㈠ 200分求科研實驗切片的操作
石蠟切片法 ：
石蠟切片法是以石蠟作包埋劑,用旋轉切片機將材料切成薄片,經一系列處理製成永久製片的方法.在研究植物的細胞,組織,胚胎以及形態等方面石蠟切片法是最理想的製片方法.
石蠟切片法的一般流程為:取材→固定→抽氣→洗滌→脫水→透明→浸蠟→包埋→修塊→切片→粘片→染色→封片.
取材
用鋒利的刀片切取新鮮的植物材料,選定適宜的材料,立即固定.
取材的注意事項如下:
(1)取材料要新鮮.動作要迅速,以免擠壓損壞組織;取病理材料時,應設置對照材料.
(2)所取材料大小要適當:根和莖一般直徑≤5mm,切取成5-10mm小段;葉片一般取過中脈處,切成2-5mm寬,5-8mm長.在切材料時,必須注意刀片與中軸成直角,兩切面平行,否則製成的切片細胞是斜的. 雌,雄蕊一般不需分割.
(3)取材時間可根據切片要求有所區別.如:在進行植物發育的研究過程時,需要找到細胞分裂相,一般在晴天的早晨9:00-10:00時取材,此時植物細胞分裂活動較明顯.
(4)取材不易過老,否則製片有難度(過老的材料須在滑走切片機上進行);對縱切的材料適當多取材,如根尖,莖尖等,因為切到材料正中的概率較低.
(二)固定
將已切好的材料盡快地浸入相當於材料10-15倍體積的固定液中.藉助固定液的作用,使細胞的新陳代謝瞬時停止,並保持細胞或組織的形態構造及其內含物的狀態不發生變化.從而達到使組織變硬從而便於切片,增強內含物的折光度,令細胞易於著色的目的,同時具有防腐作用.以新鮮配製固定液效果較好.固定的時間依材料的種類,性質,大小等而定.材料固定完畢,保存於加蓋的容器內,貼上標簽.
良好的固定劑,應是穿透力強,使細胞立刻致死,原生質全部凝固;不發生任何變形,增強折光率,並且不妨礙染色.
常用固定液:
簡單固定液 以一種化學葯品配製的固定液.
⑴ 乙醇 為凝固型固定劑.常用無水乙醇或95%乙醇.
⑵ 甲醛 為非凝固性固定劑.具強烈刺激性氣味.純凈的甲醛為無色透明液體.固定用的濃度為4%-10%.
⑶ 醋酸 為凝固型固定劑.為無色透明的液體,刺激性極強,低溫下凝結成冰,故又名冰醋酸.
2. 混合固定液:
由幾種試劑,適量配製而成.混合遵循原則:① 優缺點互補;② 膨脹與收縮相互平衡;③ 強氧化劑與還原劑應分別配置.
常用混合固定液有下列幾種:
⑴ FAA 固定液(福爾馬林-冰醋酸-乙醇) 廣泛適用於根,莖,葉,花葯,子房的組織切片,所以又稱為萬能固定液.一般固定時間不低於24 h.該固定液優點是在較低溫度下(10℃左右)適用於材料的長期保存,可兼作保存液.並且固定的材料,不妨礙染色,但用於細胞學上的固定效果較差.
⑵ 納瓦興(Navaschjn's)固定液 1912年首創.適用於細胞學與組織學研究的切片觀察.但滲透慢,不能長期保存;主要用於顯示分裂相.
(三)抽氣
植物材料內部多由於含有空氣,導致固定液不能完全深入.材料投入固定液後需要立即抽氣.以便讓固定液有效透入材料組織中,並排除材料內氣泡的干擾.
一般抽氣時間為20-30 min.抽過氣的材料在停止抽氣,應沉入底部.
(四)洗滌
固定液中的成分有可能會妨礙染色或發生沉澱或結晶,影響觀察;有的還會繼續作用,使材料變質等.因此,在使用材料時,需根據固定液的種類,用水,緩沖液或70%乙醇洗去滲入細胞內部的固定液.如:用FAA固定的材料在脫水時用70%乙醇反復洗滌數次.如用水洗滌,可將材料自固定液中取出,放入指形管,加入半管水,用紗布將管口扎緊,置於水槽內,進行流水沖洗.流水沖洗時間一般為12-24 h.
(五)脫水
材料經洗滌後含有部分水分,會使材料分解.而且透明劑與水是不相混合的,不利於材料的透明和包埋等後期處理.因此需用脫水劑逐漸除去材料中的水分,以便讓石蠟滲透進細胞.所以,脫水是製片的關鍵環節.脫水劑要求能與水混合,而且能與其他有機溶劑互相替代.
