制備蛋白質的步驟和方法實驗

Ⅰ 蛋白質的純化方法有那些呢具體步驟是什麼

蛋白質分離純化的一般程序可分為以下幾個步驟：

（一）材料的預處理及細胞破碎

分離提純某一種蛋白質時，首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放出來並保持原來的天然狀態，不喪失活性。所以要採用適當的方法將組織和細胞破碎。常用的破碎組織細胞的方法有：

1. 機械破碎法

這種方法是利用機械力的剪切作用，使細胞破碎。常用設備有，高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等。

2. 滲透破碎法

這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而破碎。

3. 反復凍融法

生物組織經凍結後，細胞內液結冰膨脹而使細胞脹破。這種方法簡單方便，但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質不宜採用此法。

4. 超聲波法

使用超聲波震盪器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。

5. 酶法

如用溶菌酶破壞微生物細胞等。

(二) 蛋白質的抽提

通常選擇適當的緩沖液溶劑把蛋白質提取出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據欲制備的蛋白質的性質而定。如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑（十二烷基磺酸鈉、tritonX-100等），使膜結構破壞，利於蛋白質與膜分離。在抽提過程中，應注意溫度，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質的變性。

（三）蛋白質粗製品的獲得

選用適當的方法將所要的蛋白質與其它雜蛋白分離開來。比較方便的有效方法是根據蛋白質溶解度的差異進行的分離。常用的有下列幾種方法：

1. 等電點沉澱法

不同蛋白質的等電點不同，可用等電點沉澱法使它們相互分離。

2. 鹽析法

不同蛋白質鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可通過調節鹽濃度將目的蛋白沉澱析出。被鹽析沉澱下來的蛋白質仍保持其天然性質，並能再度溶解而不變性。

3. 有機溶劑沉澱法

中性有機溶劑如乙醇、丙酮，它們的介電常數比水低。能使大多數球狀蛋白質在水溶液中的溶解度降低，進而從溶液中沉澱出來，因此可用來沉澱蛋白質。此外，有機溶劑會破壞蛋白質表面的水化層，促使蛋白質分子變得不穩定而析出。由於有機溶劑會使蛋白質變性，使用該法時，要注意在低溫下操作，選擇合適的有機溶劑濃度。

（四）樣品的進一步分離純化

用等電點沉澱法、鹽析法所得到的蛋白質一般含有其他蛋白質雜質，須進一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有：凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。有時還需要這幾種方法聯合使用才能得到較高純度的蛋白質樣品。

Ⅱ 植物蛋白質的提取方法

植物蛋白質的提取方法基本上有這幾種：鹽析法、有機溶劑法和等電點法。

1、鹽析法

原理：鹽析法是指在葯物溶液中加入大量的無機鹽，使某些高分子物質的溶解度降低沉澱析出，而與其他成分分離的方法。鹽析法主要用於蛋白質的分離純化。常作鹽析的無機鹽有硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。

2、有機溶劑法

原理：機溶劑引起蛋白質沉澱的主要原因是加入有機溶劑使水溶液的介電常數降低，因而增加了兩個相反電荷基團之間的吸引力，促進了蛋白質分子的聚集和沉澱。有機溶劑引起蛋白質沉澱的另一種解釋認為與鹽析相似，有機溶劑與蛋白質爭奪水化水，致使蛋白質脫除水化膜，而易於聚集形成沉澱 。

3、等電點法

原理：在等電點時，蛋白質分子以兩性離子形式存在，其分子凈電荷為零(即正負電荷相等)，此時蛋白質分子顆粒在溶液中因沒有相同電荷的相互排斥，分子相互之間的作用力減弱，其顆粒極易碰撞、凝聚而產生沉澱，所以蛋白質在等電點時，其溶解度最小，最易形成沉澱物。

等電點時的許多物理性質如黏度、膨脹性、滲透壓等都變小，從而有利於懸浮液的過濾。