『壹』 如何通過實驗確定各轉錄因子的功能
可以參見如下圖書：
轉錄因子實用技術(第2版)
作者： 劉進元
出版社： 清華大學出版社
出版日期：2004-5-1
ISBN：7302076936 頁數：
版次：第1版
開本：16開
裝幀：平裝
該書是英國牛津大學出版社出版的實驗技術叢書中《Transcription Factors: A Practical Approach》第2版的中譯本。全書共分為11章，詳細介紹了研究真核生物轉錄因子的實用技術，內容包括用cDNA表達文庫，序列相似克隆轉錄因子，用基因位點克隆技術確定轉錄因子的靶基因，轉錄因子的純化及特徵分析，DNA遷移率變動分析，DNA-蛋白質復合體外足跡分析以及轉錄因子的修飾分析等。
『貳』 鑒定轉錄因子與啟動子結合的方法和原理
一般有體外和體內兩種較為常用的方法：
體外：用EMSA
通常將純化的蛋白和32P同位素標記的DNA探針（取promoter部分）一同保溫,在非變性的聚丙烯凝膠電泳上,分離復合物和非結合的探針.DNA-復合物比非結合的探針移動得慢.然後再放射自顯影的儀器上就可以看到條帶,如果條帶移動得慢,就是有結合.
體內：報告基因方法
就是將你想要檢測的promoter裝在一個載體上,然後導入特定的細胞內.該細胞內有表達或者過表達你所想檢測的轉錄因子.如果轉錄因子可以結合在你的promoter上,就可以啟動下游的報告基因表達.報告基因可以是熒光蛋白,也可以是熒光素酶.
註：promoter--啟動子.其實enhancer也可以用來當promoter.
『叄』 有哪些方法可以確定轉錄因子的激活和抑制活性
報告基因～reporter基因前面有一個轉錄因子與之結合的作用元件～luciferase催化底物發光強弱即可反應轉錄因子的激活與抑制情況～
『肆』 DNA與蛋白質相互作用的研究方法有哪些
研究蛋白質與DNA相互作用的主要方法
一、引言
在許多的細胞生命活動中,例如DNA復制、mRNA轉錄與修飾以及病毒的感染等都涉及到DNA與蛋白質之間的相互作用的問題.
重組DNA技術的發展,人們已分離到了許多重要的基因.現在的關鍵問題是需要揭示環境因子及發育信號究竟是如何控制基因的轉錄活性.為此需要：
a、鑒定分析參與基因表達調控的DNA元件；
b、分離並鑒定這些順式元件特異性結合的蛋白質因子；
這些問題的研究都涉及到DNA與蛋白質之間的相互作用.
研究DNA-蛋白質相互作用的實驗方法主要包括：
a、凝膠阻滯實驗； b、DNase 1 足跡實驗；
c、甲基化干擾實驗； d、體內足跡實驗； f、拉下實驗.
二、凝膠阻滯實驗
1、概念：
凝膠阻滯實驗（Gel retardation assay）,要叫做DNA遷移率變動試驗（DNA mobility shift assay）或條帶阻滯實驗（Band retardation assay）是在八十年代初期出現的用於在體外研究DNA與蛋白質相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術.
2、原理：
在凝膠電泳中,由於電場的作用,裸露的DNA分子向正電極移動距離的大小是同其分子量的對數成反比.如果某種DNA分子結合上一種特殊的蛋白質,那麼由於分子量的加大它在凝膠中的遷移作用便會受到阻滯,於是朝正極移動的距離也就相應的縮短,因而在凝膠中出現滯後的條帶,這就是凝膠阻滯實驗的基本原理.
3、過程:
1)\x09首先制備細胞蛋白質提取物（理論上其中含有某種特殊的轉錄因子）
2)\x09用放射性同位素標記待檢測的DNA片段（含有轉錄因子的結合位點）
3)\x09這種被標記的探針DNA同細胞蛋白質提取物一起進行溫育,於是產生DNA-蛋白質復合物
4)\x09在控制使DNA-蛋白質保持結合狀態的條件下,進行非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳
5)\x09最後進行放射自顯影,分析電泳結果
4、實驗結果的分析：
a、如果有放射性標記的條帶都集中於凝膠的底部,這就表明在細胞提取物中不存在可以同探針DNA相互結合的轉錄因子蛋白質；
b、如果在凝膠的頂部出現放射性標記的條帶,這就表明細胞提取物存在可與探針DNA結合的轉錄因子蛋白質.
5、DNA競爭實驗：
DNA競爭實驗（DNA competitive assay）的具體做法如下：
在DNA-蛋白質結合的反應體系中加入了超量的非標記的競爭DNA（competitor DNA）,如果它同探針DNA結合的是同一種轉錄因子蛋白質,那麼由於競爭DNA與探針DNA相比是極大超量的,這樣絕大部分轉錄因子蛋白質都會被競爭結合掉,而使探針DNA仍然處於自由的非結合狀態,可以在電泳凝膠的放射自顯影圖片上就不會出現阻滯的條帶；
如果反應體系中加入的競爭DNA並不能同探針DNA競爭結合同一種轉錄因子,結果在電泳凝膠中的放射自顯影圖片上就會出現阻滯的條帶.
