熒光定量pcr計算方法

⑴ 通過熒光定量PCR如何計算基因拷貝數

PCR 反應體系中加入非特異性的熒光染料（如： SYBR GREEN I ）或特異性的熒光探針（如： Taqman 探針），實時檢測熒光量的變化，獲得不同樣品達到一定的熒光信號（閾值）時所需的循環次數： CT 值（ Cycle Threshold ）；通過將已知濃度標准品的 CT 值與其濃度的對數繪制標准曲線，就可以准確定量樣品的濃度。

⑵ 請問：做熒光定量PCR時，△△Ct值是什麼意思，它的計算公式是什麼

△△Ct這是相對熒光定量的一個計算公式的簡化形式，用於比較不同樣品之間的差別或變化比率。

Ct= -k lgX0+ b（線性方程）用這個方程可以通過Ct值算出樣品的起始濃度

斜率=-1/lg(1+e)

擴增效率E=1, 斜率=-3.32

擴增效率范圍：90%-110%

斜率范圍：-3.1和-3.59之間

例如，想看a基因和b基因在某細胞系中表達量的差別，選取18s作為內參基因，就用a基因的Ct值減去18s的Ct值，得到△Ct1，用b基因的Ct值減去18s的Ct值得到△Ct2，然後用△Ct1-△Ct2=△△Ct，而a，b基因的表達量差別為2（-ΔΔCt）次方。

當然這計算方法是基於熒光定量的數學計算模型簡化來的，平時使用沒什麼問題，如果兩個目的基因的擴增效率不一樣，這個計算方法是不能用的。

(2)熒光定量pcr計算方法擴展閱讀：

熒光定量PCR應用領域

臨床疾病診斷：各型肝炎、艾滋病、禽流感、結核、性病等傳染病診斷和療效評價；地中海貧血、血友病、性別發育異常、智力低下綜合症、胎兒畸形等優生優育檢測；腫瘤標志物及瘤基因檢測實現腫瘤病診斷；遺傳基因檢測實現遺傳病診斷。

動物疾病檢測：禽流感、新城疫、口蹄疫、豬瘟、沙門菌、大腸埃希菌、胸膜肺炎放線桿菌、寄生蟲病等、炭疽芽孢桿菌。

食品安全：食源微生物、食品過敏源、轉基因、乳品企業阪崎腸桿菌等檢測。

科學研究：醫學、農牧、生物相關分子生物學定量研究。

應用行業：各級各類醫療機構、大學及研究所、CDC、檢驗檢疫局、獸醫站、食品企業及乳品廠等。

⑶ 做熒光定量PCR時，△△Ct值是什麼意思，它的計算公式是什麼

△△Ct = △Ct(試驗樣品) — △Ct(基準樣品)
△Ct(試驗樣品) = Ct（試驗樣品,目的基因） — Ct（試驗樣品,內參基因）
△Ct(基準樣品) = Ct（基準樣品,目的基因） — Ct（基準樣品,內參基因）
2 －△△Ct =2 －（－1.2）= 2.30

