療的醫葯品本專業培養具備扎實的生物技術和葯學基礎理論、基本知識，熟練掌握現代生物技術和制葯技術的常用實驗流程，初步了解生物技術制葯企業生產和銷售環節的流程，能夠勝任現代生物技術實驗室和生物技術制葯企業崗位基本要求的德、智、體、美全面發展的技術應用型高級實用人才。
本專業學生應掌握生物化學、生化分離分析技術、生物技術及工業葯劑學等方面的基本理論知識和專業技能，受到生物制葯研究和生產技術的基本訓練，畢業後能從事生物葯物的資源開發、產品研製、生產、技術管理、質量控制等工作。
Ⅷ 如何應用微生物與免疫學的理論指導開發新葯
現在已經有生物葯（疫苗）和抗體葯（抗體耦合小分子）這種超越了傳統教科書上內容的葯物上市了。下面我們以傳統的小分子化合物葯（比如青黴素，比如對乙醯氨基酚）為例，大致說一下葯物研發從無到有到最後上市的流程。
i. 臨床前研究。
1.葯物靶點的確認。
這個是所有工作的開始。只有確定了靶點，後續所有的工作才有展開的依據。
2.化合物的合成。
這個階段的工作主要負責新化合物的合成，現有化合物的結構改造和優化。
3.活性化合物的篩選
不是所有合成出來的化合物都能有理想的活性，在這個階段需要通過生物實驗手段篩選出初步有活性的化合物用作備選。這些化合物叫先導化合物（lead）。得到的活性數據可以結合化合物結構得到初步的構效關系分析。構效關系可以有效的指導後續的化合物結構優化。這一步工作主要在細胞實驗層面展開。
同時也存在一個化合物對目標A靶點沒有作用，卻有可能對其他的B靶點C靶點有非常好的活性的情況，暫且不表。
4.返回到2進行下一步的化合物結構修飾得到活性更好的化合物。
2到4這是一個循環，直到我們得到了活性足夠理想的化合物。
上面的內容也就是葯物化學領域的大致工作范圍了。
5.評估葯物的葯理作用，安全性與毒性，葯物的吸收、分布、代謝和排泄情況（ADME）。
這部分的實驗需要在動物層面展開。細胞實驗的結果和活體動物實驗的結果有時候會有很大的差異。這一步的目的是確定葯物的有效性與安全性。
6.制劑的開發。
總不能弄點化合物就直接往嘴裡倒吧。制劑開發是葯物應用的一個重要環節。比如有的葯胃腸吸收很差，就需要開發為注射劑。有的葯對在胃酸裡面會失去活性，就需要開發為腸溶制劑。有的化合物溶解性不好，這也可以通過制劑來部分解決這個問題。
前面這些內容都統稱為臨床前研究。是葯物研發的最開端的內容。各個實驗的步驟並不一定嚴格按照這個順序展開，也沒有1、2、3這樣一個明顯的分界線。各個步驟是一個相互包容協調的關系。
ii.臨床研究。
1. 臨床I期。
2.臨床II期。
3.臨床III期。
這部分的具體內容不怎麼了解。我從網路知道上找了個回答。可以參考。
http://..com/question/52182460.html
Ⅰ期臨床試驗
在新葯開發過程中,將新葯第一次用於人體以研究新葯的性質的試驗,稱之為Ⅰ期臨床試驗.即在嚴格控制的條件下,給少量試驗葯物於少數經過謹慎選擇和篩選出的健康志願者(對腫瘤葯物而言通常為腫瘤病人),然後仔細監測葯物的血液濃度\排泄性質和任何有益反應或不良作用,以評價葯物在人體內的性質.Ⅰ期臨床試驗通常要求健康志願者住院以進行24小時的密切監護.隨著對新葯的安全性了解的增加,給葯的劑量可逐漸提高,並可以多劑量給葯.通過Ⅰ期臨床試驗,還可以得到一些葯物最高和最低劑量的信息,以便確定將來在病人身上使用的合適劑量.可見,Ⅰ期臨床試驗是初步的臨床葯理學及人體安全性評價試驗,目的在於觀測人體對新葯的耐受程度和葯代動力學,為制定給葯方案提供依據.