6、應用：
a、凝膠阻滯實驗可以用於鑒定在特殊類型細胞蛋白質提取物中,是否存在能同某一特定的DNA（含有轉錄因子結合位點）結合的轉錄因子蛋白質；
b、DNA競爭實驗可以用來檢測轉錄因子蛋白質同DNA結合的精確序列部位；
c、通過競爭DNA中轉錄因子結合位點的鹼基突變可以研究此種突變競爭性能及其轉錄因子結合作用的影響；
d、也可以利用DNA同特定轉錄因子的結合作用通過親和層析來分離特定的轉錄因子.
三、足跡實驗
1、定義:
足跡實驗（foot-printing assay）,是一種用來檢測被特定轉錄因子蛋白質特異性結合的DNA序列的位置及其核苷酸序列結構的專門實驗方法.
2、原理：
當DNA分子中的某一區段同特異的轉錄因子結合之後便可以得到保護而免受DNaseI 酶的切割作用,而不會產生出相應的切割分子,結果在凝膠電泳放射性自顯影圖片上便出現了一個空白區,俗稱為「足跡」.
3過程：
將待檢測的雙鏈DNA分子在體外用32P作5『末端標記,並用適當的限制性內切酶切出其中的一個末端,於是便得到了一條單鏈末端標記的雙鏈DNA
在體外同細胞蛋白質提取物（細胞核提取物也可以）混合,形成DNA-蛋白質復合體
在反應混合物中加入少量的DNase I,並控制用量使之達到平均每條DNA鏈,只發生一次磷酸二酯鍵的斷裂：
a、如果蛋白質提取物中不存在與DNA結合的特定蛋白質,使DNase I消化之後,便會產生出距離放射性標記末端1個核苷酸,2個核苷酸,3個核苷酸------等等一系列前後長度均相差一個核苷酸的不間斷的連續的DNA片段梯度群體；
b、如果DNA分子同蛋白質提取物中的某種轉錄因子結合,被結合部位的DNA就可以得到保護免受DNase I酶的降解作用；
除去蛋白,加樣在20%序列膠上進行電泳分離,實驗分兩組:
a、實驗組：DNA+蛋白質混合物
b、對照組：只有DNA,未與蛋白質提取物進行溫育
最後進行放射性自顯影,分析實驗結果.
4、結果判斷:
實驗組凝膠電泳顯示的序列,出現空白的區域表明是轉錄因子蛋白質結合部；與對照組序列比較,便可以得出蛋白質結合部位的DNA區段相應的核苷酸序列.
5、其他的足跡實驗方法：
除了DNase1足跡試驗之外,目前還發展出了若干種其他類型的足跡實驗,例如：
a、\x09自由羥基足跡實驗；b、菲咯啉銅足跡實驗；c、DMS(硫酸二甲酯)足跡實驗
DMS(硫酸二甲酯)足跡實驗的原理
DMS能夠使DNA分子中裸露的鳥嘌呤（G）殘基甲基化,而六氫吡啶又會對甲基化的G殘基作特異性的化學切割.如果DNA分子中某一區段同轉錄因子結合,就可以避免發生G殘基的甲基化而免受六氫吡啶的切割作用.
四、甲基化干擾實驗
1、概念：
甲基化干擾實驗（Methylation interference assay）是根據DMS（硫酸二甲酯）能夠使DNA分子中裸露的鳥嘌呤（G）殘基甲基化,而六氫吡啶又會對甲基化的G殘基作特異性的化學切割這一原理設計的另一種研究蛋白質同DNA相互作用的實驗方法.
應用這種技術可以檢測靶DNA中G殘基的優先甲基化,對爾後的蛋白質結合作用究竟會有什麼效應,從而更加詳細的揭示出DNA與蛋白質相互作用的模式.
2、實驗步驟：
用DMS處理靶DNA使之局部甲基化（平均每條DNA只發生一個G鹼基甲基化作用）
同細胞蛋白質提取物一起進行溫育,促進使DNA與蛋白質的結合
進行凝膠電泳形成兩種靶DNA條帶：
a、\x09其一沒有同蛋白質結合的DNA正常電泳條帶
b、其二同特異蛋白質結合而呈現滯後的DNA電泳條帶
將這兩種DNA電泳條帶分別從凝膠中切出,並用六氫吡啶進行切割,結果為：
a、甲基化的G殘基被切割:因為轉錄因子蛋白質只能夠同未發生甲基化的正常的結合位點結合,所以在轉錄因子DNA結合位點序列中的G殘基如果被DMS甲基化之後,轉錄因子就無法同其結合位點（順式元件）發生結合作用,從而使得結合位點中的G殘基同樣也要被六氫吡啶切割；
b、不具有甲基化G殘基的靶DNA 序列則不會被切割
將結合蛋白質的DNA條帶和不結合蛋白質的DNA條帶,經六氫吡啶切割作用之後,再進行凝膠電泳
作放射自顯影,讀片並分析結果
3、結果判斷：
a、同轉錄因子蛋白質結合的靶DNA序列,經六氫吡啶切割之後,電泳分離呈現兩條帶,有一個空白區
b、不同轉錄因子蛋白質結合的靶DNA序列,經六氫吡啶切割後,電泳分離呈現三條帶,沒有空白區域的出現.