⑷ 熒光定量PCR的操作步驟

熒光定量PCR實驗步驟： ①取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鍾使其完全溶解。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振盪管體15秒後，15到30℃孵育2到3分鍾。4℃下12000rpm離心15分鍾。離心後混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配於水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉澱 將水相上層轉移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉澱其中的RNA，混勻後15到30℃孵育10分鍾後，於4℃下12000rpm 離心10分鍾。此時離心前不可見的RNA沉澱將在管底部和側壁上形成膠狀沉澱塊。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配製），清洗RNA沉澱。混勻後，4℃下7000rpm離心5分鍾。
⑤RNA乾燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉澱在室溫空氣中乾燥5-10分鍾。
⑥溶解RNA沉澱 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存於-80℃待用。 1）紫外吸收法測定
先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然後取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）後，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。
① 濃度測定
A260下讀值為1表示40 μg RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為：A260 ×稀釋倍數× 40 μg/ml。具體計算如下：
RNA溶於40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495μl的TE中，測得A260 = 0.21
RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl
取5ul用來測量以後，剩餘樣品RNA為35 μl，剩餘RNA總量為：
35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg
②純度檢測
RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。
2）變性瓊脂糖凝膠電泳測定
①制膠
1g瓊脂糖溶於72ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
10×MOPS電泳緩沖液
濃度 成分
0.4M MOPS，pH 7.0
0.1M 乙酸鈉
0.01M EDTA
灌制凝膠板，預留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝後取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。
②准備RNA樣品
取3μgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB於甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml。加熱至70℃孵育15分鍾使樣品變性。
③電泳
上樣前凝膠須預電泳5min，隨後將樣品加入上樣孔。5–6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2–3cm。
④紫外透射光下觀察並拍照
28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定於用於抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現，即更高分子量的彌散遷移物質或者帶，RNA的降解表現為核糖體RNA帶的彌散。用數碼照相機拍下電泳結果。 ①反應體系 序號 反應物 劑量 1 逆轉錄buffer 2μl 2 上游引物 0.2μl 3 下游引物 0.2μl 4 dNTP 0.1μl 5 逆轉錄酶MMLV 0.5μl 6 DEPC水 5μl 7 RNA模版 2μl 8 總體積 10μl 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
②混合液在加入逆轉錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鍾，取出後立即冰水浴至管內外溫度一致，然後加逆轉錄酶0.5μl，37℃水浴60分鍾。
③取出後立即95℃干浴3分鍾，得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液，保存於-80℃待用。 管家基因（β-actin）實時定量PCR
①β-actin陽性模板的標准梯度制備 陽性模板的濃度為1011，反應前取3μl按10倍稀釋（加水27μl並充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。
②反應體系如下：
標准品反應體系 序號 反應物 劑量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 陽性模板上游引物F 0.5μl 3 陽性模板下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6 陽性模板DNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 總體積 50μl 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
管家基因反應體系： 序號 反應物 劑量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 內參照上游引物F 0.5μl 3 內參照下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6 待測樣品cDNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 總體積 50μl 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
③制備好的陽性標准品和檢測樣本同時上機，反應條件為：93℃2分鍾，然後93℃ 1分鍾，55℃ 2分鍾，共40個循環。 ①針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應。
反應體系： 序號 反應物 劑量 1 10×PCR緩沖液 2.5 ul 2 MgCl2溶液 1.5 ul 3 上游引物F 0.5 ul 4 下游引物R 0.5 ul 5 dNTP混合液 3 ul 6 Taq聚合酶 1 ul 7 cDNA 1 ul 8 加水至總體積為 25ul 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
35個PCR循環（94℃1分鍾；55℃1分鍾；72℃1分鍾）； 72℃延伸5分鍾。
②PCR產物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。
③將PCR產物進行10倍梯度稀釋: 設定PCR產物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。 ①所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應體系。
體系配置如下： 序號 反應物 劑量 1 SYBR Green 1 染料 10 ul 2 上游引物 1ul 3 下游引物 1ul 4 dNTP 1ul 5 Taq聚合酶 2ul 6 待測樣品cDNA 5ul 7 ddH2O 30ul 8 總體積 50 ul 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
②將配製好的PCR反應溶液置於Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為：93℃2分鍾預變性，然後按93℃ 1分鍾，55℃1分鍾，72℃1分鍾，共40做個循環，最後72℃7分鍾延伸。 各樣品的目的基因和管家基因分別進行Realtime PCR反應。PCR產物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，GoldView染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。

