基因表達研究方法

A. 研究基因表達的方法

真核基因表達研究方法與應用

1、基因敲除技術 (Gene Knockout)

注意事項：
（1）、有合適的胚胎幹細胞（embryonic stem cells）；
（2）、有已知的單拷貝基因位點；
（3）、用線性載體或不能自我復制的載體。

2.蛋白質相互作用（Pull-down assay）Science, 289:1550-1554 (2000)

NFkB基因表達後導致細胞炎症，而NFkB基因的活化受炎症誘發因子的刺激。IKKα、IKKβ及NEMO（NFkB-essential modifier）抑制NFkB基因的表達。

3、導彈葯物--葯物導向治療

腫瘤或癌細胞表面通常過量表達某些特徵性蛋白質（如人乳腺癌細胞表面的28 kD 蛋白），可作為腫瘤導向治療的作用靶。將抗體的某些部分與外毒素相連接，就可以把毒素直接送到病變細胞表面，有效地殺死病變細胞，保護健康細胞。

B. 如何開展基因表達研究

摘要：眾所周知，在不同的情況下，在不同的組織中，基因表達的水平也不同。如今，研究人員可利用多種技術來追蹤基因表達水平的差異，如定量PCR、晶元或測序。對於這些技術平台，如何選擇？如何開展數據分析和驗證？且看看專家的回答。

眾所周知，在不同的情況下，在不同的組織中，基因表達的水平也不同。如今，研究人員可利用多種技術來追蹤基因表達水平的差異，如定量PCR、晶元或測序。《Genome Technology》雜志這一次請來了幾位科學家，讓他們分享一下應如何選擇這些技術。此外，研究人員也談到了解決質量控制和數據分析的問題，以及如何驗證基因表達研究的發現。

Q1：您如何評估哪種方法（晶元、定量PCR或測序）最適合基因表達研究？

Gary Hardiman（加州大學聖地亞哥分校）
答案在很大程度上取決於研究的目的。傳統的qPCR最適合於少量目標和大量樣品。晶元和RNA-seq最適合於整體的轉錄譜分析。晶元和RNA-seq之間的選擇在於成本、數據處理的輕松程度以及檢測靈敏度。
晶元實驗的優勢在於它們很快，相對廉價，且數據存儲和處理較為輕松。在很短的時間內可生成兩個樣品之間差異表達基因的列表，並用於指導通路、基因本體、網路/互作組的分析，為兩個樣品之間的生物學差異提供線索。這也可以通過測序來實現，但過程稍微復雜一些。如果要研究選擇性剪接，那麼無疑要選擇測序。
晶元也面臨一些問題，包括近緣物種的交叉雜交，雜交動力學不好以及低豐度轉錄本的靈敏度差，無法區別目的基因和假基因。這些都會導致噪音數據。
商業化的晶元的缺點在於不能「與時俱進」，依賴於12個月或之前的基因組版本，有時注釋也不是最新的。這可能導致探針內容不再相關。此外，晶元也可能漏掉與特定研究相關的重要探針。人和小鼠的基因組晶元不會有很大的問題，但其他物種（如斑馬魚）可能會。
高通量測序則沒有以上這些限制。最終結果是一系列序列標簽，可定位到轉錄本上。測序是一個有序的過程，不存在晶元技術所固有的噪音，因此產生很少量真正的hits。而另一方面，晶元依賴結合的能量學，而少量轉錄本會被非特異雜交所沖垮，因此未檢測到。
大規模並行測序無疑將取代DNA晶元技術，來監控轉錄組的變化。然而，這些實驗的成本以及分析實驗的計算機要求讓測序不如晶元技術那麼普及，但隨著測序儀產量更高，智能條形碼的實施以及可靠分析工具的出現，這將迅速改變。也就是說，如果現在要發現兩個樣品之間差異表達的基因，我還是會選晶元。