4、應用：
a、甲基化干擾實驗可以用來研究轉錄因子與DNA結合位點中的G殘基之間的聯系；
b、是足跡實驗的一種有效的補充手段,可以鑒定足跡實驗中DNA與蛋白質相互作用的精確位置
5、缺點：
DMS只能使DNA序列中的G和A殘基甲基化,而不能使T和C殘基甲基化.
五、體內足跡實驗
上面討論的三種研究轉錄因子與DNA相互作用的方法,有一個共同的不足之處在於它們是在體外進行的實驗,因此人們就會考慮這些實驗結果是否能夠反映細胞內發生的真實生命過程,即細胞內發生的真實的DNA與蛋白質的相互作用情況.
為了解答這個問題,科學家就設計出了一種體內足跡試驗（in vivo foot-printing assay）,該方法可以看做是體外DMS足跡實驗的一個變種.
1、原理：
體內足跡試驗的原理原則上同體外DMS足跡實驗無本質差別,即
a、DMS能夠使G殘基甲基化；
b、六氫吡啶能特異的切割甲基化的G殘基；
c、同特異轉錄因子蛋白質結合的識別序列中的G殘基由於受到蛋白質的保護而不會被DMS甲基化,於是不會被六氫吡啶切割；
d、同對照的裸露的DNA形成的序列梯作比較,就會發現活細胞DNA形成的序列梯中缺少G殘基沒有被切割的相應條帶.
2、過程：
用有限數量的化學試劑DMS處理完整的游離細胞,使滲透到胞內的DMS濃度恰好導致天然染色體DNA的G殘基發生甲基化
對這些經過DMS處理的細胞提取DNA,並在體外加入六氫吡啶作消化反應
PCR擴增後作凝膠電泳分析,因為在體外實驗中用的是克隆的DNA片段其數量足夠,而在體內足跡實驗中用的是從染色體DNA中分離獲得的任何一種特異的DNA,其數量是微不足道的,所以需要經PCR擴增以獲得足夠數量的特異DNA
放射自顯影,讀片並記錄讀片的結果
3、結果判斷：
a、能夠同轉錄因子蛋白質結合的DNA區段其中G殘基受到保護因而不會被DMS甲基化避免了六氫吡啶的切割作用；
b、體外裸露的DNA分子上,G殘基被DMS甲基化而被六氫吡啶切割.
六、拉下實驗（Pull-down assay）
拉下實驗又叫做蛋白質體外結合實驗（binding assay in vitro）,是一種在試管中檢測蛋白質之間相互作用的方法.其基本原理是將某種小肽（例如生物素、6-His標簽以及谷胱甘肽轉移酶等）的編碼基因與誘餌蛋白的編碼基因重組,表達為融合蛋白.分離純化融合蛋白並與磁珠結合,使之固相化之後,再與表達目的蛋白的細胞提取物混合保溫適當時間,例如在4℃下保溫過夜,使目標蛋白同已經固定在磁珠表面的融合蛋白中的誘餌蛋白充分的結合.離心收集與固定化的融合蛋白（即與磁珠相互結合的融合蛋白）中的誘餌蛋白相結合的目的蛋白,經過煮沸處理使目的蛋白與誘餌蛋白相脫離從而從固相支持物（例如磁珠）上脫離下來,收集樣品,再與目標蛋白的抗體作Western blotting分析,以檢測出與誘餌蛋白的目標的目標蛋白.
