蛋白液比重測量方法

『壹』 如何測量液體的比重

把被測液體倒入量筒 然後插入比重計 比重計不能與量筒底部有力的作用 所以對量筒的液面高度有一定要求 具體多高要根據具體數據才能求出

『貳』 液體比重計的測試方法分類：

液體比重的量測方法選擇，依賴樣品材料的屬性和所需的精確程度。今針對阿基米得原理，應用浮力法和置換法對液體的比重測定和經阿累尼斯原理的直線方程式，將密度轉換為濃度。提出更詳細的說明。A、真溶液測試方法：
應用於：化工溶液、食品、水產養殖、漱口水、葯劑。
原理：根據GB/T13531、T5526、T5009規范。應用阿基米得原理的浮力法、置換法。可由阿累尼
斯原理的直線方程式將密度轉換為濃度。
B、化學揮發性試劑測試方法：
應用於：液態石油燃料、化學揮發性試劑、揮發性葯劑。
原理：根據GB/T611、ISO3696、JIG171規范。應用阿基米得原理的比重瓶容積置換法、浮力法。可由阿累尼斯原理的直線方程式，將密度轉換為濃度。
C、中、高黏度液體測試方法：應用於：分散漆、陶瓷漿、油墨、液態樹脂、研磨液體、瀝青、液態
膠黏劑、中、高黏性流動性液體。
原理：根據GB/T21862、GB/T15223、GB/T6750、ASTM D1475、之規定，採用阿基米得的浸漬Gamma球體積置換法。可由阿累尼斯原理的直線方程式，將密度轉換為濃度。
D、恆溫式香精、精油比重測試方法：
應用於：精油、香水、單璃及合成香料。
原 原理：根據GB/T11540、ISO279、GB/T14455、GB/T5526、13531、5009、JIS規范。採用阿基米得原理的浮力法，水槽的
溶液溫度處於恆溫的條件下。可由阿累尼斯原理的直線方程
式，將密度轉換為濃度。
E、懸浮液、乳狀液測試方法：
應用於：奶油、化妝水、蛋黃醬、牛奶、醋、植物油,調味品等。
原理：根據GB/T5526、T5009、T13531規范。應用阿基米得原理的浮力法、置換法。F、非流動性液體比重測試方法：
應用於：牙膏、唇膏、樹脂凝膠黏著劑、麥芽糖、高黏度非流動性液態。
原理：根據ASTMD792、ISO2781 、GB/T1033規范。依據阿基米得原理的浮力法。
G、水銀測試方法：
應用於：測定多孔性材料的表觀密度所使用水銀的比重、水銀回收生產廠。
原理：根據GB/T21862、ASTM D1475、ISO2811-2、DIN53217-3之規定，採用阿基米得的浸漬Gamma球體積置換法。可由阿累尼斯原理的直線方程序，密度轉換為濃度。
H、在線式液體比重測試方法：
應用於：電鍍槽,蝕刻槽,洗滌槽及工業各製程的現場偵測。
原理：應用阿基米得的浮力法原理，將主機放在一個容易操作
的平台上，主機內裝有取樣槽，液體由取樣槽內的進出
孔進出，透過取樣槽內感應球的浮力變化自動顯出液體
的比重值。透過連續的動作即可完成在線液體的密度測
量與監控。快速讀取量測液體的在線密度數值。
I、血液(硫酸銅)比重測試方法：
應用於：醫院、血庫、研究實驗室、獻血者血紅蛋白的篩檢。
原理：根據GB18467-2001規范，採用阿基米得原理的浮力法，
讀出硫酸銅液體密度值，進而測定血液的比重與知曉血
紅蛋白含量。