C. 基因表達量的研究方法

差異基因表達的研究受到了廣泛的關注，常用的技術有DD-PCR；GENE-FISHING；GENE CHIP等。簡單介紹如下：

DDRT—PCR技術即mRNA差異顯示聚合酶鏈式反應技術，此技術是以PCR技術和聚丙烯凝膠電泳技術為基礎，結合銀染或放射性自顯影等顯色技術，能快速有效地鑒定並克隆兩個或多個平行材料之間的差異表達基因。DDRT—PCR技術的基本過程如下：
①提取兩組平行材料中的總RNA或mRNA；
②在逆轉錄酶作用下，以Oligo dT12MN為錨定引物將mRNA反轉錄成cDNA；
③ 以cDNA為模板利用10一mer隨機引物和錨定引物進行PCR擴增；
④ 聚丙烯醯胺凝膠電泳分離PCR擴增產物，結合銀染等顯色方法獲得平行材料間的差異cDNA片段，回收並再擴增差異片段；
⑤Northern blotting檢測差異cDNA片段是否為陽性片段；
⑥克隆cDNA片段並測序；
⑦ 根據測序結果篩選cDNA文庫或使用RACE技術獲得cDNA片段側翼序列，進而獲得其全長cDNA基因。

GeneFishing技術用來檢測不同樣品間的表達差異。該技術著眼於解決目前用來檢測基因表達差異的方法所面臨的問題，如晶元技術和差異顯示技術。該技術的實驗包括以下三個步驟，反轉錄PCR (RT) 和兩步法PCR (GeneFishing PCR)。
第一步: 用dT-ACP1引物合成cDNAs的第一鏈。dT-ACP1引物的3′端與mRNA的多聚A互補。這樣第一鏈cDNA包含了dT-ACP1引物 5%26acute;端的通用序列。
第二步: 把第一步得到的第一鏈cDNA稀釋後和隨機ACP及dT-ACP2一起加到PCR管。隨機ACP引物的3′端序列能有效的結合到第一鏈cDNA的某一部位。在第一步PCR時，通過控制條件只能使隨機ACP的3′端特異的結合到第一鏈cDNA的特定位置，而阻止dT-ACP2的3′端退火結合到第一鏈cDNA。通過第一步PCR合成第二鏈cDNA，其3′端包含了dT-ACP1通用序列的互補序列，而其5′端包含了隨機ACP的通用序列。第三步: 來自第二步的PCR管的混合物在更嚴格條件下進行第二步PCR，這時使dT-ACP2和隨機ACP能各自退火結合到第二步得到雙鏈cDNA的3′ 端和5′端。既然第二鏈cDNA的3′端序列與隨機ACP引物的通用序列互補，而其5′端與dT-ACP2的通用序列互補，這樣保證了只擴增目標產物。該技術特點如下
(1) 無假陽性。GeneFishing技術鑒別的差異表達基因均可通過Northern Blot分析或RT-PCR證實！現有的DEG檢測方法，例如生物晶元和差異顯示技術的主要瓶頸就是假陽性的存在。無假陽性可以使研究者能快速辨別可信的差異表達基因。
(2) 無需PAGE（聚丙烯醯胺凝膠），瓊脂凝膠法即足夠。退火控制引物(ACP)極大地提高了PCR擴增的特異度和靈敏度，從而產生特異PCR產物。而且，GeneFishing 技術只需要少量的起始物質。PCR產物可以在標準的溴化乙啶染色的瓊脂凝膠中被檢測，因而省去了使用PAGE（聚丙烯醯胺凝膠）的繁瑣處理步驟。使用GeneFishing 技術在瓊脂凝膠中產生的條帶具有足夠濃度，可以被Northern Blot方法檢測。
(3) 無需昂貴的檢測方法。放射性/熒光檢測方法由於其成本和危險性而不能廣泛應用。昂貴的檢測方法是現今差別表達基因檢測的另一缺點。因此，可以使用標准溴化乙啶染色的瓊脂凝膠來進行檢測是GeneFishing 技術的一個主要優勢。
(4) 重復性保證。GeneFishing技術的所需反應試劑均由試劑盒提供。這樣防止了由於使用舊的，不匹配的試劑而帶來的變化，確保了可靠的重復性。
(5) 無需特殊技術。GeneFishing 技術是一種以PCR技術為基礎的創新方法，簡單易用。
(6) 快速經濟。GeneFishing技術使得研究者可以在5小時內確認有效的差異表達基因，不必因為假陽性而浪費時間。相比之下，所有其他DEG篩選方法都需要大量的後續工作和時間來鑒別有效的差異表達基因。
(7) 大范圍的PCR產物。每一個GeneFishing PCR反應產生從150bp至2kb長度范圍的PCR產物，這不僅提高了鑒別差異表達基因的機會，還為預測基因功能提供了更多的有效序列信息。