染色質免疫共沉澱技術（ChIP） 真核生物的基因組DNA以染色質的形式存在.因此,研究蛋白質與DNA在染色質環境下的相互作用是闡明真核生物基因表達機制的基本途徑.染色質免疫沉澱技術（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前唯一研究體內DNA與蛋白質相互作用的方法.它的基本原理是在活細胞狀態下固定蛋白質－DNA復合物,並將其隨機切斷為一定長度范圍內的染色質小片段,然後通過免疫學方法沉澱此復合體,特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段,通過對目的片斷的純化與檢測,從而獲得蛋白質與DNA相互作用的信息.CHIP不僅可以檢測體內反式因子與DNA的動態作用,還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關系.而且,CHIP與其他方法的結合,擴大了其應用范圍：CHIP與基因晶元相結合建立的CHIP-on-chip方法已廣泛用於特定反式因子靶基因的高通量篩選；CHIP與體內足跡法相結合,用於尋找反式因子的體內結合位點；RNA-CHIP用於研究RNA在基因表達調控中的作用.由此可見,隨著CHIP的進一步完善,它必將會在基因表達調控研究中發揮越來越重要的作用. 染色體免疫共沉澱（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP）是基於體內分析發展起來的方法,也稱結合位點分析法,在過去十年已經成為表觀遺傳信息研究的主要方法.這項技術幫助研究者判斷在細胞核中基因組的某一特定位置會出現何種組蛋白修飾.ChIP不僅可以檢測體內反式因子與DNA的動態作用,還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關系.近年來,這種技術得到不斷的發展和完善.採用結合微陣列技術在染色體基因表達調控區域檢查染色體活性,是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神經系統紊亂等疾病的主要代謝通路的一種非常有效的工具. 它的原理是在保持組蛋白和DNA聯合的同時,通過運用對應於一個特定組蛋白標記的生物抗體,染色質被切成很小的片斷,並沉澱下來.IP是利用抗原蛋白質和抗體的特異性結合以及細菌蛋白質的「prorein A」特異性地結合到免疫球蛋白的FC片段的現象活用開發出來的方法.目前多用精製的prorein A預先結合固化在argarose的beads上,使之與含有抗原的溶液及抗體反應後,beads上的prorein A就能吸附抗原達到精製的目的.實驗最需要注意點就是抗體的性質.抗體不同和抗原結合能力也不同,免染能結合未必能用在IP反應.建議仔細檢查抗體的說明書.特別是多抗的特異性是問題.其次,要注意溶解抗原的緩沖液的性質.多數的抗原是細胞構成的蛋白,特別是骨架蛋白,緩沖液必須要使其溶解.為此,必須使用含有強界面活性劑的緩沖液,盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結合.另一面,如用弱界面活性劑溶解細胞,就不能充分溶解細胞蛋白.即便溶解也產生與其它的蛋白結合的結果,抗原決定族被封閉,影響與抗體的結合,即使IP成功,也是很多蛋白與抗體共沉的悲慘結果.再次,為防止蛋白的分解,修飾,溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑,低溫下進行實驗.每次實驗之前,首先考慮抗體/緩沖液的比例.抗體過少就不能檢出抗原,過多則就不能沉降在beads上,殘存在上清.緩沖劑太少則不能溶解抗原,過多則抗原被稀釋. ChIP的一般流程： 甲醛處理細胞---收集細胞,超聲破碎---加入目的蛋白的抗體,與靶蛋白-DNA復合物相互結合---加入ProteinA,結合抗體-靶蛋白-DNA復合物,並沉澱---對沉澱下來的復合物進行清洗,除去一些非特異性結合---洗脫,得到富集的靶蛋白-DNA復合物---解交聯,純化富集的DNA-片斷---PCR分析. 在PCR分析這一塊,比較傳統的做法是半定量-PCR.但是現在隨著熒光定量PCR的普及,大家也越來越傾向於Q-PCR了.此外還有一些由ChIP衍生出來的方法.例如RIP（其實就是用ChIP的方法研究細胞內蛋白與RNA的相互結合,具體方法和ChIP差不多,只是實驗過程中要注意防止RNase,最後分析的時候需要先將RNA逆轉錄成為cDNA）；還有ChIP-chip（其實就是ChIP富集得到的DNA-片段,拿去做晶元分析,做法在ChIP的基礎上有所改變,不同的公司有不同的做法,要根據公司的要求來准備樣品）.
GST沉澱實驗（GST-pull down實驗）（細胞外蛋白質相互作用）5-11
上面提到,用酵母雙雜交方法篩選到的蛋白需要作進一步的鑒定.鑒定方法之一就是 GST
沉澱實驗.GST 沉澱實驗主要是用來證明蛋白質胞外的相互作用.蛋白質在胞外的相互作用排除了酵母細胞內復雜體系的干擾,比較直接地檢驗蛋白質分子之間存在的物理的相互作用.同酵母雙雜交實驗一樣,運用此法也可以證明相互作用的蛋白分子中是否有參與調節作用的結構域或 motif.GST\x09沉澱實驗原理就是,把你要研究的蛋白基因亞克隆到帶有GST（谷胱甘肽轉移酶）基因的原核表達載體中,並在細菌中表達 GST 融合蛋白（GST-X）.把 GST 融合蛋白掛到帶有 GST 地物的 Sepharose beads 上,然後把另一種蛋（Y）白加入其中.由於蛋白質之間的結合作用,形成了這樣的復合物：GST-X----Y.這一復合物與固體支持物（Sepharose beads）又
結合在一起,可以被沉澱下來.此法又有在不同情況下的具體應用,以下一一作介紹.
（1）\x09GST 融合蛋白與重組蛋白的相互作用
GST 融合蛋白是在原核表達的,所以沒有經過過多的象真核細胞內具有的蛋白修飾作用.
所以另一種用來檢驗相互作用的蛋白也可以用原核表達出來,也就是所謂的重組蛋白.當 GST融合蛋白把重組蛋白沉澱下來,然後用重組蛋白的抗體作 Western blotting 檢測.
（2） GST 融合蛋白與體外 TNT 系統合成的多肽或蛋白的相互作用
用來檢驗與GST融合蛋白相互作用的蛋白或多肽也可以用TNT體外蛋白合成體系進行合
成,並且還可以在要合成的蛋白或多肽N端或C端加上便於檢測的標簽.GST融合蛋白沉澱下來的蛋白或多肽可以用該蛋白或多肽的抗體或標簽抗體進行Western blotting檢測.如果蛋白之間結合力非常弱,用Western blotting檢測方法難以檢測到,你可以在TNT體外合成時給蛋白進行同位素（S32）標記.這樣沉澱下來的蛋白進行放射自顯影,檢測靈敏度將極大提高.