Ⅱ期臨床試驗
通過Ⅰ期臨床研究,在健康人身上得到了為達到合理的血葯濃度所需要的葯品的劑理的信息,即葯代動力學數據.但是,通常在健康的人體上是不可能證實葯品的治療作用的.在臨床研究的第二階段即Ⅱ期臨床試驗,將給葯於少數病人志願者,然後重新評價葯物的葯代動力學和排泄情況.這是因為葯物在患病狀態的人體內的作用方式常常是不同的,對那些影響腸、胃、肝、和腎的葯物尤其如此。以一個新的治療關節炎的止通葯的開發為例。Ⅱ期臨床研究將確定該葯緩解關節炎病人的疼通效果如何，還要確定在不同劑量時不良反應的發生率的高低，以確定疼痛得到充分緩解但不良反應最小的劑量。可以說，Ⅱ期臨床試驗是對治療作用的初步評價階段。Ⅱ期臨床試驗一般通過隨機盲法對照試驗（根據具體目的也可以採取其他設計形式），對新葯的有效性和安全性作出初步評價，並為設計Ⅲ期臨床試驗和確定給葯劑量方案提供依據。
Ⅲ期臨床試驗
在Ⅰ，Ⅱ期臨床研究的基礎上，將試驗葯物用於更大范圍的病人志願者身上，進行擴大的多中心臨床試驗，進一步評價葯物的有效性和耐受性（或安全性），稱之為Ⅲ期臨床試驗。Ⅲ期臨床試驗可以說是治療作用的確證階段，也是為葯品注冊申請獲得批准提供依據的關鍵階段，該期試驗一般為具有足夠樣本量的隨機化盲法對照試驗。臨床試驗將對試驗葯物和安慰劑（不含活性物質）或已上市葯品的有關參數進行比較。試驗結果應當具有可重復性。可以說，該階段是臨床研究項目的最繁忙和任務最集中的部分。除了對成年病人研究外，還要特別研究葯物對老年病人，有時還要包括兒童的安全性。一般來講，老年病人和危重病人所要求的劑量要低一些，因為他們的身體不能有產地清除葯物，使得他們對不良反應的耐受性更差，所以應當進行特別的研究來確定劑量。而兒童人群具有突變敏感性、遲發毒性和不同的葯
Ⅸ 新葯的開發研製過程是怎樣進行的
新葯研製主要分新葯臨床前研
究和新葯臨床研究兩個過程。
l新葯臨床前研究內容
葯學研究
葯理學研究
毒理學研究
一、葯學研究主要內容
⑴ 原料葯生產工藝研究
⑵ 制劑處方及工藝研究
⑶ 確證化學結構或組分研究
⑷ 質量研究：包括理化性質、純
度檢查、溶出度、含量測定等
⑸ 質量標准草案及起草說明
⑹ 穩定性研究
⑺ 臨床研究用樣品及其檢驗
報告
⑻ 產品包裝材料及其選擇依據
二、新葯葯理毒理學研究
1．葯理學內容：
①葯效學試驗：
主要葯效學試驗
一般葯理學試驗；
②葯動學試驗。
2．主要葯效學研究
1） 葯效學試驗：應以動物體內試驗
為主，必要時配合體外試驗，從
不同層次證實其葯效。
2） 觀測指標：應選用特異性強、敏
感性高、重現性好、客觀、定量
或半定量的指標進行觀測。
3）實驗動物：根據各種試驗的
具體要求，合理選擇動物，對
其種屬、性別、年齡、體重、
健康狀態、飼養條件、動物來
源及合格證號等，應有詳細記
錄。
5） 給葯劑量及途徑
⑴ 試驗分組：各種試驗至少應設
三個劑量組，劑量選擇應合理，盡
量反映量效和／或時效關系，大動
物（猴、狗等）試驗或在特殊情況
下，可適當減少劑量組。
⑵ 給葯途徑：應與臨床相同，如
確有困難，也可選用其他給葯途徑
進行試驗，但應說明原因。
6）對照：主要葯效學研究應設對照
組，包括：
⑴ 正常動物空白對照組；
⑵ 模型動物對照組；
⑶ 陽性葯物對照組（必要時增設
溶媒或賦形劑對照組）。陽性對照葯
應選用正式批准生產的葯品，根據需
要設一個或多個劑量組。
3．一般葯理學研究
主要觀察給葯後對動物以下三個系統的影響：
⒈）神經系統：活動情況、行為變化
及對中樞神經系統的影響。
⒉）心血管系統：對心電圖及血壓等
的影響。
⒊）呼吸系統：對呼吸頻率、節律及
幅度的影響。
須設2～3個劑量組，低劑量
應相當於葯效學的有效劑量；給
葯途徑應與主要葯效學試驗相同，
4．葯動學研究
對有效成分明確的第一類新葯，
可參照化學葯品的葯動學方法，研
究其在動物體內的吸收、分布、代
謝及排泄，並計算各項參數。
5．毒理學研究 Toxicology Study
1）急性毒性（Acute toxicology）
2）慢性毒性（Chronic toxicology）
3）特殊毒性（Special Test）
半數致死量
Lethal Dose 50 (LD50)
最大耐受量
Maximal Resistance Experiment