『叄』 測量蛋白質總量的方法有哪些

1.凝膠過濾法 凝膠過濾法分離蛋白質的原理是根據蛋白質分子量的大小。由於不同排阻范圍的葡聚糖凝膠有一特定的蛋白質分子量范圍，在此范圍內，分子量的對數和洗脫體積之間成線性關系。因此，用幾種已知分子量的蛋白質為標准，進行凝膠層析，以每種蛋白質的洗脫體積對它們的分子量的對數作圖，繪制出標准洗脫曲線。未知蛋白質在同樣的條件下進行凝膠層析，根據其所用的洗脫體積，從標准洗脫曲線上可求出此未知蛋白質對應的分子量。
2.SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法 蛋白質在普通聚丙烯醯胺凝膠中的電泳速度取決於蛋白質分子的大小、分子形狀和所帶電荷的多少。SDS（十二烷基磺酸鈉）是一種去污劑，可使蛋白質變性並解離成亞基。當蛋白質樣品中加入SDS後，SDS與蛋白質分子結合，使蛋白質分子帶上大量的強負電荷，並且使蛋白質分子的形狀都變成短棒狀，從而消除了蛋白質分子之間原有的帶電荷量和分子形狀的差異。這樣電泳的速度只取決於蛋白質分子量的大小，蛋白質分子在電泳中的相對遷移率和分子質量的對數成直線關系。以標准蛋白質分子質量的對數和其相對遷移率作圖，得到標准曲線，根據所測樣品的相對遷移率，從標准曲線上便可查出其分子質量。
3.沉降法（超速離心法） 沉降系數（S）是指單位離心場強度溶質的沉降速度。S也常用於近似地描述生物大分子的大小。蛋白質溶液經高速離心分離時，由於比重關系，蛋白質分子趨於下沉，沉降速度與蛋白質顆粒大小成正比，應用光學方法觀察離心過程中蛋白質顆粒的沉降行為，可判斷出蛋白質的沉降速度。根據沉降速度可求出沉降系數，將S帶入公式，即可計算出蛋白質的分子質量。質的沉降速度。S也常用於近似地描述生物大分子的大小。蛋白質溶液經高速離心分離時，由於比重關系，蛋白質分子趨於下沉，沉降速度與蛋白質顆粒大小成正比，應用光學方法觀察離心過程中蛋白質顆粒的沉降行為，可判斷出蛋白質的沉降速度。根據沉降速度可求出沉降系數，將S帶入公式，即可計算出蛋白質的分子質量。

『肆』 國家標准檢測蛋白質含量測定方法

蛋白質含量測定方法就是檢測N元素的含量，像三聚氰胺的問題，就是通過增加N的含量使「蛋白質」含量提高的。

國家標准檢測蛋白質含量的方法叫做凱氏定氮法，食物中的蛋白質在催化加熱條件下分解，導致氨和硫酸結合產生硫酸銨。 鹼蒸餾採用無硫，硼酸吸收，用硫酸或鹽酸標准滴定溶液滴定，根據酸耗計算氮含量，再乘以轉化系數，即蛋白質含量。

具體操作步驟如下：

1.樣品處理

精確稱量0.2-2.0g固體樣品或2-5g半固體樣品或吸收10-20ml液體樣品（約30-40mg氮當量）。將其轉移至乾燥的100毫升或500毫升氮氣固定瓶中，加入0.2克硫酸銅，6克硫酸鉀和20毫升硫酸，輕輕搖動，在瓶口放置一個小漏斗，將瓶子傾斜石棉網上有45度角，有小孔。

加熱小火後，內容物碳化，泡沫完全停止，加強火力，保持瓶內液體稍微沸騰，直至液體呈藍綠色澄清透明，然後繼續加熱0.5小時。取出並冷卻，小心加入20毫升水，冷卻，移入100毫升容量瓶中，用少量水洗凈氮氣瓶，洗凈液放入容量瓶中，然後用水沖洗至刻度，混勻備用。

取相同量的硫酸銅，硫酸鉀和濃硫酸作為試劑進行空白試驗。然而，這種方法很危險，很難在實驗室中證明。大多數實驗室都有一個消化器，可以一次處理16個以上的樣品和一個可以自行設定溫度的呼吸機。它更安全，更可操作。

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除了凱氏定氮法以外，標準的測量方法還有：

• 分光光度法

食品中的蛋白質在催化加熱條件下被分解，分解產生的氨與硫酸結合生成硫酸銨，在pH4.8的乙酸鈉-乙酸緩沖溶液中與乙醯丙酮和甲醛反應生成黃色的3,5-二乙醯-2,6-二甲基-1,4-二氫化吡啶化合物。在波長400nm 下測定吸光度值，與標准系列比較定量,結果乘以換算系數，即為蛋白質含量。

• 燃燒法

樣品在900~1200℃下燃燒。在燃燒過程中，產生混合氣體。 諸如碳，硫和鹽的干擾氣體被吸收管吸收，氮氧化物被還原成氮。 形成的氮氣流由熱導檢測器（TCD）檢測。