基因晶元技術的原理類似我們日常所說的計算機晶元，只是在固體基質上的不是集成著各種半導體管，而是成千上萬的基因探針，待分析的樣品通過和晶元中已知序列的DNA片段鹼基互補雜交，經過計算機的分析，從而確定待測核酸序列和性質，表現出基因表達量和一些序列本身的特性。該技術主要包括四個環節：晶元微列陣制備，樣品制備，生物分子反應和信號的檢測分析。目前的制備方法主要是採用表面化學的方法或是組合化學的方法來處理固相基質，如玻璃片或矽片。在固體材料中刻出微濾柵、微通道，並加上微泵、微閥來控制流體。然後將探針以預先設計的順序固定在固體基質上。微列陣制備技術主要有兩種基本方法：原位合成法和點樣法。
以上三項技術比較如下：

發現新基因

假陽性

PCR產物長度

檢測方法

重復性

GeneFishing

能

沒有

達到2kb

瓊脂糖凝膠

高

Gene Chip

否

高

N/A

熒光

低

DD-PCR

否

高

100-500bp

熒光或放射

低
參考資料：試驗方案

D. 基因表達調控研究中主要實驗技術有哪些

基因表達調控主要實驗技術有：ChIP、RIP、RNA pull-down、EMSA、Luciferase
1、 ChIP實驗
通過與染色質片段共沉澱和PCR技術，在體內檢測與特異蛋白質結合的DNA片段。將處於適當生長時期的活細胞用甲醛交聯後將細胞裂解, 染色體分離並打碎為一定大小的片段200bp-1000bp;然後用特異性抗體免疫沉澱目標蛋白與 DNA交聯的復合物, 對特定靶蛋白與DNA片段進行富集。採用低pH值條件反交聯, DNA與蛋白質之間的 Schiff鍵水解, 釋放DNA片段。通過對目標片段的純化與檢測,獲得DNA與蛋白質相互作用的序列信息。
2、 RIP實驗
RIP技術（RNA BindingProtein Immunoprecipitation，RNA結合蛋白免疫沉澱），是研究細胞內RNA與蛋白結合情況的技術。運用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉澱下來，然後經過分離純化就可以對結合在復合物上的RNA進行分析；即用抗體或表位標記物捕獲細胞核內或細胞質中內源性的RNA結合蛋白，防止非特異性的RNA的結合，免疫沉澱把RNA結合蛋白及其結合的RNA一起分離出來，結合的RNA序列通過microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或高通量測序（RIP-Seq）方法來鑒定。是了解轉錄後調控網路動態過程的有力工具，能幫助我們發現miRNA的調節靶點。
3 、RNA pull-down實驗
使用體外轉錄法標記生物素RNA探針，然後與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質復合物。該復合物可與鏈霉親和素標記的磁珠結合，從而與孵育液中的其他成分分離。復合物洗脫後，通過western blot實驗檢測特定的RNA結合蛋白是否與RNA相互作用。
4 、EMSA實驗
凝膠遷移或電泳遷移率實驗（EMSA-electrophoreticmobility shift assay）是一種研究DNA結合蛋白和其相關的DNA結合序列相互作用的技術，可用於研究DNA結合蛋白和其相關的DNA結合序列相互作用、DNA定性和定量分析。生物素標記的探針依研究的結合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。
5、 Luciferase實驗
熒光素酶（Luciferase）是自然界中能夠產生生物發光的酶的統稱，不同的能夠控制發光的生物體用不同的熒光素酶來催化不同的發光反應。
螢光生成反應通常分為以下兩步：
螢光素+ ATP→ 螢光素化腺苷酸（luciferyladenylate）+ PPi
螢光素化腺苷酸+ O2→ 氧螢光素+ AMP +光
熒光素酶的基因可以被合成並插入到生物體中或轉染到細胞中，將不同類型的細胞（骨髓幹細胞、T細胞等）標記上（即表達）熒光素酶，就可以用高敏感度的CCD相機進行對動物體內進行活體觀察而不會傷害到動物本身。在熒光素酶中加入正確的螢光素底物就可以放出熒光，而發出的光子可以被光敏感元件，如螢光探測器或改進後的光學顯微鏡探測到。這就使得對包括感染在內的多種生命活動進程進行觀察成為可能。
熒光素酶分析可應用於啟動子研究中分析順式作用元件和反式作用因子、葯物篩選、siRNA和miRNA篩選、分泌途徑及蛋白定位報告基因檢測、活細胞的實時動態研究、信號轉導通路分析、難轉染的細胞（包括幹細胞和原代細胞）的研究、RNA剪接研究。
雙熒光素酶報告基因測試，是結合螢火蟲和海洋腔腸熒光素酶先進的共報告基因測試技術。在用螢火蟲熒光素酶定量基因表達時，通常採用第二個報告基因來減少實驗的變化因素。雙熒光素酶報告基因測試系統,結合pRL載體系統，表達第二個報告基因海洋腔腸熒光素酶，在單管中進行雙熒光素酶報告基因測試，快速、靈敏、簡便。其應用廣泛，可同時分析多個調控元件、同時分析多個信號轉導通路、單次篩選一個以上的靶點（包括脫靶效應、分析兩個或多個通路之間的相互作用）。