（3） GST 融合蛋白與細胞內源性蛋白質的相互作用
GST融合蛋白還可以把細胞提取物中有相互作用的內源性蛋白質沉澱下來.如果內源性蛋
白含量低或結合力弱,可以採用脈沖法使細胞在某一段時間內合成的所有蛋白質都標記上放射性同位素（S32）,然後提取細胞總蛋白與GST融合蛋白溫育.GST融合蛋白沉澱下的帶有放射性標記的蛋白跑電泳,進行放射自顯影.
（4） GST 融合蛋白與細胞內瞬時表達的蛋白質的相互作用
當內源性蛋白質含量低,並且有可能影響蛋白質的相互作用,也可以把該蛋白的基因轉染
到靶細胞內進行過表達,然後檢驗蛋白質相互作用.
（5） GST 融合蛋白與待測蛋白的相互作用有可能與待測蛋白的磷酸化狀態有關在進行 GST 沉澱實驗時,有時也會遇到比較復雜的情況,具體情況具體分析,分別對待.比如,兩個蛋白質之間發生相互作用時有可能與蛋白磷酸化狀態有關.或者蛋白首先被磷酸化後方能產生相互作用,或者磷酸化的蛋白必需脫磷酸化後才能產生相互作用.如果你確實在你
的實驗中發現了其中一種情況,這將是一個非常有意義的結果.
3,\x09免疫共沉澱（co-immunoprecipitation ）（細胞內蛋白質相互作用）9-16
免疫共沉澱技術用來證明蛋白質在胞內是否有相互作用.一般來說,兩種蛋白在細胞內發
生相互作用時會形成兩種蛋白的復合物,這樣就可以先用一種蛋白的抗體把免疫復合物沉澱下來,然後用另一種蛋白的抗體進行 Western blotting 檢測,看兩種蛋白之間是否確實形成免疫復合物,並能與 protein A/G agarose 一起沉澱下來.免疫共沉澱原理簡單,但技術極為復雜.因為細胞內蛋白種類繁多,制約因素多.如果兩種蛋白之間可以發生相互作用,並不是這兩種蛋白所有分子都參與結合作用,也可能只有極少部分蛋白分子結合在一起（足以滿足細胞功能需要）.在提取細胞蛋白時,如果條件不當就會破壞兩種相互作用蛋白形成的復合物的穩定性,使得免疫共沉澱實驗失敗.如果兩種蛋白在細胞內的結合力確實非常弱,那麼免疫共沉澱也難以成功.如果知道發生相互作用的兩個蛋白都是胞核蛋白,那麼可以通過提取核蛋白,再進行免疫共沉澱實驗,這樣會大大減低背景的干擾.關於兩種蛋白質之間胞內的相互作用,有時確實無法用免疫共沉澱實驗證明.
（1） 細胞內過表達蛋白的免疫共沉澱
證明蛋白質胞內相互作用時,可以選擇一個高效瞬時過表達系統（至於這一系統是否有內
源性靶蛋白無關緊要）.一般採取 COS 細胞作為真核表達株.把兩種蛋白基因共轉染到 COS 細胞內進行表達.由於人為進行大量表達,所以在胞內兩種蛋白形成相互作用的復合物的量也相應增多.如果你手頭沒有這兩種蛋白的抗體,可以把這兩種蛋白的一端分別加上標簽以融合蛋白形式表達,然後用商業化的抗標簽抗體進行免疫共沉澱和 Western blotting 檢測.
（2） 細胞內源性蛋白的免疫共沉澱
把兩種蛋白共轉染到 COS 細胞內進行過表達,進行免疫共沉澱實驗,相對容易成功,但是
這一結果畢竟具有人工性,不能代表生理條件下真實的蛋白質相互作用.要想克服這一弱點,
可以做內源性的免疫共沉澱實驗.這一技術要求極高,難度極大,但也最有說服力.因為細胞內內源性蛋白含量低,結合在一起形成復合物的量更低,難以檢測.首先要證明所選擇的細胞系是否具有這兩種內源性的蛋白.另外,用於免疫沉澱和 Western blotting 檢測的抗體要好.細胞裂解、收集以及免疫沉澱時時條件要溫和,以保持蛋白復合物的天然結構.
（3） 組織內蛋白的免疫共沉澱
在體外可以大量培養細胞,然後制備細胞提取物,做內源性免疫共沉澱.由此可以推廣到做
組織內免疫共沉澱.取動物組織（腦、肝、脾等）,切碎,勻漿,提取組織蛋白,進行免疫共沉澱實驗.這一結果代表活體中蛋白質相互作用.