⑸ 實時熒光定量RT-PCR的Fold change怎麼計算

3.Real-timeqPCR定量方法可以分為絕對定量和相對定量。絕對定量是用一系列已知濃度的標准品製作標准曲線，在相同的條件下目的基因測得的熒光信號量同標准曲線進行比較，從而得到目的基因的量。該標准品可以是純化的質粒DNA，體外轉錄的RNA，或者是體外合成的ssDNA。相對定量可以分為比較Ct法和其他一些相對方法。比較Ct指的是通過與內參基因Ct值之間的相差來計算基因表達差異,也稱之是2-DDCt。3.1絕對定量從標准曲線獲得線性方程：Y=-3.432X+34.638;R2=0.995,E=95%，所以可以進行數據分析。如果未知樣品的Ct=25，代入方程：25=-3.432X+34.638,所以：X=2.8Copies=10^2.83.22-DDCt定量2-DDCt方法使用的前提是內參和目的基因的擴增效率接近100%，且相差不超過5%。所用公式如下：2-DDCt=2-[(Ct目的基因-Ct內參基因)]處理組-[(Ct目的基因-Ct內參基因)]對照組=2-[E-F]處理組-[A-B]對照組=2(F-B)-(E-A)比如Cdk5在處理前和處理後樣品中的Ct平均值是25和22.1；內參GAPDH在處理前和處理後樣品中的Ct平均值是18.2和18.3.那麼處理所致倍數變化(foldchange)應該是=2-[(22.1-18.3)]處理組-[(25-Ct18.2)]對照組=23=8也就是處理造成Cdk5表達增加了7倍。如果是目的基因和內參基因的擴增效率相差比較大，可以用擴增效率進行校正，也就是Pfaffl方法。所用公式如下：處理所致倍數變化(foldchange)=C(A-E)/D(F-B)擴增效率（E）=10-1/斜率(理想的PCR擴增效率=2)百分比表示為：e%=(E-1)×100%同時是上面例子，如果Cdk5的擴增效率是70%；GAPDH的擴增效率是95%，那麼處理所致的倍數變化（foldchange）應該是=（1.7）（25-22.1）/(1.95)(18.3-18.2)=4.36即處理造成Cdk5表達量增加了3.36倍。

⑹ 實時定量PCR的結果是怎樣分析的

1、如果有標准曲線，按照標准曲線計算。

2、一般都是相對量，則用delta delta CT方法來計算。

3、舉例如下：對照組基因A的CT值為20， 內參（比如βactin)CT值15。實驗組基因A CT值18，內參CT值14。

4、首先算加樣量：delta CT=15-14=1。2的1次方是2。也就是說實驗組的加樣量是對照組的2倍。基因A: delta CT=20-18=2。2的2次方是4。也就是說基因A的量在實驗組是對照組的4倍。但是由於加樣量是2倍，所以4處以2=2，最後的相對量是2倍。

5、幾點注意：必須確定擴增的特異性，只有相同目標的CT值才能相減（擴增效率有可能不同），2的某次方只是理論值，實際擴增效率低於2，最好不用Syber Green。

(6)熒光定量pcr計算方法擴展閱讀：

PCR原理：

1、PCR技術的基本原理類似於DNA的天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

2、PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：

①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

②模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模板-引物結合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。每完成一個循環需2～4分鍾，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

參考資料來源：網路--PCR反應

⑺ 熒光定量pcr標准曲線怎麼計算

採用相對法定量要求必須目的基因和內參具有相同的擴增效率,所以需要做efficiency
curve如果得到的斜率小於0.1,可以採用相對法,否則,需要重新設計能達到相同擴增效率的引物,或者就需要製作標准曲線,製作標准曲線,可以將基因片段克隆到質粒,然後體外轉錄成RNA,定量以後合成cDNA,然後按比例稀釋後做出標准曲線,或者可以採用一個一直質量好的RNA樣品,如細胞株,然後以此為標准製作.如果直接採用DNA做標准,那前提是RNA逆轉錄的效率一致.

⑻ 請問：做熒光定量PCR時，△△Ct值是什麼意思，它的計算公式是什麼

△△Ct = △Ct(試驗樣品) — △Ct(基準樣品)
△Ct(試驗樣品) = Ct（試驗樣品，目的基因） — Ct（試驗樣品，內參基因）
△Ct(基準樣品) = Ct（基準樣品，目的基因） — Ct（基準樣品，內參基因）
2 －△△Ct =2 －（－1.2）= 2.30
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⑼ 急急急 熒光定量PCR中相對定定量方法ΔΔCt法的條件及計算過程！！！！！

△△Ct = △Ct(試驗樣品) — △Ct(基準樣品)
△Ct(試驗樣品) = Ct（試驗樣品，目的基因） — Ct（試驗樣品，內參基因）
△Ct(基準樣品) = Ct（基準樣品，目的基因） — Ct（基準樣品，內參基因）
2 －△△Ct =2 －（－1.2）= 2.30