酸溶蛋白測定方法視頻

㈠ 食品中蛋白質含量怎麼測

目前食品中蛋白子含量的測定通常採用凱氏定氮法。

凱氏定氮法是測定化合物或混合物中總氮量的一種方法。即在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機氮都轉變成無機銨鹽，然後在鹼性條件下將銨鹽轉化為氨，隨水蒸氣餾出並為過量的酸液吸收，再以標准鹼滴定，就可計算出樣品中的氮量。由於蛋白質含氮量比較恆定，可由其氮量計算蛋白質含量，故此法是經典的蛋白質定量方法。

凱氏定氮法檢測的是粗蛋白，原理是檢測其中的氮含量，因為氮含量在真蛋白中大約 是16%左右，倒數就是6.25，所以，檢測出氮含量後，乘以6.25就是粗蛋白含量了。

凱氏定氮法的缺點是把非蛋白中的氮也算進去了，所以，才會有前幾年出現的三聚氰胺的事件，三聚氰胺是非蛋白氮，用凱氏定氮法檢測時，也把它算進去了，這就是奶粉造假的依據。

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㈡ 蛋白濃度測定的方法具體有哪些

蛋白濃度測定的方法：

1. 紫外分光光度法

紫外光譜吸收法測定蛋白質含量是講蛋白質溶液直接在紫外分光光度計中測定的方法，不需要任何試劑，操作簡單且易回收。蛋白質溶液在280nm附近有強烈的吸收，這是由於蛋白質中酪氨酸、色氨酸殘基而引起的，所以光密度受這兩種氨基酸含量的支配。另外核蛋白或提取過程中雜有的核酸對測定結果引起極大誤差，其最大吸收在260nm。所以同時測定280及260nm兩種波長的吸光度，通過計算可得較為正確的蛋白質含量。

2. 雙縮脲法

利用半飽和硫酸銨或27.8％硫酸鈉——亞硫酸鈉可使血清球蛋白沉澱下來，而此時血清白蛋白仍處於溶解狀態，因此可把兩者分開，這種利用不同濃度的中性鹽分離蛋白的方法稱為鹽方法。鹽析分離蛋白質的方法不僅用於臨床醫學，而且還廣泛地用於生物化學研究工作中，如一些特殊蛋白質—酶、蛋白激素等的分離和純化。

蛋白質和雙縮脲一樣，在鹼性溶液中能與銅離子形成紫色絡合物（雙縮脲反應），且其呈色深淺與蛋白質的含量成正比，因此可於蛋白質的定量測定。

但必須注意，此反應並非蛋白質所特有，凡分子內有兩個或兩個以上的肽鍵的化合物以及分子內有—CH2—NH2等結構化合物，雙縮脲反應也呈陽性。本實驗用27.8％硫酸鈉—亞硫酸鈉溶液稀釋血清，取出一部分用雙縮脲反應測定蛋白質的含量，剩餘部分則用濾紙過濾，使析出的球蛋白與白蛋白分離，取出濾液用同一反應測定白蛋白的含量。總蛋白與白蛋白含量之差即球蛋白的含量。白蛋白與球蛋白之比即所謂的白／球比值。

3. Folin-酚試劑法

目前實驗室較多用Folin-酚法測定蛋白質含量，此法的特點是靈敏度高，較雙縮脲高兩個數量級，較紫外法略高，操作稍微麻煩，反應約在15分鍾有最大顯色，並最少可穩定幾個小時，其不足之處是干擾因素較多，有較多種類的物質都會影響測定結果的准確性。其原理是蛋白質中含有酚基的酪氨酸，可與酚試劑中的磷鉬鎢酸作用產生蘭色化合物，顏色深淺與蛋白含量成正比。

4. 考馬氏亮藍G-250

此方法是1976年Bradform建立。染料結合法測定蛋白質的優點是靈敏度較高，可檢測到微量蛋白，操作簡便、快迅，試劑配製極簡單，重復性好，但干擾因素多。考馬氏亮藍G－250具有紅色和青色兩種色調、在酸性溶液中游離狀度下為棕紅色，當它通過疏水作用與蛋白質結合後，變成藍色，最大吸收波長從465nm轉移到595nm處，在一定的范圍內，蛋白質含量與 595nm的吸光度成正比，測定595nm處光密度值的增加即可進行蛋白質的定量。

以上便是實驗室中常見的幾種蛋白濃度測定的方法，另外還有凱氏定氮法和BCA法，有凱氏定氮法結果最精確，但操作復雜，BCA法又以其試劑穩定，抗干擾能力較強，結果穩定，靈敏度高而受到歡迎。

㈢ 說明常用蛋白質測定方法的原理,並對各種方法加以比較

1、凱氏定氮法

准備4個50mL凱氏燒瓶並標號，想1、2號燒瓶中加入定量的蛋白質樣品，另外兩個燒瓶作為對照，在每個燒瓶中加入硫酸鉀-硫酸銅混合物，再加入濃硫酸，將4個燒瓶放到消化架上進行消化。

消化完畢後進行蒸餾，全部蒸餾完畢後用標准鹽酸滴定各燒瓶中收集的氨量，直至指示劑混合液由綠色變回淡紫紅色，即為滴定終點，結算出蛋白質含量。

2、雙縮脲法

雙縮脲法是第一個用比色法測定蛋白質濃度的方法，硫銨不幹擾顯色， Cu2+與蛋白質的肽鍵，以及酪氨酸殘基絡合，形成紫藍色絡合物，此物在540nm波長處有最大吸收。

利用標准蛋白溶液和雙縮脲試劑繪制標准曲線，將待測血清與硫酸鈉在待測試管中混合，並只加入硫酸鈉不含血清的試管作對照，將兩支試管加入等量的雙縮脲試劑，混合後於37℃環境中放置10分鍾，在540nm波長進行比色，以對照管調零，讀取吸光度值，標准曲線上直接查出蛋白質含量。

3、酚試劑法

取6支試管標號，前5支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，不加標准蛋白溶液，每支試管液體總量加入蒸餾水補足而保持一致，混合均勻，在室溫下放置30分鍾，以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照，於650nm波長處測定各管中溶液的吸光度值。

4、紫外吸收法

大多數蛋白質在280nm波長處有特徵的最大吸收，這是由於蛋白質中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用於測定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白質溶液。

取9支試管分別標號，前8支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液，1號試管不加標准蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，而不加標准蛋白溶液，每支試管液體總量通過加入蒸餾水補足而保持一致，將液體混合均勻，在280nm波長處進行比色，記錄吸光度值。

5、考馬斯亮藍法

Bradford濃染液的配製：將100mg考馬斯亮藍G-250溶於50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，用蒸餾水補充至200ml，此染液放4℃至少6個月保持穩定。

標准曲線蛋白質樣本的准備：盡量使用與待測樣本性質相近的蛋白質作為標准品，測定抗體，可用純化的抗體作為標准。待測樣本是未知的，也可用抗體作為標准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之間繪制標准曲線。

將待測樣本溶於緩沖溶液中，該緩沖溶液應與製作標准曲線的緩沖溶液相同(最好用PBS)。按1：4用蒸餾水稀釋濃染料結合溶液，出現沉澱，過濾除去。

每個樣本加5ml稀釋的染料結合溶液，作用5～30min。染液與蛋白質結合後，將由紅色變為藍色，在595nm波長下測定其吸光度。注意，顯色反應不得超過30min。根據標准曲線計算待測樣本的濃度。