蛋白質組學定量分析的常用方法和儀器

① 什麼是蛋白質組學的基本技術流程

蛋白質組學的基本技術流程主要為以下四方面。 1 蛋白質標本的制備及分離:尋找較好的方法盡可能完全地抽提細胞或組織中的全部蛋白質是比較蛋白質組..

② 蛋白質組學研究不同組織蛋白質的差異 常用那些技術或軟體

蛋白質組(Proteome)的概念最先由Marc Wilkins提出，指由一個基因組或一個細胞、組織表達的所有蛋白質. 蛋白質組的概念與基因組的概念有許多差別，它隨著組織、甚至環境狀態的不同而改變. 在轉錄時，一個基因可以多種mRNA形式剪接，並且，同一蛋白可能以許多形式進行翻譯後的修飾. 故一個蛋白質組不是一個基因組的直接產物，蛋白質組中蛋白質的數目有時可以超過基因組的數目. 蛋白質組學處於早期「發育」狀態，這個領域的專家否認它是單純的方法學，就像基因組學一樣，不是一個封閉的、概念化的穩定的知識體系，而是一個領域. 蛋白質組學集中於動態描述基因調節，對基因表達的蛋白質水平進行定量的測定，作為一門科學，蛋白質組研究並非從零開始，它是已有20多年歷史的蛋白質(多肽)譜和基因產物圖譜技術的一種延伸. 多肽圖譜依靠雙向電泳(Two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)和進一步的圖象分析；而基因產物圖譜依靠多種分離後的分析，如質譜技術、氨基酸組分分析等.
蛋白質組學研究內容
主要有兩方面，一是結構蛋白質組學，二是功能蛋白質組學。其研究前沿大致分為三個方面：
① 針對有關基因組或轉錄組資料庫的生物體或組織細胞，建立其蛋白質組或亞蛋白質組及其蛋白質組連鎖群，即組成性蛋白質組學。
② 以重要生命過程或人類重大疾病為對象，進行重要生理病理體系或過程的局部蛋白質組或比較蛋白質組學。
③ 通過多種先進技術研究蛋白質之間的相互作用，繪制某個體系的蛋白，即相互作用蛋白質組學，又稱為「細胞圖譜」蛋白質組學。

③ 蛋白質組學主要包括哪些分析技術及各自特點

雙向凝膠電泳
雙向凝膠電泳的原理是第一向基於蛋白質的等電點不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離，把復雜蛋白混合物中的蛋白質在二維平面上分開。由於雙向電泳技術在蛋白質組與醫學研究中所處的重要位置，它可用於蛋白質轉錄及轉錄後修飾研究，蛋白質組的比較和蛋白質間的相互作用，細胞分化凋亡研究，致病機制及耐葯機制的研究，療效監測，新葯開發，癌症研究，蛋白純度檢查，小量蛋白純化，新替代疫苗的研製等許多方面。近年來經過多方面改進已成為研究蛋白質組的最有使用價值的核心方法。

等電聚焦
等電聚焦（isoelectric focusing，IEF）是60年代中期問世的一種利用有pH梯度的介質分離等電點不同的蛋白質的電泳技術。等電聚焦凝膠電泳依據蛋白質分子的靜電荷或等電點進行分離，等電聚焦中，蛋白質分子在含有載體兩性電解質形成的一個連續而穩定的線性pH梯度中電泳。載體兩性電解質是脂肪族多氨基多羧酸，在電場中形成正極為酸性，負極為鹼性的連續的pH梯度。蛋白質分子在偏離其等電點的pH條件下帶有電荷，因此可以在電場中移動；當蛋白質遷移至其等電點位置時，其靜電荷數為零，在電場中不再移動，據此將蛋白質分離。