1）急性毒性試驗
(1）LD50測定選用擬推薦臨床試驗
的給葯途徑，觀察一次給葯
後動物的毒性反應並測定其
LD50。
水溶性好的一、二類新葯應測定
二種給葯途徑的LD50。給葯後至少
觀察7天，記錄動物毒性反應情況、
體重變化及動物死亡時間分布。對
死亡動物應及時進行肉眼屍檢，當
屍檢發現病變時應對該組織進行鏡
檢。
2）最大給葯量試驗
如因受試葯物的濃度或體積限制，
無法測出半數致死量（LD50）時，可
做最大給葯量試驗。試驗應選用擬推
薦臨床試驗的給葯途徑，以動物能耐
受的最大濃度、最大體積的葯量一次
或一日內2～3次給予動物。
（如用小白鼠，動物數不得少於
20隻，雌雄各半），連續觀察7天，
詳細記錄動物反應情況，計算出
總給葯量（摺合生葯量g/kg）。
3）長期毒性試驗
長期毒性試驗是觀察動物因連
續用葯而產生的毒性反應及其嚴重
程度，以及停葯後的發展和恢復情
況，為臨床研究提供依據。
長期毒性實驗條件 Conditions for Chronic Experiment
⑴ 動物 （Animals）
⑵ 劑量 （Dosage）
⑶方法與給葯途徑
（Methods and route of administration）
⑷ 實驗周期（Experimental cycle）
治療局部應用的葯物 Drugs for local application
治療局部疾患且方中不含毒性葯
材或有毒成分的第三、第四類外用葯，
一般可不做長期毒性試驗。
但需做局部刺激試驗、過敏試驗，
必要時需做光敏試驗。
可能影響胎兒或子代發育的葯物，
除按一般毒理學要求進行試驗外，
還應增做相應的生殖毒性試驗
(reproctive experiment) 。
特殊毒性實驗（Special Test）
致癌實驗（Carcinogenesis test）
genetic mutation
致突變實驗（Mutagenesis test）
cancer inction
致畸癌實驗（Teratogenesis test）
congenitally deformed baby or
congenital malformation
Drug dependence Test: addiction
進行臨床研究應具備的條件
申報臨床研究並獲得國家食品葯品監督
管理（SFDA)局批准
Application for Clinical Study
Approval by CDA
獲得倫理委員會批准
Supervised by Ethic Council
新葯臨床實驗 Clinical Study of New Drugs
臨床試驗（Clinical Trials)
生物等效性試驗
（Bio-equivalent Study）
臨床試驗分期 Clinical trials
I 期
II期
III期
IV期
I期臨床試驗
為初步的臨床葯理學及人體安全性評價試驗，主要觀察人體對新葯的耐受性（tolerance）和葯動學規律，為制定給葯方案提供依據。
Biological equipotent
experiment 生物等效性試驗
II 期臨床試驗
為隨機盲法對照臨床試驗，主要對新葯有效性及安全性作出初步評價，並推薦臨床給葯劑量。
III期臨床試驗
為擴大的多中心臨床試驗，
應遵循隨機對照原則，進一步評
價新葯的有效性和安全性。
IV期臨床試驗
為新葯上市後的監測，在廣
泛使用條件下進一步考察新葯的
療效和不良反應（尤其注意罕見
的不良反應）。
臨床研究要求Principle Require
⒈獲得國家食品葯品監督管理（SFDA)
局批准
⒉符合國家葯品監督管理局《葯品臨
床試驗管理規范》的有關規定。
⒊臨床研究的病例數應符合統計學要
求。
4．在SDA確定的葯品臨床研究基地中
選擇臨床研究負責和承擔單位
⒌ 臨床研究單位應了解和熟悉試驗用
葯的作用和安全性，按GCP要求制
定臨床研究方案。
⒍ 應指定具有一定專業知識的人員遵
循GCP的有關要求，監督臨床研究
的進行。
⒎ 不良事件（Adverse events ）
臨床研究期間若發生嚴重不
良事件，須立即採取必要措施
保護受試者安全，並在24小時
內向當地省級葯品監督管理部
門和國家葯品監督管理局報告。