『伍』 測定蛋白質分子量的常用方法

蛋白定量的測試方法有很多種，其中較為常見的有五種，分別是Bradford法、Bradford斑點試驗、Coomassie 斑點試驗、紫外分光度檢測法及BCA法這五種。

在生化實驗中，對樣品中的蛋白質進行准確可靠的定量分析，是經常進行的一項非常重要的工作。蛋白質是一種十分重要的生物大分子，它的種類很多，結構不均一，分子量又相差很大，功能各異，這樣就給建立一個理想而又通用的蛋白質定量分析的方法帶來了許多具體的因難。

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蛋白定量分析也就涉及到生產科研的多個領域及行業，也是生物學科、食品檢驗及摻假摻偽、臨床檢驗、診斷疾病和質量檢驗中最常見的方法。

蛋白定量是生物學實驗不可缺少的一部分。為驗證細胞裂解是否成功，或為了將多個樣品進行平行實驗比較或標准化保存，需對細胞裂解液進行蛋白定量。

為了判定蛋白的產量，需對純化好的蛋白進行定量。為了將純化好的蛋白用生物素或者報告酶進行標記，同樣需首先對蛋白樣品進行定量，以保證標記反應在適當的化學濃度下進行。

『陸』 蛋白質測量方法

生物材料的含氮量測定在生物化學研究中具有一定的意義，如蛋白質的含氮量約為16％，測出含氮量則可推知蛋白含量。生物材料總氮量的測定，通常採用微量凱氏定氮法。凱氏定氮法由於具有測定準確度高，可測定各種不同形態樣品等兩大優點，因而被公認為是測定食品、飼料、種子、生物製品、葯品中蛋白質含量的標准分析方法。

『柒』 =測定蛋白質分子量的主要方法有哪些簡述其原理（列舉三種）

知道蛋白質分子量、氨基酸組成計算器
http://www.proteomics.com.cn/tools/mwcal/

一般的方法：
SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法測定蛋白質的分子量

[原理]

十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate, 簡稱SDS）-聚丙烯醯胺凝膠電泳法測定蛋白質的分子量，是六十年代末Weber和Osborn在Shapiro等人在實驗基礎上發展起來的一項新技術。用這種方法測定蛋白質的分子量具有快速靈便，設備簡單等優點。

蛋白質的電泳遷移率在一般的電泳方法中，主要取決於它在某PH下所帶的凈電荷量、分子大小（即分子量）和形狀的差異性，而SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳對大多數蛋白質，主要取決於它們的分子量，與原有的電荷量和形狀無關。

SDS是一種陰離子表面活性劑，在一定的條件下，它能打開蛋白質氫鍵和疏水鍵，並按比例地結合到這些蛋白質分子上形成帶負電荷的蛋白質-SDS復合物，每克蛋白質一般結合1.4克SDS。SDS與蛋白質的定比結合使蛋白質-SDS復合物均帶上相同的負電荷，其量遠遠超過蛋白質原有的電荷量，因而掩蓋了蛋白質間原有的電荷差異。在水溶液中，蛋白質-SDS復合物具有相同的構象，近似雪茄煙形的長橢園棒（短軸均為1.8nm，長軸則隨蛋白質的分子量成正比變化），克服了蛋白質間原有的形狀差異。這樣蛋白質-SDS復合物在凝膠中的遷移率不再受原有電荷和形狀的影響，而只是蛋白質分子量的函數。蛋白質分子量與電泳遷移率間的關系可用下式表示：

lgMr = K – bm

式中 Mr為分子量；K為常數；b為斜率；m為遷移率。

因此，用本法測定蛋白質的分子量只需根據待測蛋白質在已知分子量的標准蛋白質的lgMr～遷移率的圖中的位置，就能得知分子量。

用本法測得的分子量，除單鏈蛋白質外，均不是天然蛋白質的完整分子量，而是組成這些蛋白質的亞基或肽鏈的分子量。本法對一些電荷異常，或構象異常，或帶有大輔基的蛋白質不適用，如組蛋白F1和某些糖蛋白等。對一些結構蛋白如膠原蛋白等也不適用。

SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳按照凝膠電泳系統中的緩沖液、pH值和凝膠孔徑的差異可分為SDS-連續系統電泳和 SDS-不連續系統電泳兩類；按照所製成的凝膠形狀和電泳方式又可以分為SDS-聚丙烯醯胺凝膠垂直管型電泳和SDS-聚丙烯醯胺凝膠垂直板型電泳兩類。