生物質譜
生物質譜技術是蛋白質組學研究中最重要的鑒定技術，其基本原理是樣品分子離子化後，根據不同離子之間的荷質比（M/E）的差異來分離並確定分子量。對於經過雙向電泳分離的目標蛋白質用胰蛋白酶酶解（水解Lys或Arg的-C端形成的肽鍵）成肽段，對這些肽段用質譜進行鑒定與分析。目前常用的質譜包括兩種：基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）和電噴霧質譜（ESI- MS）。

飛行時間質譜
MALDI 的電離方式是 Karas和Hillenkamp於1988年提出。MALDI的基本原理是將分析物分散在基質分子（尼古丁酸及其同系物）中並形成晶體，當用激光（337nm的氮激光）照射晶體時，基質分子吸收激光能量，樣品解吸附，基質-樣品之間發生電荷轉移使樣品分子電離。它從固相標本中產生離子，並在飛行管中測定其分子量，MALDI-TOF-MS一般用於肽質量指紋圖譜，非常快速（每次分析只需3~5min），靈敏（達到fmol水平），可以精確測量肽段質量，但是如果在分析前不修飾肽段，MALDI-TOF-MS不能給出肽片段的序列。

電噴霧質譜（ESI-MS）
ESI- MS是利用高電場使質譜進樣端的毛細管柱流出的液滴帶電，在N2氣流的作用下，液滴溶劑蒸發，表面積縮小，表面電荷密度不斷增加，直至產生的庫侖力與液滴表面張力達到雷利極限，液滴爆裂為帶電的子液滴，這一過程不斷重復使最終的液滴非常細小呈噴霧狀，這時液滴表面的電場非常強大，使分析物離子化並以帶單電荷或多電荷的離子形式進入質量分析器。ESI-MS從液相中產生離子，一般說來，肽段的混合物經過液相色譜分離後，經過偶聯的與在線連接的離子阱質譜分析，給出肽片段的精確的氨基酸序列,但是 分析時間一般較長。 目前，許多實驗室兩種質譜方法連用，獲得有意義的蛋白質的肽段序列，設計探針或引物來獲得有意義的基因。隨著蛋白質組研究的深入，又有多種新型質譜儀出現，主要是在上述質譜儀的基礎上進行改進與重新組合。

④ 蛋白質組學常用的研究方法

酵母雙雜交系統、抗體晶元、LCM技術、mic Solution Inc、SPR技術、色譜分離技術、雙相電泳技術、有機質譜等等。
LCM技術獲得的細胞可以用於蛋白質樣品的制備。
蛋白質樣品中的不同類型的蛋白質可以通過二維電泳進行分離。
膠染色後可以利用凝膠圖象分析系統成像，然後通過分析軟體對蛋白質點進行定量分析，並且對感興趣的蛋白質點進行定位。
Genomic Solution可以為研究者提供除質譜外的所有蛋白質組學研究工具，包括二維電泳系統，成像系統及分析軟體，膠切割系統，蛋白質消化濃縮工作站，點樣工作站等；同時還可以提供相關試劑和消耗品。
蛋白質相互作用的研究，酵母雙雜交和噬菌體展示技術無疑是很好的研究方法。
LCM-二維電泳-質譜的技術路線是典型的一條蛋白質組學研究的技術路線，除此以外，LCM-抗體晶元也是一條重要的蛋白質組學研究的技術路線。

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⑤ 基因組和蛋白質組之間的關系，企業常用的分析蛋白質組的方法有哪些