⒏ 臨床研究完成後，臨床研究單
位須寫出總結報告，負責單位
匯總，交研製單位。
有關試驗和具體要求
⒈ 耐受性試驗
受試對象、受試例數、分組、
確定初試劑量
⒈ 耐受性試驗
⑴ 受試對象：應選擇健康志願者，
特殊病證可選輕型患者。健康狀況
須經健康檢查，除一般體格檢查外，
尚要做血、尿、糞便常規化驗和心、
肝、腎功能檢查，並應均屬正常。
要注意排除有葯物、食物過敏史者。
對妊娠期、哺乳期、月經期及嗜煙、
嗜酒者亦應除外。還應排除可能影響
試驗結果和試驗對象健康的隱性傳染
病等。
受試例數20～30例，以18～50歲為宜，
男女例數最好相等。
⑵ 分組：在最小初試劑量與最大初試
劑量之間分若干組。
⑶ 確定初試劑量：最小初試劑量一般
可從同類葯物臨床治療量的1/10開
始。
⒉ 葯動學研究
⑴ 可與耐受性試驗結合進行
⑵ 質控要求：檢測方法應靈敏度
精、專屬性強、回收率高和重
現性好。
葯品不良反應
（adverse drug reaction，ADR）
不良事件
（adverse event）
葯品不良反應和不良事件 的判斷與處理
⑴ 葯品不良反應
（adverse drug reaction，ADR）
指在規定劑量正常用葯過程中所產
生的有害而非期望的、與葯品應用有
因果關系的反應。
在一種新葯或葯品新用途的
臨床試驗中，如治療劑量尚未確
定時，所有的有害而非期望的、
與葯品應用有因果關系的反應，
也應視為葯品不良反應。
⑵ 不良事件（adverse event）：
病人或臨床試驗受試者接受一種葯
品後出現的不良醫學事件，但並不
一定與治療有因果關系。
⑶ 嚴重不良事件
（serious adverse event）：
臨床試驗過程中發生需住院治療、
延長住院時間、傷殘、影響工作能
力、危及生命或死亡、導致先天畸
形等不良事件。
⑷ 葯品不良反應分類
臨床試驗中葯品不良反應分臨
床反應和化驗異常兩部分。
臨床反應常分為A、B、C三型。
① A型反應：由葯物葯理作用過強或
與其他葯物出現相互作用所引起。
臨床試驗中觀察、檢查和評價的主
要是A型反應，其評價方法與上市
後監測葯物不良反應的方法相似，
都是通過所發現的反應與所用葯物
之間的因果分析來評定反應與葯物
是否有關。
②B型反應：又稱特異反應，可危
及生命且不能預測，一旦發生，
需立即向主辦單位與葯政管理
部門報告。
③C型反應：常以疾病形式出現，在
新葯試驗中不易被察覺，常通過流
行學研究發現。
葯品不良反應的評價標准
①五級標准：
有關 / 很可能有關 / 可能有關 /
可能無關 / 無關
用前二種相加來統計不良反應發生率。
② 七級標准：
有關/很可能有關/可能有關/不大可能有關/可能無關/無關/無法評價。
如何確定不良事件與葯物存在因果關系
①用葯與出現不良事件的時間關系以
及是否具有量效關系
②停葯後不良事件是否有所緩解
③在嚴密觀察並確保安全的情況下，
觀察重復給葯時不良事件是否再次
出現等。
⒋臨床試驗設計原則Principle of clinical trials
隨機性（randomization）
合理性（rationality）
重復性（replication）
代表性（representativeness）
⑴ 隨機性：兩組病人的分配均勻，不
隨主觀意志為轉移。
⑵ 合理性：既要符合專業要求與統計
學要求，又要切實可行。
⑶ 代表性：受試對象的確定應符合樣
本抽樣符合總體的原則。
⑷ 重復性：經得起重復驗證。排除系
統誤差。
⒌ 對照試驗
⑴ 平行對照試驗：
隨機分組對照試驗，最常用的是試
驗葯A與對照葯B（或安慰劑）進行
隨機對照比較。
⑵ 交叉對照試驗：
拉丁方設計（latin square design）。
⒍ 設盲（blinding／masking）：
使一方或多方不知道受試者治療分配的一種程序。
雙盲法試驗（double blind technique）
⒎ 安慰劑（placebo）
安慰劑是指沒有葯理活性的物質如乳
糖、澱粉等，常用作臨床對照試驗中
的陰性對照。
安慰劑可引起療效（正效應）和不良
反應（負效應）。鎮痛、鎮靜止咳等
的有效率平均可達35.2％土2.2％。
分類：
純安慰劑:無葯理活性
不純安慰劑:指作用不強的葯物，
有時起安慰劑的作用。
