『壹』 高效液相色譜的原理及分析方法
原理主要有這幾種：
液—液分配色譜法
(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化學鍵合相色譜(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流動相和固定相都是液體。流動相與固定相之間應互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個明顯的分界面。當試樣進入色譜柱，溶質在兩相間進行分配。達到平衡時，服從於高效液相色譜計算公式： 高效液相色譜計算公式
式中，cs—溶質在固定相中濃度；cm--溶質在流動相中的濃度； Vs—固定相的體積；Vm—流動相的體積。LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決於K，K大的組分保留值大；但也有不同之處，GPC中，流動相對K影響不大，LLPC流動相對K影響較大。 a. 正相液 — 液分配色譜法(Normal Phase liquid Chromatography): 流動相的極性小於固定液的極性。 b. 反相液 — 液分配色譜法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流動相的極性大於固定液的極性。 c. 液 — 液分配色譜法的缺點：盡管流動相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動相中仍有微量溶解；流動相通過色譜柱時的機械沖擊力，會造成固定液流失。上世紀70年代末發展的化學鍵合固定相（見後），可克服上述缺點。現在應用很廣泛（70~80%）。
液—固色譜法
流動相為液體，固定相為吸附劑（如硅膠、氧化鋁等）。這是根據物質吸附作用的不同來進行分離的。其作用機制是：當試樣進入色譜柱時，溶質分子 (X) 和溶劑分子(S)對吸附劑表面活性中心發生競爭吸附（未進樣時，所有的吸附劑活性中心吸附的是S），可表示如下：Xm nSa ====== Xa nSm 式中：Xm--流動相中的溶質分子；Sa--固定相中的溶劑分子；Xa--固定相中的溶質分子；Sm--流動相中的溶劑分子。 當吸附競爭反應達平衡時： K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa] 式中：K為吸附平衡常數。[討論：K越大，保留值越大。]
離子交換色譜法
(Ion-exchange Chromatography) IEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基於離子交換樹脂上可電離的離子與流 離子交換色譜柱
動相中具有相同電荷的溶質離子進行可逆交換，依據這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離。以陰離子交換劑為例，其交換過程可表示如下： X-(溶劑中) (樹脂-R4N Cl-)=== (樹脂-R4N X-) Cl- (溶劑中) 當交換達平衡時： KX=[-R4N X-][ Cl-]/[-R4N Cl-][ X-] 分配系數為： DX=[-R4N X-]/[X-]= KX [-R4N Cl-]/[Cl-] [討論：DX與保留值的關系] 凡是在溶劑中能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法來進行分離。
離子對色譜法
(Ion Pair Chromatography) 離子對色譜法是將一種 ( 或多種 ) 與溶質分子電荷相反的離子 ( 稱為對離子或反離子 ) 加到流動相或固定相中，使其與溶質離子結合形成疏水型離子對化合物，從而控制溶質離子的保留行為。其原 離子色譜儀流程示意
理可用下式表示：X 水相 Y-水相 === X Y-有機相 式中：X 水相--流動相中待分離的有機離子（也可是陽離子）；Y-水相--流動相中帶相反電荷的離子對（如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等）；X Y---形成的離子對化合物。 當達平衡時： KXY = [X Y-]有機相/[ X ]水相[Y-]水相 根據定義，分配系數為： DX= [X Y-]有機相/[ X ]水相= KXY [Y-]水相 [討論：DX與保留值的關系] 離子對色譜法(特別是反相)發解決了以往難以分離的混合物的分離問題，諸如酸、鹼和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、生物鹼以及葯物等分離。
離子色譜法
(Ion Chromatography) 用離子交換樹脂為固定相，電解質溶液為流動相。以電導檢測器為通用檢測器，為消除流動相中強電解質背景離子對電導檢測器的干擾，設置了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應原理與離子交換色譜法相同。 以陰離子交換樹脂（R-OH）作固定相，分離陰離子（如Br-）為例。當待測陰離子Br-隨流動相（NaOH）進入色譜柱時，發生如下交換反應（洗脫反應為交換反應的逆過程）： 擔體圖示
抑制柱上發生的反應： R-H Na OH- === R-Na H2O R-H Na Br- === R-Na H Br- 可見，通過抑制柱將洗脫液轉變成了電導值很小的水，消除了本底電導的影響；試樣陰離子Br-則被轉化成了相應的酸H Br-，可用電導法靈敏的檢測。 離子色譜法是溶液中陰離子分析的最佳方法。也可用於陽離子分析。
空間排阻色譜法
(Steric Exclusion Chromatography) 空間排阻色譜法以凝膠 (gel) 為固定相。它類似於分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數納米到數百納米。溶質在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來進行分離，而是按分子大小進行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質的流動力學體積或分子大小有關。試樣進入色譜柱後，隨流動相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過。在試樣中一些太大的分子不能進入膠孔而受到排阻，因此就直接通過柱子，首先在色譜圖上出現，一些很小的分子可以進入所有膠孔並滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最後出現。
分析方法：
綜述
色譜柱的填料和流動相的組分應按各品種項下的規定.常用的色譜柱填料有硅膠和化學鍵合硅膠。後者以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用,辛基鍵合硅膠次之,氰基或氨基鍵合硅膠也有使用；離子交換填料,用於離子交換色譜；凝膠或玻璃微球等，用於分子排阻色譜等。注樣量一般為數微升。除另有規定外，柱溫為室溫，檢測器為紫外吸收檢測器。 在用紫外吸收檢測器時,所用流動相應符合紫外分光光度法項下對溶劑的要求。 正文中各品種項下規定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得任意改變外，其餘如色譜柱內徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進化學鍵合固定相反應
樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變, 以適應具體品種並達到系統適用性試驗的要求。一般色譜圖約於20分鍾內記錄完畢。 2.系統適用性試驗 按各品種項下要求對儀器進行適用性試驗，即用規定的對照品對儀器進行試驗和調整,應達到規定的要求；或規定分析狀態下色譜柱的最小理論板數、分離度和拖尾因子.