組學omics,研究的是整體.按照分析目標不同主要分為基因組學,轉錄組學,蛋白質組學,代謝組學.基因組學研究的主要是基因組DNA,使用方法目前以二代測序為主,將基因組拆成小片段後再用生物信息學演算法進行迭代組裝.當然這僅僅是第一步,隨後還有繁瑣的基因注釋等數據分析工作.轉錄組學研究的是某個時間點的mRNA總和,可以用晶元,也可以用測序.晶元是用已知的基因探針,測序則有可能發現新的mRNA,蛋白組學針對的是全體蛋白,組要以2D-Gel和質譜為主,分為top-down和bottom-up分析方法.理念和基因組類似,將蛋白用特定的物料化學手段分解成小肽段,在通過質量反推蛋白序列,最後進行搜索,標識已知未知的蛋白序列.代謝組分析的代謝產物,是大分子和小分子的混合物,主要也是用液相和質譜.總而言之,這些技術都想從全局找變數,都是一種top-down的研究方法,原因很簡單：避免『只緣身在此山中』的尷尬.但因為技術局限,都各有缺點,尤其是轉錄組和蛋白組數據,基本上顛覆了以前一直認為的mRNA水平能代表蛋白水平的觀念,因為這兩組數據的重合度太低.所以目前很多研究都開始使用交叉驗證方法.