本實驗採用SDS-不連續垂直板型操作方法。通過實驗使學生掌握SDS-聚丙烯醯胺凝膠垂直板式電泳的原理及技術，包括制膠、灌膠、加樣、剝膠及固定染色等，學會用這些方法測定蛋白質分子量。

[方法與步驟]

一、加樣液的制備

1、標准蛋白質加樣液的制備 稱取細胞色素，胰凝乳蛋白酶原，胃蛋白酶，卵白蛋白，牛血清白蛋白各0.5～1mg，置小離心管（Eppendorf管）中，加入樣品溶解液1mL，充分溶解，如有不溶物應離心除去。沸水浴熱處理3min，冷卻備用。

2、待測蛋白質加樣液的制備

根據待測蛋白質樣品存在的狀況而定。

（1）固體

待測蛋白樣品，如為無鹽的純蛋白質固體制劑，加樣液的制備方法同標准蛋白質加樣液的制備；如為含鹽的純蛋白質固體制劑，應先加水充分溶解，對透析緩沖液透析12～16h，然後吸取0.5mL（蛋白濃度應為0.5～1mg/mL），置Eppendorf管中，並加入等體積濃樣品溶解液，沸水浴熱處理3min，冷卻備用。

（2）液體

待測蛋白樣品，如為無鹽的純蛋白質液體制劑，則加入等體積濃樣品溶解液，然後熱處理；如為含鹽的液體制劑，則需先透析。

二、凝膠的制備

1、凝膠板的准備

（1）洗板

將洗潔精用溫水稀釋後，用它浸透海綿擦洗玻板，然後用自來水洗凈，再用酒精將板擦乾。

（2）安裝制膠板

制膠前將玻板與塑料嵌條和凹型陶瓷板的邊緣對齊，下沿用密封膠帶封口，用塑料夾子或鐵夾子將兩端夾好，注意要確保密封，安放在固定架上。

2、分離膠和濃縮膠溶液的配製

組 分
分離膠/mL
濃縮膠/mL

凝膠貯備液
2.5
0.26

分離膠緩沖液（pH8.8）
1.9
—

濃縮膠緩沖液（pH6.8）
—
0.5

10%SDS
0.075
0.02

TEMED
0.026
0.02

雙蒸水
3.05
1.22

10％過硫酸銨
0.013
0.02

總體積
7.6
2

注意：①最後加入10%過硫酸銨溶液，混合製成凝膠液，迅速灌制凝膠。

②丙烯醯胺和甲叉雙丙烯醯胺均為神經毒劑，對皮膚有刺激作用。因此必須小心操作，不得吸入和接觸皮膚，聚合完全聚丙烯醯胺凝膠無毒。

3、制分離膠

將制膠板垂直放好，插上與相應厚度的樣品梳，在梳子下緣線1cm處做標記，卸下樣品梳。將配好的分離膠溶液緩慢加入制膠板之間，直至液面達到標記處。用滴管貼近膠液界面小心而又緩慢地覆蓋厚度約0.5cm的正丁醇層，以防止溶液蒸發並保證膠面平整。

4、制濃縮膠

分離膠聚合後，倒去正丁醇，用蒸餾水沖洗分離膠膠面兩次，用濾紙吸去殘液。用滴管將濃縮膠溶液加在分離膠面上，充滿制膠板，插入樣品梳。

（三）電泳

1、安裝電泳槽

濃縮膠聚合後，除去梳子、密封膠帶以及六個鐵夾。將制膠扳、電泳糟內芯、另一對制膠板依次放入槽內。兩制膠板的凹型陶瓷板均應與電泳槽內芯接觸。然後插入楔型板以固定兩套制膠板。如果每次電泳只用一塊膠板，必須用提供的有機玻璃板代替另一套制膠板。

2、加樣

在內外水槽加註緩沖液，使內外槽的水位均超過凹形板的缺口但低於塑料板的上沿。用微量加樣器在梳井內加樣。

3、電泳

蓋好上蓋，在80V～100V的電壓下電泳約3h，至溴酚藍指示的電泳前沿到達制膠板的下緣止，關掉電源。然後拔掉楔形板，取下制膠扳。

（四）染色、脫色

用刀片或薄板將白塑料板與陶瓷板輕輕撬開，用刀片沿分離膠與濃縮膠的交接處，將分離膠切下，並在分離膠的左上角切掉一小角，以標記樣品順序。然後手戴橡膠手套將分離膠小心移入染色器皿中。在染色器皿中加入100mL考馬氏亮藍染液（含0.25%考馬氏亮藍R-250，30％乙醇，10％乙酸的水溶液），加蓋，在搖床上染色2h。