色譜柱的理論板數
在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項下規定的內標物質溶液，記錄色譜圖化學鍵合固定相應用
，量出供試品主成分或內標物質峰的保留時間t(R)和半高峰寬W(h/2)，按n＝5.54[t(R)╱W(h/2)]^2計算色譜柱的理論板數，如果測得理論板數低於各品種項下規定的最小理論板數，應改變色譜柱的某些條件（如柱長、載體性能、色譜柱充填的優劣等），使理論板數達到要求。
分離度
定量分析時，為便於准確測量，要求定量峰與其他峰或內標峰之間有較好的分離度。分離度（R）的計算公式為： 2[t(R2)-t(R1)] ，R＝ -W1＋W2 式中 t(R2)為相鄰兩峰中後一峰的保留時間； t(R1)為相鄰兩峰中前一峰的保留時間； W1及W2為此相鄰兩峰的峰寬。 除另外有規定外，分離度應大於1.5。
拖尾因子
為保證測量精度，特別當採用峰高法測量時，應檢查待測峰的拖尾因子(T)是否符合各品種項下的規定,或不同濃度進樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計算公式為： W(0.05h) T＝-2d1 式中 W(0.05h)為0.05峰高處的峰寬； d1為峰極大至峰前沿之間的距離。 除另有規定外，T應在0.95～1.05間。 也可按各品種校正因子測定項下，配製相當於80％、100％和120％的對照品溶液，加入規定量的內標溶液，配成三種不同濃度的溶液，分別注樣3次,計算平均校正因子，其相對標准偏差應不大於2.0％。
『貳』 高效液相色譜法的計算方法是怎樣的
[編輯本段]測定方法定量測定時，可根據樣品的具體情況採用峰面積法或峰高法。但用歸一法或內標法測定雜質總量時，須採用峰面積法。
面積歸一化法
測定供試品（或經衍生化處理的供試品）中各雜質及雜質的總量限度採用不加校正因子的峰面積歸一法。計算各雜質峰面積及其總和，並求出占總峰面積的百分率。但溶劑峰不計算在內。色譜圖的記錄時間應根據各品種所含雜質的保留時間決定，除另有規定外,可為該品種項下主成分保留時間的倍數。
主成分自身對照法
當雜質峰面積與成分峰面積相差懸殊時，採用主成分自身對照法。在測定前，先按各品種項下規定的雜質限度，將供試品稀釋成一定濃度的溶液作為對照溶液，進樣，調節檢測器的靈敏度或進樣量，使對照溶液中的主成分色譜峰面積滿足准確測量要求。然後取供試品溶液，進樣，記錄時間，除另有規定外，應為主成分保留時間的倍數。根據測得的供試品溶液的各雜質峰面積及其總和並和對照溶液主成分的峰面積比較，計算雜質限度。
內標法
測定供試品中雜質的總量限度
採用不加校正因子的峰面積法。取供試品，按各品種項下規定的方法配製不含內標物質的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖i；再配製含有內標物質的供試品溶液，在同樣的條件下注樣，記錄色譜圖ⅱ。記錄的時間除另有規定外，應為該品種項下規定的內標峰保留時間的倍數，色譜圖上內標峰高應為記錄儀滿標度的30％以上，否則應調整注樣量或檢測器靈敏度。
如果色譜圖ⅰ中沒有與色譜圖ⅱ上內標峰保留時間相同的雜質峰，則色譜圖ⅱ中各雜質峰面積之和應小於內標物質峰面積（溶劑峰不計在內）。如果色譜圖ⅰ中有與色譜圖ⅱ上內標物質峰保留時間相同的雜質峰，應將色譜圖ⅱ上的內標物質峰面積減去色譜圖ⅰ中此雜質峰面積，即為內標物質峰的校正面積；色譜圖ⅱ中各雜質峰總面積加色譜圖ⅰ中此雜峰面積，即為各雜質峰的校正總面積，各雜質峰的校正總面積應小於內標物質峰的校正面積。
加校正因子測定供試品中某個雜質或主成分含量
按各品種項下的規定,精密稱（量）取對照品和內標物質，分別配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子測定用的對照溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算校正因子：
as／ms]校正因子f＝-
ar／mr
式中
as為內標物質的峰面積或峰高，ar為對照品的峰面積或峰高；
ms為加入內標物質的量,mr為加入對照品的量。
再取各品種項下含有內標物質的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品（或其雜質）峰和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算含量：ax
含量（mx）＝f×-as／ms
式中
ax為供試品（或其雜質）峰面積或峰高；
mx為供試品（或其雜質）的量。
f、as和ms的意義同上。
當配製校正因子測定用的對照溶液和含有內標物質的供試品溶液使用同一份內標物質溶液時，則配製內標物質溶液不必精密稱（量）取。
外標法
測定供試品中某個雜質或主成分含量
按各品種項下的規定,精密稱(量)取對照品和供試品，配製成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品和供試品待測成分的峰面積（或峰高），按下式計算含量：
a<[x]>
含量（mx）＝mr×-ar式中各符號意義同上
由於微量注射器不易精確控制進樣量，當採用外標法測定供試品中某雜質或主成分含量時，以定量環進樣為好。