⑥ 關於蛋白質組學檢測結果分析求助

1.蛋白質鑒定：可以利用一維電泳和二維電泳並結合Western等技術，利用蛋白質晶元和抗體晶元及免疫共沉澱等技術對蛋白質進行鑒定研究。
2.翻譯後修飾：很多mRNA表達產生的蛋白質要經歷翻譯後修飾如磷酸化，糖基化，酶原激活等。翻譯後修飾是蛋白質調節功能的重要方式，因此對蛋白質翻譯後修飾的研究對闡明蛋白質的功能具有重要作用。
3.蛋白質功能確定：如分析酶活性和確定酶底物，細胞因子的生物分析/配基-受體結合分析。可以利用基因敲除和反義技術分析基因表達產物-蛋白質的功能。另外對蛋白質表達出來後在細胞內的定位研究也在一定程度上有助於蛋白質功能的了解。Clontech的熒光蛋白表達系統就是研究蛋白質在細胞內定位的一個很好的工具。
4.對人類而言，蛋白質組學的研究最終要服務於人類的健康，主要指促進分子醫學的發展。如尋找葯物的靶分子。很多葯物本身就是蛋白質，而很多葯物的靶分子也是蛋白質。葯物也可以干預蛋白質-蛋白質相互作用。
在基礎醫學和疾病機理研究中，了解人不同發育、生長期和不同生理、病理條件下及不同細胞類型的基因表達的特點具有特別重要的意義。這些研究可能找到直接與特定生理或病理狀態相關的分子，進一步為設計作用於特定靶分子的葯物奠定基礎。 不同發育、生長期和不同生理、病理條件下不同的細胞類型的基因表達是不一致的，因此對蛋白質表達的研究應該精確到細胞甚至亞細胞水平。可以利用免疫組織化學技術達到這個目的，但該技術的致命缺點是通量低。激光捕獲顯微切割LCM(Laser Capture Microdissection)技術可以精確地從組織切片中取出研究者感興趣的細胞類型，因此LCM技術實際上是一種原位技術。取出的細胞用於蛋白質樣品的制備，結合抗體晶元或二維電泳-質譜的技術路線，可以對蛋白質的表達進行原位的高通量的研究。很多研究採用勻漿組織制備蛋白質樣品的技術路線，其研究結論值得懷疑，因為組織勻漿後不同細胞類型的蛋白質混雜在一起，最後得到的研究數據根本無法解釋蛋白質在每類細胞中的表達情況。雖然培養細胞可以得到單一類型細胞，但體外培養的細胞很難模擬體內細胞的環境，因此這樣研究得出的結論也很難用於解釋在體實際情況。因此在研究中首先應該將不同細胞類型分離，分離出來的不同類型細胞可以用於基因表達研究，包括mRNA和蛋白質的表達。
LCM技術獲得的細胞可以用於蛋白質樣品的制備。可以根據需要制備總蛋白，或膜蛋白，或核蛋白等，也可以富集糖蛋白，或通過去除白蛋白來減少蛋白質類型的復雜程度。相關試劑盒均有廠商提供。 蛋白質樣品中的不同類型的蛋白質可以通過二維電泳進行分離。二維電泳可以將不同種類的蛋白質按照等電點和分子量差異進行高解析度的分離。成功的二維電泳可以將2000到3000種蛋白質進行分離。電泳後對膠進行高靈敏度的染色如銀染和熒光染色。如果是比較兩種樣品之間蛋白質表達的異同，可以在同樣條件下分別制備二者的蛋白質樣品，然後在同樣條件下進行二維電泳，染色後比較兩塊膠。也可以將二者的蛋白質樣品分別用不同的熒光染料標記，然後兩種蛋白質樣品在一塊膠上進行二維電泳的分離，最後通過熒光掃描技術分析結果。
膠染色後可以利用凝膠圖像分析系統成像，然後通過分析軟體對蛋白質點進行定量分析，並且對感興趣的蛋白質點進行定位。通過專門的蛋白質點切割系統，可以將蛋白質點所在的膠區域進行精確切割。接著對膠中蛋白質進行酶切消化，酶切後的消化物經脫鹽/濃縮處理後就可以通過點樣系統將蛋白質點樣到特定的材料的表面（MALDI-TOF）。最後這些蛋白質就可以在質譜系統中進行分析，從而得到蛋白質的定性數據;這些數據可以用於構建資料庫或和已有的資料庫進行比較分析。
LCM-二維電泳-質譜的技術路線是典型的一條蛋白質組學研究的技術路線，除此以外，LCM-抗體晶元也是一條重要的蛋白質組學研究的技術路線。即通過LCM技術獲得感興趣的細胞類型，制備細胞蛋白質樣品，蛋白質經熒光染料標記後和抗體晶元雜交，從而可以比較兩種樣品蛋白質表達的異同。Clontech最近開發了一張抗體晶元，可以對378種膜蛋白和胞漿蛋白進行分析。該晶元同時配合了抗體晶元的全部操作過程的重要試劑，包括蛋白質制備試劑，蛋白質的熒光染料標記試劑，標記體系的純化試劑，雜交試劑等。
對於蛋白質相互作用的研究，酵母雙雜交和噬菌體展示技術無疑是很好的研究方法。Clontech開發的酵母雙雜交系統和NEB公司開發的噬菌體展示技術可供研究者選用。
關於蛋白質組的研究，也可以將蛋白質組的部分或全部種類的蛋白質製作成蛋白質晶元，這樣的蛋白質晶元可以用於蛋白質相互作用研究，蛋白表達研究和小分子蛋白結合研究。 Science，Vol. 293，Issue 5537，2101-2105，September 14，2001發表了一篇關於酵母蛋白質組晶元的論文。該文主要研究內容為：將酵母的5800個ORF表達成蛋白質並進行純化點樣製作晶元，然後用該晶元篩選鈣調素和磷脂分子的相互作用分子。
最後有必要指出的是，傳統的蛋白質研究注重研究單一蛋白質，而蛋白質組學注重研究參與特定生理或病理狀態的所有的蛋白質種類及其與周圍環境(分子)的關系。因此蛋白質組學的研究通常是高通量的。適應這個要求，蛋白質組學相關研究工具通常都是高度自動化的系統，通量高而速度快，配合相應分析軟體和資料庫，研究者可以在最短的時間內處理最多的數據