將染液倒回貯存瓶（可反復使用）。在染色皿中加入100mL脫色液（10％乙酸，30％乙醇），振盪脫色至蛋白條帶清晰。

[結果和計算]

1、凝膠脫盡底色後，色帶清晰顯出。按實樣描下或攝下電泳圖譜。

2、根據各蛋白遷移距離和染料遷移距離的比值，求出各蛋白的相對遷移率mr，然後作出lgMr～mr關系圖，從圖中找出未知蛋白mr對應的分子量。參考資料：http://jpkc.ecust.e.cn/17/experiment/exp/dy_2.htm

『捌』 蛋白濃度測定的方法具體有哪些

蛋白濃度測定的方法：

1. 紫外分光光度法

紫外光譜吸收法測定蛋白質含量是講蛋白質溶液直接在紫外分光光度計中測定的方法，不需要任何試劑，操作簡單且易回收。蛋白質溶液在280nm附近有強烈的吸收，這是由於蛋白質中酪氨酸、色氨酸殘基而引起的，所以光密度受這兩種氨基酸含量的支配。另外核蛋白或提取過程中雜有的核酸對測定結果引起極大誤差，其最大吸收在260nm。所以同時測定280及260nm兩種波長的吸光度，通過計算可得較為正確的蛋白質含量。

2. 雙縮脲法

利用半飽和硫酸銨或27.8％硫酸鈉——亞硫酸鈉可使血清球蛋白沉澱下來，而此時血清白蛋白仍處於溶解狀態，因此可把兩者分開，這種利用不同濃度的中性鹽分離蛋白的方法稱為鹽方法。鹽析分離蛋白質的方法不僅用於臨床醫學，而且還廣泛地用於生物化學研究工作中，如一些特殊蛋白質—酶、蛋白激素等的分離和純化。

蛋白質和雙縮脲一樣，在鹼性溶液中能與銅離子形成紫色絡合物（雙縮脲反應），且其呈色深淺與蛋白質的含量成正比，因此可於蛋白質的定量測定。

但必須注意，此反應並非蛋白質所特有，凡分子內有兩個或兩個以上的肽鍵的化合物以及分子內有—CH2—NH2等結構化合物，雙縮脲反應也呈陽性。本實驗用27.8％硫酸鈉—亞硫酸鈉溶液稀釋血清，取出一部分用雙縮脲反應測定蛋白質的含量，剩餘部分則用濾紙過濾，使析出的球蛋白與白蛋白分離，取出濾液用同一反應測定白蛋白的含量。總蛋白與白蛋白含量之差即球蛋白的含量。白蛋白與球蛋白之比即所謂的白／球比值。

3. Folin-酚試劑法

目前實驗室較多用Folin-酚法測定蛋白質含量，此法的特點是靈敏度高，較雙縮脲高兩個數量級，較紫外法略高，操作稍微麻煩，反應約在15分鍾有最大顯色，並最少可穩定幾個小時，其不足之處是干擾因素較多，有較多種類的物質都會影響測定結果的准確性。其原理是蛋白質中含有酚基的酪氨酸，可與酚試劑中的磷鉬鎢酸作用產生蘭色化合物，顏色深淺與蛋白含量成正比。

4. 考馬氏亮藍G-250

此方法是1976年Bradform建立。染料結合法測定蛋白質的優點是靈敏度較高，可檢測到微量蛋白，操作簡便、快迅，試劑配製極簡單，重復性好，但干擾因素多。考馬氏亮藍G－250具有紅色和青色兩種色調、在酸性溶液中游離狀度下為棕紅色，當它通過疏水作用與蛋白質結合後，變成藍色，最大吸收波長從465nm轉移到595nm處，在一定的范圍內，蛋白質含量與 595nm的吸光度成正比，測定595nm處光密度值的增加即可進行蛋白質的定量。

以上便是實驗室中常見的幾種蛋白濃度測定的方法，另外還有凱氏定氮法和BCA法，有凱氏定氮法結果最精確，但操作復雜，BCA法又以其試劑穩定，抗干擾能力較強，結果穩定，靈敏度高而受到歡迎。