安慰劑效應（placebo effect）
⒏ 療效判斷
臨床療效評價（response assessment）
公認標准採用四級評定。
痊癒（cure）
顯效（excellence）
好轉（improvement）
無效（failure）
痊癒率+顯效率=有效率（％）。
⒈ 葯品臨床前試驗管理規范 （good laboratory practice，GLP）
GLP是對從事實驗研究的規劃設計、執行實施、管理監督和記錄報告等實驗室組織管理、工作方法和有關條件所提出的法規性文件。它主要是針對有關葯品、食品添加劑、農葯、化學試劑、化妝品及其他醫用物品的動物
毒性評價而制定的法規，目的在
於嚴格控制葯品安全性評價的各
個環節，包括嚴格控制可能影響
實驗結果准確性的各種主、客觀
因素，如保證實驗研究人員具備
一定素質、實驗設計慎密合理、
各種實驗條件合格、數據完整准
確以及總結資料科學真實等。
2. 葯品臨床試驗管理規范
（good clinicaI practice，GCP）
GCP的核心是保障受試者與患者的權利，保證臨床試驗的科學性。這些規范規定了臨床試驗的有關各方，即申辦者、研究者及管理當局在臨床試驗中的職責、相互關系和工作方式。
3. 葯品生產質量管理規范
（good manufacture practice, GMP）
GMP是為生產出全面符合質量標準的葯品而制定的生產規范，它由硬體和軟體組成，其實施包括葯品生產的全過程，從對原料、制劑一直到銷售、退貨以及葯品管理部門
全體人員應具備的條件等都做了詳細的規定。原料葯的製作與制劑在實質上有一定差別，但GMP要求基本精神要一致。
⒋ 葯品供應質量管理規范
（good supply practice,GSP）:
GSP是為保證葯品在運輸、貯存
和銷售過程中的質量和效力所
制定的管理規范。
⒌ 道地葯材生產規范
（good organic practice，GOP）
GOP是關於大宗葯材基地化和集約化的
生產管理規范，目前正進行GOP基礎研究，
爭取到2010年，使100種最常用道地葯材
的質量穩定在高標准水平上，基本消滅
次、劣品；使出口值排在前10位的葯材
達到國際無公害葯材（Organic）水平。
國家基本葯物 Essential Drugs in China
1985年，WHO在內羅畢會議上擴展
了基本葯物的概念，使其包括了高度重
視合理用葯的內容，同時，在推薦基本
葯物目錄遴選程序時，還把基本葯物的
遴選過程與標准治療指南以及國家處方
集結起來，也就是使基本葯物與合理用
葯相結合。
我國的國家基本葯物是從我國臨床應用
的各類葯物中，經科學評價而遴選出的
具有代表性的葯品，無論從療效、不良
反應、價格和質量，還是從穩定性、使
用方便性和可獲得性等方面，都是同類
葯物中最佳的；是在經濟條件允許的情
況下，治療某種病症的首選葯品，它必
須能滿足大部分人口衛生保健的需要。
處方葯與非處方葯
⒈ 處方葯(prescription drug)
⑴ 剛上市的新葯：對其活性和副作用
還需進一步觀察；
⑵ 可產生依賴性的葯品：如嗎啡類鎮
痛葯及某些催眠安定葯；
⑶ 本身毒性較大的葯品，如抗癌葯等；
⑷ 用葯時要經醫生開處方並在其指
導下使用，或治療需實驗室確診
的某些疾病的葯品，如治療心血
管疾病的葯品。
國家非處方葯遴選原則
應用安全、療效確切、
質量穩定，使用方便。
⒉ 非處方葯(Over the counter, OTC)
OTC多治療諸如感冒、發燒、咳
嗽、消化系統疾病、頭痛、關節疾
病、過敏症（如鼻炎）等疾病；它
還包括營養補劑如維生素、中葯補
劑等葯品，大多安全而有效。
甲類非處方葯的零售企業必須具有
《葯品經營企業許可證》。經省級
葯品監督管理部門或其授權的葯品
監督管理部門批準的其它商業企業
可以零售乙類非處方葯。
零售乙類非處方葯的商業企業必
須配備專職的具有高中以上文化
程度，經專業培訓後，由省級葯
品監督管理部門或其授權的葯品
監督管理部門考核合格並取得上
崗證的人員。
使用注意：因非處方葯不需要憑執業
醫師或執業助理醫師處方，消費者即
可按葯品說明書自行判斷、購買和使
用，為此，對部分品種除規定了使用
時間、療程外，還強調遇到某些情況
時應向醫師咨詢等。
The End