⑦ 蛋白質組組學研究的基本策略是什麼

蛋白質組 蛋白質組(Proteome)的概念最先由Marc Wilkins提出，指由一個基因組(genOME)，或一個細胞、組織表達的所有蛋白質(PROTein). 蛋白質組的概念與基因組的概念有許多差別，它隨著組織、甚至環境狀態的不同而改變. 在轉錄時，一個基因可以多種mRNA形式剪接，並且，同一蛋白可能以許多形式進行翻譯後的修飾. 故一個蛋白質組不是一個基因組的直接產物，蛋白質組中蛋白質的數目有時可以超過基因組的數目. 蛋白質組學(Proteomics)處於早期「發育」狀態，這個領域的專家否認它是單純的方法學，就像基因組學一樣，不是一個封閉的、概念化的穩定的知識體系，而是一個領域. 蛋白質組學集中於動態描述基因調節，對基因表達的蛋白質水平進行定量的測定，鑒定疾病、葯物對生命過程的影響，以及解釋基因表達調控的機制. 作為一門科學，蛋白質組研究並非從零開始，它是已有20多年歷史的蛋白質(多肽)譜和基因產物圖譜技術的一種延伸. 多肽圖譜依靠雙向電泳(Two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)和進一步的圖象分析；而基因產物圖譜依靠多種分離後的分析，如質譜技術、氨基酸組分分析等.
[編輯本段]蛋白質組學的研究內容
主要有兩方面，一是結構蛋白質組學，二是功能蛋白質組學。其研究前沿大致分為三個方面：
① 針對有關基因組或轉錄組資料庫的生物體或組織細胞，建立其蛋白質組或亞蛋白質組及其蛋白質組連鎖群，即組成性蛋白質組學。
② 以重要生命過程或人類重大疾病為對象，進行重要生理病理體系或過程的局部蛋白質組或比較蛋白質組學。
③ 通過多種先進技術研究蛋白質之間的相互作用，繪制某個體系的蛋白，即相互作用蛋白質組學，又稱為「細胞圖譜」蛋白質組學。
此外，隨著蛋白質組學研究的深入，又出現了一些新的研究方向，如亞細胞蛋白質組學、定量蛋白質組學等。
[編輯本段]蛋白質組學研究中的主要技術
1 雙向凝膠電泳技術(2-DE)
雙向凝膠電泳技術與質譜技術是目前應用最為廣泛的研究蛋白質組學的方法。雙向凝膠電泳技術利用蛋白質的等電點和分子量差別將各種蛋白質區分開來。雖然二維凝膠電泳難以辨別低豐度蛋白，對操作要求也較高，但其通量高、解析度和重復性好以及可與質譜聯用的特點，使其成為目前最流行、可靠的蛋白質組研究手段。雙向凝膠電泳技術及質譜基礎的蛋白質組學研究程序為樣品制備→等電聚焦→聚丙烯醯胺凝膠電泳→凝膠染色→挖取感興趣的蛋白質點→膠內酶切→質譜分析確定肽指紋圖譜或部分氨基酸序列→利用資料庫確定蛋白。蛋白質組研究要求有高解析度的蛋白質分離及准確、靈敏的質譜鑒定技術。凝膠電泳中蛋白質的著色不僅影響蛋白質分離的解析度，同時也影響後續的質譜鑒定。蛋白質的染色可分為有機試劑染色、銀染、熒光染色及同位素顯色四類。
Unlu 等提出了一種熒光差異顯示雙向電泳(F-2D-DIGE)的定量蛋白質組學分析方法。差異凝膠電泳(DIGE)是對2-DE 在技術上的改進，結合了多重熒光分析的方法，在同一塊膠上共同分離多個分別由不同熒游標記的樣品，並第一次引入了內標的概念。兩種樣品中的蛋白質採用不同的熒游標記後混合，進行2-DE，用來檢測蛋白質在兩種樣品中表達情況，極大地提高了結果的准確性、可靠性和可重復性。在DIGE技術中，每個蛋白點都有它自己的內標，並且軟體可全自動根據每個蛋白點的內標對其表達量進行校準，保證所檢測到的蛋白豐度變化是真實的。DIGE 技術已經在各種樣品中得到應用。
2 高效液相色譜技術(HPLC)