『玖』 如何准確測定樣品中蛋白質的含量

5種方法測定蛋白質含量

一、微量凱氏（kjeldahl）定氮法

樣品與濃硫酸共熱。含氮有機物即分解產生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經強鹼鹼化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據此酸液被中和的程度可計算得樣品之氮含量。

二、雙縮脲法（biuret法）

1、實驗原理

雙縮脲是兩個分子脲經180℃左右加熱，放出一個分子氨後得到的產物。在強鹼性溶液中，雙縮脲與硫酸銅形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。凡具有兩個醯胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應。

紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質含量。測定范圍為1-10mg蛋白質。干擾這一測定的物質主要有：硫酸銨、tris緩沖液和某些氨基酸等。

此法的優點是較快速 ，不同的蛋白質產生顏色的深淺相近，以及干擾物質少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用於需要快速，但並不需要十分精確的蛋白質測定。

2、試劑與器材

（1）試劑：a、標准蛋白質溶液：用標準的結晶牛血清清蛋白或標准酪蛋白，配製成10mg/ml的標准蛋白溶液，可用bsa濃度1mg/ml的a280為0.66來校正其純度。

如有需要，標准蛋白質還可預先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計算出其純度，再根據其純度，稱量配製成標准蛋白質溶液。牛血清清蛋白用0.9%nacl配製，酪蛋白用0.05n nach配製。

b、雙縮脲試劑：稱以1.50克硫酸銅和6.0克酒石酸鉀鈉，用500毫升水溶解，在攪拌下加入300毫升10% naoh溶液，用水稀釋到1升，貯存於塑料瓶中（或內壁塗以石蠟的瓶中）。此試劑可長期保存。若貯存瓶中有黑色沉澱出現，則需要重新配製。

（2）器材： 可見光分光光度計、大試管15支、旋渦混合器等。

3、操作方法

（1）標准曲線的測定：取12支試管分兩組，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的標准蛋白質溶液，用水補足到1毫升，然後加入4毫升雙縮脲試劑。充分搖勻後，在室溫（20～25℃）下放置30分鍾，於540nm處進行比色測定。

用未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照液。取兩組測定的平均值，以蛋白質的含量為橫座標，光吸收值為縱座標繪制標准曲線。

（2）樣品的測定：取2～3個試管，用上述同樣的方法，測定未知樣品的蛋白質濃度。注意樣品濃度不要超過10mg/ml。

三、folin—酚試劑法（lowry法）

1、實驗原理

這種蛋白質測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應用最廣泛的一種方法，由於其試劑乙的配製較為困難（現在已可以訂購），近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。

這兩種顯色反應產生深蘭色的原因是：在鹼性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物。folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。

在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。 folin—酚試劑法最早由lowry確定了蛋白質濃度測定的基本步驟。以後在生物化學領域得到廣泛的應用。這個測定法的優點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點是費時間較長，要精確控制操作時間，標准曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質較多。

對雙縮脲反應發生干擾的離子，同樣容易干擾lowry反應。而且對後者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。

濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對顯色無影響，但這些物質濃度高時，必須作校正曲線。

含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉—氫氧化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色後會色淺，則必須提高碳酸鈉—氫氧化鈉溶液的濃度1～2倍。

進行測定時，加folin—酚試劑時要特別小心，因為該試劑僅在酸性ph條件下穩定，但上述還原反應只在ph=10的情況下發生，故當folin一酚試劑加到鹼性的銅—蛋白質溶液中時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應即能發生。

此法也適用於酪氨酸和色氨酸的定量測定。 此法可檢測的最低蛋白質量達5mg。通常測定范圍是20~250mg。

2、試劑與器材

（1）試劑

a、試劑甲： （a）10克碳酸鈉，2克 naoh和0.25克酒石酸鉀鈉 。溶解於500毫升蒸餾水中。 （b）0.5克硫酸銅溶解於100毫升蒸餾水中，每次使用前，將50份（a）與1份（b）混合，即為試劑甲。

b、試劑乙：在2升磨口迴流瓶中，加入100克鎢酸鈉，25克鉬酸鈉及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上迴流管，以小火迴流10小時，迴流結束時，加入150克硫酸鋰，50毫升蒸餾水及數滴液體溴，