4,\x09蛋白質細胞內定位實驗17-22
另一種經常用來檢驗蛋白質相互作用的方法是蛋白質細胞內定位技術.此法較為直觀,可
以看到兩種有相互作用的蛋白質在細胞內的分布（膜上、胞漿、胞核或其它細胞器等等）以及共定位的部位（在膜上共定位、在胞漿中某一部位或核內共定位等等）.有時相互作用的蛋白由於細胞內某種功能的需要結合在一起時,使得兩種蛋白的分布發生變化.比如,某種蛋白也許在核內,當它與另一種具有穿梭功能的蛋白結合時,有可能被轉運到胞漿中.這種情況的共定位則較為典型.在進行蛋白質共定位
（1） 利用有色熒光蛋白標記技術進行蛋白定位研究
此法也可稱為活細胞定位.把兩種具有相互作用的蛋白分別克隆到帶有兩種不同顏色熒光
蛋白（綠色熒光蛋白或紅色熒光蛋白）的載體中,共轉染到功能細胞中（一般選用 COS7 細胞）表達帶有熒光的融合蛋白.這樣,相互作用的兩種蛋白就被標上不同的熒光,可以在細胞內用熒光顯微鏡直接觀測.在進行精確細胞定位或共定位時,必須用共聚焦熒光顯微鏡觀測.因為共聚焦熒光顯微鏡（相當於醫院給病人診斷的 CT）觀測的是細胞內一個切面上的顏色.如果在一個切面上在同一區域看到兩種顏色,就提示這兩種蛋白在該區域內有相互作用.普通熒光顯微鏡看到的是一個立體圖象,無法確定蛋白質共定位現象.在進行定位或共定位同時,也可以對細胞核進行染色.這樣,在細胞中就有三種顏色.細胞核的顯色幫助你確定共定位發生的位置.上面介紹的活細胞定位,其優點是表達的熒光蛋白熒光強,沒有背景,觀測方便.但缺點
是相互作用的蛋白由於標上熒光蛋白,實際上是兩個融合蛋白.融合蛋白的定位結果或共定位結果是否與天然蛋白分布一致,有待於進一步確定.而利用免疫熒游標記技術可以避免這一缺點.
（2） 利用雙色或多色染色的免疫熒光技術進行蛋白定位研究
免疫熒光的原理是,首先把細胞進行固定,然後用待檢測靶蛋白的抗體（一抗）與細胞內
靶蛋白進行免疫反應,再用熒光素（如 FITC 和 TRITC 等）標記的二抗與一抗進行反應.這樣就在細胞內形成免疫復合物（靶蛋白----一抗---二抗）,結果靶蛋白被標上顏色,然後可用共聚焦熒光顯微鏡觀測定位與共定位結果.
免疫熒光技術最大優點就是可用來檢測細胞內源性蛋白的定位及相互作用.當然也可以對
靶細胞進行轉染表達目的蛋白,然後標記目的蛋白進行觀測.免疫熒光技術的缺點是熒光相對較弱並且背景較高,結果受到干擾,所以這項技術不好掌握.為了結果的可靠性,要求嚴格設計陽性對照與陰性對照.
（3） 細胞內蛋白動態定位
有時細胞在正常狀態下,有相互作用的蛋白在胞內可能暫時分開,沒有共定位現象發生.
但是在某一個特定情況下,如細胞受到外界刺激時,細胞本身會產生應急反應,這時暫時分離的蛋白有可能發生相互作用,並產生共定位現象.所以在進行共定位研究時,可根據具體情況具體分析,必要時觀測細胞內蛋白動態定位結果.
『伍』 怎樣研究轉錄因子在aba信號轉導通路中的作用
從基因表達水平來說，說成信號通路准不準確？據我理解，調節通路應該就是對基因表達有調節作用的那些信號轉導通路，而所謂「信號通路」是泛指。
關於「信號通路」這個詞的適用范圍，我認為從細胞外配體一直到細胞核內的轉錄因子，這中間的信號轉導過程應該都可以是信號通路的一部分，而基因表達以後的過程應該就不算了。我讀的文獻不多。不知道我的理解錯在哪裡：
調節通路應泛指所有的通路，包括脂類-蛋白、蛋白-蛋白、蛋白-DNA、RNA-RNA等任意互作構成的通路。信號通路一般情況下也可以指調節通路，但更強調響應某一個信息源（含胞內和胞外，如指定某個因子或刺激源）而執行一定功能的通路，而信號轉導通路（signal transction pathway）則指響應胞外信息源的通路，包括入胞啟動轉錄、至轉錄基因執行功能。也就是說調節通路包括信號通路、信號通路又包括信號轉導通路。不知道這種理解對不對？
請戰友們不吝指教。這方面應該沒有準確的定義，信號通路、信號轉導通路我的理解就是一樣的，老外對signaling pathway、signal transction pathway和signal pathway都是通用的，前者用的最多，後者用的最少。我的理解完整的一個信號通路包括：胞外信息與細胞相互作用，並不一定入胞，啟動胞膜、胞質、胞核等一系列信號分子，直到效應細胞執行功能。這個過程的某個部分其實也可以稱為一個信號通路，因為完整的一個信號通路包括很多分支，每個分支都是一個信號通路，各個分支間可能還存在crosstalk。
很少看到調節通路的說法，evolution版主指的調節通路，比如蛋白-DNA，實際上是2個分子間的相互作用，僅僅這個過程嚴格上不是一個通路，當然相互作用後一般會觸發下游某些分子級聯變化，也就是一個信號通路了。