盡管二維凝膠電泳（2-DE）是目前常用的對全蛋白組的分析方法，但其存在分離能力有限、存在歧視效應、操作程序復雜等缺陷。對於分析動態范圍大、低豐度以及疏水性蛋白質的研究往往很難得到滿意的結果。Chong 等使用HPLC/ 質譜比較分析惡性腫瘤前和癌症兩種蛋白質差異表達。利用HPLC 分離蛋白質，並用MALDI-TOF-MS 鑒定收集的組分，從而在兩種細胞中的差異表達中對蛋白質進行定量分析。多維液相色譜作為一種新型分離技術，不存在相對分子質量和等電點的限制，通過不同模式的組合，消除了二維凝膠電泳的歧視效應，具有峰容量高、便於自動化等特點。二維離子交換- 反相色譜(2D-IEC-RPLC)是蛋白質組學研究中最常用的多維液相色譜分離系統。
3 表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜(SEL-DI)技術
表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜技術於2002 年由諾貝爾化學獎得主田中發明，剛剛產生便引起學術界的高度重視。SELDI 技術是目前蛋白質組學研究中比較理想的技術平台，其全稱是表面增強激光解吸電離飛行時間質譜技術(SELDI-tof)。其方法主要如下：通常情況下將樣品經過簡單的預處理後直接滴加到表面經過特殊修飾的晶元上，既可比較兩個樣品之間的差異蛋白，也可獲得樣品的蛋白質總覽。因此，在應用方面具有顯著優勢。SELDI 技術分析的樣品不需用液相色譜或氣相色譜預先純化，因此可用於分析復雜的生物樣品。SELDI 技術可以分析疏水性蛋白質，PI 過高或過低的蛋白質以及低分子質量的蛋白質( < 25 000) ，還可以發現在未經處理的樣品中許多被掩蓋的低濃度蛋白質，增加發現生物標志物的機會。SELDI 技術只需少量樣品，在較短時間內就可以得到結果，且試驗重復性好，適合臨床診斷及大規模篩選與疾病相關的生物標志物，特別是它可直接檢測不經處理的尿液、血液、腦脊液、關節腔滑液、支氣管洗出液、細胞裂解液和各種分泌物等， 從而可檢測到樣品中目標蛋白質的分子量、PI、糖基化位點、磷酸化位點等參數。
4 同位素標記親和標簽(ICAT)技術
同位素親和標簽技術是近年發展起來的一種用於蛋白質分離分析技術，此技術目前是蛋白質組研究技術中的核心技術之一。該技術用具有不同質量的同位素親和標簽( ICATs) 標記處於不同狀態下的細胞中的半胱氨酸，利用串聯質譜技術，對混合的樣品進行質譜分析。來自兩個樣品中的同一類蛋白質會形成易於辨識比較的兩個不同的峰形，能非常准確的比較出兩份樣品蛋白質表達水平的不同。ICAT 的好處在於它可以對混合樣品直接測試；能夠快速定性和定量鑒定低豐度蛋白質，尤其是膜蛋白等疏水性蛋白等；還可以快速找出重要功能蛋白質。
由於採用了一種全新的ICAT 試劑，同時結合了液相色譜和串聯質譜，因此不但明顯彌補了雙向電泳技術的不足，同時還使高通量、自動化蛋白質組分析更趨簡單、准確和快速，代表著蛋白質組分析技術的主要發展方向。針對磷酸化蛋白分析以及與固相技術相結合ICAT 技術本身又取得了許多有意義的進展，已形成ICA T 系列技術。用具有不同質量的同位素親和標簽( ICATs) 標記處於不同狀態下的細胞中的半胱氨酸，利用串聯質譜技術，可對混合的樣品進行質譜分析。
5 生物信息學
近年來，生物信息學在生命科學研究中起著越來越重要的作用。利用生物信息學對蛋白質組的各種數據進行處理和分析，也是蛋白質組研究的重要內容。生物信息學是蛋白質組學研究中不可缺少的一部分。生物信息學的發展，已不僅是單純的對基因組、蛋白質組數據的分析，而且可以對已知的或新的基因產物進行全面分析。在蛋白質組資料庫中儲存了有機體、組織或細胞所表達的全部蛋白質信息，通過用滑鼠點擊雙向凝膠電泳圖譜上的蛋白質點就可獲得
如蛋白質鑒定結果、蛋白質的亞細胞定位、蛋白質在不同條件下的表達水平等信息。目前應用最普遍的資料庫是NRDB 和dbEST 資料庫。NRDB 由SWISS2PROT 和GENPETP 等幾個資料庫組成，dbEST是由美國國家生物技術信息中心（NCBI）和 歐洲生物信息學研究所(EBI)共同編輯的核酸資料庫；計算機分析軟體主要有蛋白質雙向電泳圖譜分析軟體、蛋白質鑒定軟體、蛋白質結構和功能預測軟體等。