開口繼續沸騰15分鍾，以便驅除過量的溴。冷卻後溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復滴加液體溴的步驟）。稀釋至1升，過濾，濾液置於棕色試劑瓶中保存。使用時用標准nach滴定，酚酞作指示劑，然後適當稀釋，約加水1倍，使最終的酸濃度為1n左右。

c、標准蛋白質溶液: 精確稱取結晶牛血清清蛋白或球蛋白，溶於蒸餾水，濃度為250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶於水若混濁，可改用0.9%nacl溶液。

（2）器材

a、可見光分光光度計

b、旋渦混合器

c、秒錶

d、試管16支

3、操作方法

（1）標准曲線的測定：取16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其餘試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升標准蛋白質溶液（濃度為250mg/ml）。用水補足到1.0毫升，

然後每支試管加入5毫升試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，於室溫（20～25℃）放置10分鍾。再逐管加入0.5毫升試劑乙（folin—酚試劑），同樣立即混勻。

這一步混合速度要快，否則會使顯色程度減弱。然後在室溫下放置30分鍾，以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照，於700nm處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質的量為橫座標，吸光度值為縱座標，繪制出標准曲線。

注意：因lowry反應的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時間，即第1支試管加入5毫升試劑甲後，開始計時，1分鍾後，第2支試管加入5毫升試劑甲，2分鍾後加第3支試管，余此類推。

全部試管加完試劑甲後若已超過10分鍾，則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙，1分鍾後第2支試管加入0.5毫升試劑乙，2分鍾後加第3支試管，余此類推。待最後一支試管加完試劑後，再放置30分鍾，然後開始測定光吸收。

每分鍾測一個樣品。 進行多試管操作時，為了防止出錯，每位學生都必須在實驗記錄本上預先畫好下面的表格。表中是每個試管要加入的量（毫升），並按由左至右，由上至下的順序，逐管加入。最下面兩排是計算出的每管中蛋白質的量（微克）和測得的吸光度值。

folin—酚試劑法實驗表 管號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 標准蛋白質 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 （250mg/ml） 未知蛋白質 0.2 0.4 0.6 （約250mg/ml）

蒸餾水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4 試劑甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 試劑乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 每管中蛋白質的量（mg） 吸光度值（a700）

（2）樣品的測定：取1毫升樣品溶液（其中約含蛋白質20~250微克），按上述方法進行操作，取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白對照。

通常樣品的測定也可與標准曲線的測定放在一起，同時進行。即在標准曲線測定的各試管後面，再增加3個試管。如上表中的8、9、10試管。

根據所測樣品的吸光度值，在標准曲線上查出相應的蛋白質量，從而計算出樣品溶液的蛋白質濃度。

注意:由於各種蛋白質含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質而變化。因而本測定法通常只適用於測定蛋白質的相對濃度（相對於標准蛋白質）。

四、改良的簡易folin—酚試劑法

1、試劑

（1）試劑甲：鹼性銅試劑溶液中，含0.5n 氯化鈉、10%碳酸鈉、0.1%酒石酸鉀和0.05%硫酸銅，配製時注意硫酸銅用少量蒸餾水溶解後，最後加入。

（2）試劑乙：與前面的基本法相同。臨用時加蒸餾水稀釋8倍。

（3）標准蛋白質溶液：同基本法。

2、操作步驟 測定標准曲線與樣品溶液的操作方法與基本法相同。只是試劑甲改為1毫升，室溫放置10分鍾後，試劑乙改為4毫升。在55℃恆溫水浴中保溫5分鍾。

用流動水冷卻後，在660nm下測定其吸光度值。 改良的快速簡易法，可獲得與 folin—酚試劑法（即lowry基本法）相接近的結果。

五、考馬斯亮蘭法（bradford法）

1、實驗原理 雙縮脲法（biuret法）和folin—酚試劑法（lowry法）的明顯缺點和許多限制，促使科學家們去尋找更好的蛋白質溶液測定的方法。

1976年由bradford建立的考馬斯亮蘭法（bradford法），是根據蛋白質與染料相結合的原理設計的。這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優點，因而正在得到廣泛的應用。

這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質測定法。 考馬斯亮蘭g-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm變為595nm，溶液的顏色也由棕黑色變為蘭色。

經研究認為，染料主要是與蛋白質中的鹼性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合。 在595nm下測定的吸光度值a595，與蛋白質濃度成正比。