調節通路（regulatory pathway）、信號通路（signaling pathway）和信號轉導通路（signal transction pathway）應該是有差別的。因為調節的內涵更貼近轉錄調控；因為信號轉導的概念涉及跨膜信號傳遞，所以信號轉導通路就應該指響應胞外信息源過程中牽涉到的分子所連成的路徑。之所以提出這個問題，是因為調控網路已經明確分為代謝網路（metabolic network）、轉錄調控網路（transcriptional regulatory network）和信號轉導網路（signal transction network）。所以，這幾個通路也應該有所區分。
我現在用基因晶元檢測某器官的發育過程，不想僅做個簡單的聚類分析，還希望檢測發育過程中基因表達涉及的通路，這個通路叫調節通路、信號通路、還是信號轉導通路？拿不準。
請戰友們繼續討論。細胞信號轉導（signal transction）主要研究細胞感受、轉導環境刺激的分子途徑及細胞內蛋白質活性。細胞膜通透性，基因表達狀況、細胞形態、功能等各方面的變化過程。通路 （pathway）是醫學上借用的一個詞語，用來描述上述細胞活動中存在反應相關的分子。從這來說：調節通路（regulatory pathway）、信號通路（signaling pathway）和信號轉導通路（signal transction pathway）應該是有差別的。他們都講了細胞信號轉導的一個方面，是從研究的不同角度來說明的。應該是信號通路>調節通路>信號轉導通路，
不知道我的理解對嗎？望指正看來做信號轉導的人遠少於細胞培養。
細胞信號研究是比較復雜的 它主要通過磷酸化和去磷酸化來調節 有專門的磷酸化抗體可以用 但比較貴
『陸』 轉錄因子與基因相互作用的方式有哪些
真核生物基因表達是一個十分復雜而有序的過程，它是眾多的反式因子和順式作用元件之間相互作用的結果。基因的表達在各個層次上都受到精密的調控(包括染色體結構、轉錄、轉錄後、翻譯和翻譯後加工等水平的調控)；轉錄水平的調控發生在基因表達的初期階段，是很多基因表達調控的主要方式之一。所謂轉錄水平的調控是指一類稱為轉錄因子(transcription factor，TF)的蛋白質特異地結合到靶基因調控區的順式作用元件上，或調節基因表達的強度，或控制靶基因的時空特異性表達，或應答外界刺激和環境脅迫。
真核細胞RNA聚合酶自身對啟動子並無特殊親和力，單獨不能進行轉錄，也就是說基因是無活性的。因此，轉錄需要眾多的轉錄因子和輔助轉錄因子形成復雜的轉錄裝置。轉錄因子可以調控某些疾病相關基因轉錄水平，所以它可能成為潛在的治療工具。
1 轉錄因子的結構
轉錄因子一般包括3個主要功能域，即DNA特定序列結合域、轉錄活化的結構域及蛋白質與蛋白質之間的調節結構域。另外，還有一些轉錄因子具有轉錄後調節結構域，如二聚化結構域和磷酸化位點，二聚體的形成對它們行使功能具有重要意義。轉錄因子與轉錄共激活子或轉錄共抑制子結合形成復合物，並與染色質上特異的DNA序列結合而發揮作用。一些小化學分子可以影響轉錄因子的二聚化作用或影響轉錄因子與DNA分子的結合，因此它們可以調節轉錄因子介導的基因表達調控。
1.1 DNA結合域
DNA結合蛋白發揮其轉錄調控功能的首要條件之一是必須有與DNA序列特異結合的結構，其核心成分為DNA結合基序，它們可識別雙螺旋DNA的鹼基序列，與靶位點專一性結合。DNA結合域多由60個～100/個氨基酸殘基組成的幾個亞基組成。在DNA結合域的結構基序中，鋅指結構、螺旋-突環-螺旋和亮氨酸拉鏈區最為普遺，約占已知轉錄因子的80%左右。
l.1.1 鋅指結構 鋅指結構(zinc finger motif)由大約30個氨基酸殘基組成，其中含有兩個半胱氨酸和兩個組氨酸殘基，這4個氨基酸與鋅離子絡合而形成穩定的指狀結構。非洲爪蟾中由RNA聚合酶Ⅲ催化的5 S rRNA基因轉錄的轉錄因子TFⅢA(transcription factorⅢ A)，是由344個氨基酸殘基組成的第一個被發現的鋅指蛋白。此後相繼證實許多真核轉錄因子中存在鋅指結構，但不同蛋白所含鋅指結構的數量差異很大。
1.1.2 螺旋-轉角-螺旋結構基序 螺旋-轉角-螺旋結構基序(heilix-turn-helix，HTH)最初發現於研究真核細胞降解物基因活化蛋白CAP和噬菌體Cro阻遏物的過程中，是最簡單的結構基序之一。果蠅同源異型基因編碼的同源異型域(homeodomain，HD)蛋白是真核細胞中第一個被證實的螺旋-轉角-螺旋蛋白，含HD結構的蛋白存在於從酵母到人幾乎所有的真核細胞中。