E. 列舉3種研究基因在體內表達方式的試驗方法

目的比較不同途徑遞送質粒DNA至Balb/c小鼠體內所誘導的報告基因表達效果。方法將編碼熒光素酶(luc+)蛋白的重組質粒(pGL-3-CMV)或空載體質粒pGL-3-basic以肌肉注射或電脈沖方法將10μg或100μg上述質粒注入小鼠股四頭肌,基因槍法以三槍接種質粒於小鼠腹部(2μg質粒DNA/4.5Mpa/槍)。於質粒注入後24~144h,檢測小鼠體內的熒光素酶活性。結果肌肉注射10μg的小鼠未檢測到熒光素酶的表達;肌肉注射100μg、電脈沖法遞送10μg和100μg質粒的小鼠,接種後48h體內熒光素酶活性達到峰值,遞送100μg的小鼠體內表達量明顯高於10μg的小鼠。基因槍免疫小鼠在接種24h達到峰值。結論電脈沖和基因槍介導的基因遞送方式基因表達水平遠遠高於傳統注射方法,是基因疫苗免疫遞送的可靠方法

F. 新基因功能的研究方法

基因功能的研究思路主要包括:
1.基因的亞細胞定位和時空(發育期或梯度葯物處理濃度, 不同組織/器官)表達譜;
2.基因在轉錄水平的調控(可以通過genome walking PCR或通過已有的資源庫尋找該基因的啟動子等轉錄調控區域, 通過單雜交或ChIP等技術, 尋找該基因的轉錄調控蛋白)
3.細胞生化水平的功能研究(也就是蛋白蛋白作用復合體的尋找驗證,具體方法有酵母雙雜交, GST pulldown, co-IP, BRET, FRET, BiFc等等,對該基因的表達產物做一個細胞信號轉導通路的定位)
4.gain-of-function & loss-of-function: 也就是分別在細胞和個體水平,做該基因的超表達和knockdown(或knockout), 從表型分析該基因的功能.
功能研究應從完整的分子-細胞-個體三個層次研究, 綜合分析.
關於基因的表達和定位，可以這樣去做：
1. mRNA水平檢測基因表達：選擇表達目的基因的組織/細胞（發育不同時期、機體不同部位、加處理因素...），提取RNA，反轉錄，做RT-PCR或real time RT-PCR，檢測基因的表達情況/變化。
（或者以northern blot、Rnase protection assay方法，檢測基因的mRNA表達情況/變化。）
2. 蛋白質水平檢測基因表達：選擇相應的組織/細胞，以Western blot、免疫組化（OR免疫熒光)檢測目的蛋白的表達。
3. 檢測目的蛋白的細胞定位：將目的基因克隆至帶熒游標簽（如GFP）的表達載體，在適合的模式細胞中表達，在活細胞中觀察蛋白的細胞定位。