脫水必須在有蓋的玻璃器皿中進行,防止吸收空氣中的水分;在更換高一級的脫水劑時,最好不要移動材料,以免損壞材料.
(六)透明
透明劑要具有既能與脫水劑相混合又能和石蠟相混合的性質,可以將材料中的脫水劑置換出來,使石蠟能順利進入材料中.
二甲苯是目前應用最廣的透明劑,作用迅速,但易使材料變脆..
(七)浸蠟
是指逐步清除材料中的透明劑,以使石蠟充分滲透於材料內部的過程.這樣,材料的各部分都能保持原來的結構與位置,切片不致發生破裂或其他變形.
浸蠟是一個漸進的過程,常用的正丁醇.
每次浸蠟的時間,視材料大小而調節.
(八)包埋
材料經過足夠時間的浸蠟後,需包入蠟塊,以備切片.
操作方法:根據切片材料大小,確定所需紙盒的尺寸,用表面光滑的磅紙預先疊好紙盒.
(九)切片
即將包埋好的材料塊用切片機切成所需厚度的切片帶.
(十)貼片
是用黏貼劑把切片平鋪貼在載玻片上,以便於染色和觀察.
常用的粘片劑有下列二種:
(1) 明膠黏片劑
(2) 蛋清黏片劑
(十一) 染色
即根據植物細胞中不同的化學性質,用染料分別進行染色,以利於觀察切片中細胞與組織的形態與構造及其內含物等.染色基本程序為脫蠟,染色,分色封片.
染色方法可分為下列幾類:
① 單染 只用一種染料染色.
② 雙重染色 兩種染料染色,如番紅--固綠;蘇木精---曙紅.
③ 多重染色 多種染料染色,如番紅—固綠—桔紅G;酸性品紅—苯胺藍—桔紅G等.
(十二) 封藏
封藏於中性樹膠中,使材料能在顯微鏡下清晰地顯示出來,並能長期保存.
方法:將含材料的載玻片放在吸水紙上(切片一面向上),迅速地在切片的中央滴一滴樹膠(必須在二甲苯乾燥前進行),用右手持小鑷子輕輕地夾住蓋玻片的右側,稍微傾斜使其左側與封藏劑接觸,然後再緩慢地放下,避免產生氣泡.
冷凍切片法：
冷凍切片的製作方法
（1）低溫恆冷箱冷凍切片製作法
1．本室現有Shandon As 620 E型恆溫箱冷凍切片機的主要性能。該機的箱面上有電子控制板，裝有即時冷凍鍵和除霜鍵，啟動即時冷凍鍵，機器馬上進行工作狀態，並可持續10mins。啟動即時除霜鍵，可將工作間頂部後面的製冷柵上的霜除掉，並可持續15mins。有照明鍵一個，啟動該鍵可照明工作間，有利工作及觀察組織的冰凍狀況。配有消毒鍵一個，當進行一周的工作或者一天的工作後，啟動該鍵，可對工作間進行消毒。當每天工作完畢時，可啟動密鎖鍵，鎖住工作間。除此之外，箱面的左邊有四個按鍵，兩個為快速自動進退鍵，兩個為微小進退鍵，還有一個手動旋鈕，調節修組織塊時的進退。
冷凍箱內左邊的冷凍台，溫度可達-60℃左右，冷凍箱的中間為一台切片機，工作間的溫度在0-30℃間可任意調節，並在箱面上的熒屏顯示出來。
2．操作方法及步驟：
①取材，未能固定的組織取材，不能太大太厚，厚者冰凍費時，大者難以切完整，最好為24×24×2mm。
②取出組織支承器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放於冷凍台上，冰凍。小組織的應先取一支承器，滴上包埋劑讓其冷凍，形成一個小台後，再放上細小組織，滴上包埋劑。
③將冷凍好的組織塊，夾緊於切片機持承器上，啟動粗進退鍵，轉動旋鈕，將組織修平。
④調好欲切的厚度，根據不同的組織而定，原則上是細胞密集的薄切，纖維多細胞稀的可稍為厚切，一般在5～10um間。
⑤調好防卷板。製作冰凍切片，關鍵在於防卷板的調節上，這就要求操作者要細心，准確地將其調較好，調校至適當的位置。切片時，切出的切片能在第一時間順利地通過刀防卷板間的通道，平整地躺在持刀器的鐵板上。這時便可掀起防卷板，取一載玻片，將其附貼上即可。