1.1.3 螺旋-突環-螺旋結構基序 螺旋-突環-螺旋型DNA結合蛋白最近年來發現的一種新型DNA結合蛋白，如上游刺激因子是一種具有螺旋-突環螺旋基元的DNA結合蛋白，最初證明是腺病毒晚期基因的轉錄因子，後來發現在其他病毒和一些真核基因中也存在該結合位點。
1.1.4 亮氨酸拉鏈結構基序 在拉鏈區的氨基酸有30個殘基的序列富含賴氨酸(1ysine，Lys)和精氨酸(arginine ,Arg)，是與DNA結合的鹼性區域。因此亮氨酸拉鏈區的作用是將其自身的一對二聚體蛋白分子拉在一起，以便結合兩個相鄰DNA序列。含亮氨酸拉鏈的轉錄因子包括AP-1、fos、Jun、C/EBP和CREB。這些蛋白都通過亮氨酸拉鏈結構形成同種或異種二聚體，產生具有不同功能的特異轉錄因子而在轉錄調控中起作用。
『柒』 轉錄抑制因子的作用方式有哪幾種
轉錄抑制區也是轉錄因子調控表達的重要位點，但是對其作用機理研究尚不深入。可能的作用方式有三種：
1)與啟動子的調控位點結合，阻止其它轉錄因子的結合;
2)作用於其它轉錄因子，抑制其它因子的作用;
3)通過改變DNA的高級結構阻止轉錄的發生。
轉錄因子必須在核內作用，才能起到調控表達的目的。因此，轉錄因子上的核定位序列是其重要的組成部分。一般一個或多個核定位序列在轉錄因子中不規則分布，同時也存在不含核定位序列的轉錄因子，它們通過結合到其它轉錄因子上進入細胞核。核定位序列一般是轉錄因子中富含精氨酸和賴氨酸殘基的區段。
轉錄因子是一種具有特殊結構、行使調控基因表達功能的蛋白質分子，也稱為反式作用因子。
植物中的轉錄因子分為二種，一種是非特異性轉錄因子，它們非選擇性地調控基因的轉錄表達，如大麥(Hordeum vulgare) 中的HvCBF2
(C-repeat/DRE binding factor 2) (Xue et al., 2003)。
還有一種稱為特異型轉錄因子，它們能夠選擇性調控某種或某些基因的轉錄表達。典型的轉錄因子含有DNA結合區(DNA-binding
domain)、轉錄調控區(activation domain)、寡聚化位點(oligomerization site) 以及核定位信號(nuclear
localization signal) 等功能區域。這些功能區域決定轉錄因子的功能和特性(Liu et al., 1999)。
DNA結合區帶共性的結構主要有：
1)HTH 和HLH
結構：由兩段α-螺旋夾一段β-折疊構成，α-螺旋與β-折疊之間通過β-轉角或成環連接，即螺旋-轉角-螺旋結構和螺旋-環-螺旋結構。
2)鋅指結構：多見於TFIII A 和類固醇激素受體中，由一段富含半胱氨酸的多肽鏈構成。每四個半光氨酸殘基或組氨酸殘基螯合一分子Zn2+
，其餘約12-13 個殘基則呈指樣突出，剛好能嵌入DNA 雙螺旋的大溝中而與之相結合。
3)亮氨酸拉鏈結構：多見於真核生物DNA 結合蛋白的C 端，與癌基因表達調控有關。由兩段α - 螺旋平行排列構成，其α - 螺旋中存在每隔7
個殘基規律性排列的亮氨酸殘基，亮氨酸側鏈交替排列而呈拉鏈狀，兩條肽鏈呈鉗狀與DNA 相結合。
同一家族的轉錄因子之間的區別主要在轉錄調控區。轉錄調控區包括轉錄激活區(transcription activation domain)
和轉錄抑制區(transcription repression domain)
二種。近年來，轉錄的激活區被深入研究。它們一般包含DNA結合區之外的30-100個氨基酸殘基，有時一個轉錄因子包含不止一個轉錄激活區。如控制植物儲藏蛋白基因表達的VP1和PvALF轉錄因子，它們的N-末端酸性氨基酸保守序列都具有轉錄激活能力，與酵母轉錄因子GCN4和病毒轉錄因子的VP16的酸性氨基酸轉錄激活區有較高同源性(Bobb
et al., 1996)。典型的植物轉錄因子激活區一般富含酸性氨基酸、脯氨酸或谷氨醯胺等，如GBF (G-box binding factor)
含有的GCB盒(GBF conserved box) 激活結構域(lunwen114 and Bevan, 1998)。
『捌』 如何研究一個轉錄因子對目的基因的調控
1.雙熒光報告實驗! 2.敲低轉錄因子基因,靶基因表達下調! 3.設計轉錄因子結合區突變體, Gel-shifting實驗!
『玖』 轉錄因子研究的基本實驗路線是什麼
主要目的是DNA/蛋白相互作用，方法有酵母雙雜交、biacore、熒光蛋白體外表達等。建議根據具體的蛋白和目的，查詢研究進展再確定方案