G. 基因調控的研究方法

許多基因，包括只在某一發育階段活動的基因（見基因文庫）都可以從基因組中分離出來進行研究。應用核酸的順序分析技術可以測定基因的核苷酸順序。再應用體內與體外的基因表達系統就能直接了解基因調控的機制。

H. RNAi抑制基因表達的三種方式及原理分別是什麼

RNA干擾的分子抑制機制的三種方式及原理

• 轉錄抑制

與RNAi有關的dsRNA及蛋白質可參與染色質的修飾作用，使其中的組蛋白和DNA發生甲基化作用，使相應基因不能被轉錄，從而導致受阻基因不能表達。這種在轉錄水平上阻斷基因功能，使基因沉默的RNAi方式被稱為轉錄基因沉默(Transcriptional gene silencing,TGS)。這種現象先在植物中得到證實,但是在哺乳動物中是否存在仍有爭議。2004年Svoboda等研究表明，在小鼠卵母細胞中，通過RNAi引起靶基因表達沉默的長dsRNA不能引起相應DNA區域從頭合成DNA的甲基化。Morris等也於同年得出實驗結論，針對內源基因啟動子的siRNA能夠引起其區域內CG島以及組蛋白H3K9的甲基化，從而在轉錄水平抑制基因的表達。

• 轉錄後抑制

不同來源的dsRNA通過各種轉基因技術轉入植物、線蟲或哺乳動物細胞內，、被切割產生siRNA片斷，再由合成的RISC切割靶mRNA從而阻斷基因表達。這種基因能正常轉錄成mRNA，但mRNA因被降解使基因功能被阻斷，這種RNAi方式叫做轉錄後沉默(Post transcriptional gene silencing,PTGS)。siRNA對靶mRNA降解具有序列特異性，只能引起同源mRNA降解，如果siRNA與mRNA有一個bp不配對，RNAi作用就極大降低，如果兩者有4個bp不配對，就不能產生RNAi。

• 翻譯抑制

Grishok等在研究RNAi時，發現在細胞中在細胞中存在內源性小片段單鏈RNA(ssRNA)，其長度也在21～25 nt之間，這種ssRNA可與mRNA的3′非翻譯區(3′UTR)特異性地結合，從而抑制mRNA的翻譯和相應的功能蛋白質合成。這種小片段的ssRNA叫做stRNA(small temporal RNA)。ssRNA的形成是因為當RNA的大小為70～80 nt時，容易形成雙鏈的莖環狀結構，其雙鏈莖的長度正好在21～25 nt之間，這樣的雙鏈結構易被Dicer酶識別並切割成stRNA，由stRNA抑制翻譯。這種方式的RNAi也作用於轉錄後形成的mRNA，它在調節生物細胞內基因的表達、自身的發育方面起著重要的作用。

I. 基因表達調控的方式有哪些

基因表達調控分為很多水平：
1.DNA、染色體水平調控：基因丟失、基因修飾、基因重排、基因擴增、染色體結構變化。
2.轉錄水平調控（主要調控方式）：轉錄起始、延伸、終止均有影響。原核生物藉助於操縱子，真核生物通過順式作用元件和反式作用因子相互作用進行調控。
3.轉錄後水平調控：主要指真核生物原初轉錄產物經過加工成為成熟的mRNA，包括加帽、加尾、甲基化修飾等。
4.翻譯水平調控：對mRNA穩定性的調控、反義RNA對翻譯水平的調控等。
5.翻譯後水平調控：蛋白質的剪切、化學修飾（磷酸化、乙醯化、糖基化等）、轉運等。
6.mRNA降解的調控。