⑧ 蛋白質組學樣品前處理的方法

要回答這個問題，首先需要理解樣品前處理需要達到的目的：減少人為降解和修飾，並且盡量多的釋放肽段。

整個過程可以分為以下流程：先從組織、體液或細胞中提取蛋白質，拿到蛋白混合溶液（根據你的研究目的，可以對蛋白先做分離，或者不分離），接下來還原烷基化（還原的過程是將蛋白的二硫鍵打開，然後烷基化可以修飾巰基，防止游離的巰基再生成二硫鍵）處理，並酶解成肽段。

1，樣品的收集與保存

組織樣品

1) 對於人體手術切除的組織，有條件的話，最好用PBS（磷酸緩沖鹽溶液，作為溶劑，起溶解保護試劑的作用）取完之後直接去血。如果沒有去血，可以-80℃液氮保存，乾冰運輸。

2）對於小鼠、大鼠、兔子之類的組織樣品，建議用灌流的方式來去血，尤其是像肝臟、胃、心臟這類大的組織，可以直接用灌流的方式去血，去得最干凈。其次的方案是在後期剪碎的時候去血。

細胞樣品

常規實驗，建議收到5*1E6~1E7個細胞以上的樣品量（有些實驗需要的樣品量會少一些，後面會詳細講）。細胞取好後，首先用PBS清洗一下細胞表面，因為大部分培養基裡面都含有血清，這部分血清得洗干凈了先~

如果是做分泌蛋白研究的話，首先用PBS清洗樣品幾次，再用條件培養基（不含有血清的培養基）進行培養，根據細胞情況，大概12個小時以後，離心，去掉細胞碎片，取上清，就能提取到分泌蛋白了。

血清樣品

1）血漿樣品：可以通過醫院常用的EDTA抗凝管進行收集，收集到的血漿會呈懸浮狀態，離心去掉血細胞。

2）血清樣品：現在大部分研究都直接針對血清樣品，它的成份更簡單，沒有凝集素，沒有大量的血細胞，針對性會更強。收集血清樣品時，直接把血清吸到管子里，室溫靜置讓它凝結，上清黃色部分就是血清樣品啦。
2，研磨或超聲破碎樣品，為了減少人為操作引入的修飾，通常會准備大量的冰，進行冰上的操作。同時還需要加入蛋白酶抑制劑，防止在操作過程中蛋白被樣品中自帶的蛋白酶降解掉。

3，充分熔接蛋白質，如果蛋白沒有充分溶解，能提取到的蛋白就會很少，達不到研究目的。

4，充分解旋蛋白質，通常，蛋白質都是成球狀的穩定狀態，解旋蛋白質就是將球狀蛋白中的二硫鍵打開，讓它形成鏈狀結構，以便進行下一步酶切。

5，酶解蛋白質，一般會用多種酶對蛋白質進行酶解。

6，去除雜質，我們要知道，質譜是一個非常靈敏的儀器，它檢測的是多肽的質荷比。所有的鹽類，以及所有會進行離子化的雜質，都會干擾到肽段的檢測。所以我們會要求進入質譜之前的蛋白樣品非常干凈。在蛋白水平及肽段水平都會進行去除雜質的步驟。