2、試劑與器材

（1）試劑：

a、標准蛋白質溶液，用球蛋白或牛血清清蛋白，配製成1.0mg/ml和0.1mg/ml的標准蛋白質溶液。

b、考馬斯亮蘭g—250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭g—250，溶於50ml 95%的乙醇後，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀釋至1升。

（2）器材：

a、可見光分光光度計

b、旋渦混合器

c、試管16支

3、操作方法

（1）標准方法

a、取16支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其餘試管分為兩組按表中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/ml的標准蛋白質溶液給各試管分別加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然後用無離子水補充到0.1ml。

最後各試管中分別加入5.0ml考馬斯亮蘭g—250試劑，每加完一管，立即在旋渦混合器上混合（注意不要太劇烈，以免產生大量氣泡而難於消除）。未知樣品的加樣量見下表中的第8、9、10管。

b、加完試劑2-5分鍾後，即可開始用比色皿，在分光光度計上測定各樣品在595nm處的光吸收值a595，空白對照為第1號試管，即0.1ml水加5.0mg—250試劑。

注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用後立即用少量95%的乙醇盪洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長時間浸泡。

考馬斯亮蘭法實驗表管號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 標准蛋白質 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 (1.0mg/ml) 未知蛋白質 0.02 0.04 0.06 (約1.0mg/ml)

蒸餾水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考馬斯亮藍 g－250試劑 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中的蛋 白質量（mg） 光吸收值 （a595）

c、用標准蛋白質量（mg）為橫座標，用吸光度值a595為縱座標，作圖，即得到一條標准曲線。由此標准曲線，根據測出的未知樣品的a595值，即可查出未知樣品的蛋白質含量。 0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的a595約為0.50。

（2）微量法 當樣品中蛋白質濃度較稀時（10－100mg/ml）,可將取樣量（包括補加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白對照則分別為0.5ml或1.0ml水，考馬斯亮藍g－250試劑仍加5.0ml，同時作相應的標准曲線，測定595nm的光吸收值。 0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的a595約為0.29。

『拾』 蛋白質含量測定的標准方法

測定蛋白質的方法可分為兩大類：一類是利用蛋白質的共性，即含氮量、肽鍵和折射率測定蛋白質含量；另一類是利用蛋白質中特定氨基酸殘基、酸性和鹼性基團以及芳香基團等測定蛋白質含量。常見的方法有：凱氏定氮法、雙縮脲法、酚試劑法及紫外吸收法。
1.凱氏定氮法
准備4個50mL凱氏燒瓶並標號，想1、2號燒瓶中加入定量的蛋白質樣品，另外兩個燒瓶作為對照，在每個燒瓶中加入硫酸鉀-硫酸銅混合物，再加入濃硫酸，將4個燒瓶放到消化架上進行消化，之後進行蒸餾，全部蒸餾完畢後用標准鹽酸滴定各燒瓶中收集的氨量，直至指示劑混合液由綠色變回淡紫紅色，即為滴定終點，結算出蛋白質含量。
2.雙縮脲法
雙縮脲法是第一個用比色法測定蛋白質濃度的方法，硫銨不幹擾顯色， Cu2+與蛋白質的肽鍵，以及酪氨酸殘基絡合，形成紫藍色絡合物，此物在540nm波長處有最大吸收。首先利用標准蛋白溶液和雙縮脲試劑繪制標准曲線，將待測血清與硫酸鈉在待測試管中混合，並用只加入硫酸鈉不含血清的試管作為對照，將兩支試管加入等量的雙縮脲試劑，充分混合後於37℃環境中放置10分鍾，在540nm波長進行比色，以對照管調零，讀取吸光度值，由標准曲線上直接查出蛋白質含量。雙縮脲法常用於0.5g/L～10g/L含量的蛋白質溶液測定。
3.酚試劑法
取6支試管分別標號，前5支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，不加標准蛋白溶液，每支試管液體總量通過加入蒸餾水補足而保持一致，將液體混合均勻，在室溫下放置30分鍾，以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照，於650nm波長處測定各管中溶液的吸光度值
4.紫外吸收法
大多數蛋白質在280nm波長處有特徵的最大吸收，這是由於蛋白質中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用於測定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白質溶液。取9支試管分別標號，前8支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液，1號試管不加標准蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，而不加標准蛋白溶液，每支試管液體總量通過加入蒸餾水補足而保持一致，將液體混合均勻，在280nm波長處進行比色，記錄吸光度值。