更詳細的，下次再聊~

⑨ 蛋白質組學的研究手段有哪些原來這里已經有回答了，還不滿意，希望詳盡點。

一 雙向電泳。雙向電泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)與質譜(mass spectrum, MS)的結合是最常見的蛋白質組學的研究手段。雙向電泳包括第一向等電聚焦(Isoelectric focusing, IEF)和第二向SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)。雙向電泳可以提供包含有分子量和等電點信息的二維圖譜
二 多維色譜法。在多維色譜法中，蛋白樣品通常先被消化成肽段，然後經過離子交換、反相HPLC(high-performance liquid chromatography)而被分離。該方法的中HPLC可以直接和質譜偶聯，可有效的分析極酸或極鹼、高度疏水等傳統2-DE方法難以分析的蛋白質，而且易於實現分析的自動化。
三 熒光差異凝膠電泳技術(differential in-gel electrophoresis, DIGE)。DIGE可用三種不同的熒光染料來分別對樣品進行標記，熒光染料可以通過醯胺鍵與蛋白質的賴氨酸ε-氨基共價結合。將標記的樣品混合然後在同一塊雙向電泳凝膠上分離。這樣在一塊雙向電泳凝膠上可獲得三幅圖像，即在一塊凝膠內分析不同的蛋白樣品。DIGE有效地改善了傳統2-DE的重復性。
四 定量蛋白質組學方法：
⑴ ICAT(isotope-coded affinity tags)方法。ICAT是用於定量蛋白質組學研究的穩定同位素標簽法的一種。在穩定同位素標簽法中，質譜可以通過識別標記的肽段和未標記的肽段之間的信號強度差異來達到定量的目的。在ICAT方法中，帶有生物素半分子的同位素標簽對樣品中蛋白質的半胱氨酸殘基進行標記，標記的蛋白樣品經過消化成為肽段後，經陽離子交換色譜和親和素親和純化，然後進入質譜鑒定。相同肽段在質譜上會表現為雙峰，峰的強度直接反應了該肽段對應的蛋白質在兩種樣品中的相對強度。ICAT的缺點是無法標記缺乏半胱氨酸殘基的蛋白質、會丟失轉錄後修飾信息、相同肽段由於標記上的差異在HPLC中會產生不一致的洗脫表現以及增加的生物素基團會增加質譜解析的復雜性[47][48]。

⑵ cICAT (cleavable isotope-coded affinity tags)。也是穩定同位素標簽法，基於ICAT。cICAT採用了13C和酸性可裂解生物素而克服了ICAT的部分缺點。

⑶ iTRAQ 。iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)法可同時分析多達四個不同樣品的，該方法不會丟失轉錄後修飾信息，因而可以用於信號轉導中的蛋白質磷酸化修飾的研究。

⑩ 測定蛋白質分子量的常用方法

蛋白定量的測試方法有很多種，其中較為常見的有五種，分別是Bradford法、Bradford斑點試驗、Coomassie 斑點試驗、紫外分光度檢測法及BCA法這五種。

在生化實驗中，對樣品中的蛋白質進行准確可靠的定量分析，是經常進行的一項非常重要的工作。蛋白質是一種十分重要的生物大分子，它的種類很多，結構不均一，分子量又相差很大，功能各異，這樣就給建立一個理想而又通用的蛋白質定量分析的方法帶來了許多具體的因難。

(10)蛋白質組學定量分析的常用方法和儀器擴展閱讀

蛋白定量分析也就涉及到生產科研的多個領域及行業，也是生物學科、食品檢驗及摻假摻偽、臨床檢驗、診斷疾病和質量檢驗中最常見的方法。

蛋白定量是生物學實驗不可缺少的一部分。為驗證細胞裂解是否成功，或為了將多個樣品進行平行實驗比較或標准化保存，需對細胞裂解液進行蛋白定量。

為了判定蛋白的產量，需對純化好的蛋白進行定量。為了將純化好的蛋白用生物素或者報告酶進行標記，同樣需首先對蛋白樣品進行定量，以保證標記反應在適當的化學濃度下進行。