⑥應視不同的組織選擇不同的冷凍度。冷凍箱中冷凍度的高低，主要根據不同的組織而定，不能一概而論。如：切未經固定的腦組織，肝組織和淋巴結時，冷凍箱中的溫度不能調太低，在-10- -15℃左右，切甲狀腺、脾、腎、肌肉等組織時，可調在-15～20℃左右，切帶脂肪的組織時，應調至-25℃左右，切含大量的脂肪時，應調至-30℃。
3．冰凍切片時的注意事項：
①防卷板及切片刀和持刀架上的板塊應保持干凈，需經常用毛筆挑除切片殘余和用柔軟的紙張擦。有時需要每切完一張切片後就用紙擦一次。因為這個地方是切片通過和附貼的地方，如果有殘余的包埋劑粘於刀或板上，將會破壞甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。
②多例多塊組織同時需做冰凍切片時，可各自放於不同的支承器上，於冷凍台上凍起來，然後依據不同的編號，依序切片，這樣做既不費時也不會亂。
③放置組織冰凍前，應視組織的形狀及走勢來放置，所謂「砍柴看柴勢」，切片也是如此，如果胡亂放置，就不能收到很好的效果。
④組織塊不須經各種固定液固定，尤其是含水的固定液，在未達到固定前，更不能使用。臨床快速冰凍切片，不須要預先固定，一是為了爭取時間，二是固定了的組織，反而增加了切片的難度。如果使用未完全固定的組織做冰凍切片，就會出現冰晶。這是因為含水的固定液在組織未經固定前，其中的水份也可滲入到組織中去，當冰凍發生時，這些水份就存留於組織中，形成了冰晶。
⑤當切片時，如果發現冰凍過度時，可將冰凍的組織連同支承器取出來，在室溫停留片刻，再行切片，或者用口中哈氣，或者用大拇指按壓組織塊，以此來軟化組織，再行切片。另者，調高冰凍點。
⑥用於附貼切片的載玻片，不能存放於冷凍處，於室溫存放即可。因為當附貼切片時，從室溫中取出的載玻片與冷凍箱中的切片有一種溫度差，當溫度較高的載玻片附貼上溫度較低的切片時，由於兩種物質間溫度的差別，當它們碰撞在一起時，分子彼此間發生轉移而產生了一種吸附力，使切片與載玻片牢固地附貼在一起。如果使用冷藏的載玻片來附貼切片，由於溫度相同，沒有發生上述的現象。
4．冰凍切片的快速染色法
冰凍切片附貼於載玻片後，立即放入恆冷箱中的固定液固定1分鍾後即可染色。以往，為了防止切片脫落，當切片附貼於載玻片後，即用電吹風吹乾後再固定。根據實驗對比認為這種做法欠妥未經固定的切片，強熱作用後，蛋白發生變性，核內含有的物質由於熱的作用融合在一起，染色後鏡下分辨不出核內的各種物質。冰凍切片附貼於載玻片後，立即放入恆冷箱中的固定液固定，這樣可以使切片中細胞內各種物質都在沒有任何變化的情況下被固定起來，經一年多來1000例冰凍切片的製作實踐認為這樣製作固定切片好，核染色質清晰，核仁明顯，其他物質都完好保存。
方法：
① 切片固定30秒－1分鍾。
② 水洗。
③ 染蘇木素3－5分鍾。
④分化。
⑤ 於鹼水中返藍20秒。
⑥ 伊紅染色10－20秒。
⑦脫水，透明，中性樹膠封固。
冰凍組織1－2分鍾，切片1分鍾，固定1分鍾，染色共五分鍾。總共在10分鍾內完成快速製片過程，結果與石蠟切片不相上下。
冰凍切片的方法還有很多種，如甲醇循環的半導體冰凍切片法，二氧化碳冰凍切片法，半導體冰凍切片法和氯乙烷冰凍切片法等，這些方法在目前來說已很少使用，因此在這里不作闡述。
㈡ 求各種生物學染色法
（1）巴氏染色法：本法染色特點是細胞具有多色性顏色，色彩鮮艷多彩。塗片染色的透明性好，胞質顆粒分明，胞核結構清晰，如鱗狀上皮過度角化細胞胞質呈橘黃色；角化細胞顯粉紅色；而角化前細胞顯淺綠色或淺藍色，適用於上皮細胞染色或觀察陰道塗片中激素水平對上皮細胞的影響。此方法的缺點是染色程序比較復雜。
（2）蘇木精—伊紅（hemotoxylin eosin,HE）染色法：該方法染色透明度好，核與胞質對比鮮明。染色步驟簡便，效果穩定。適用於痰液塗片，觖質核呈紫藍色，胞質淡玫瑰紅色，紅細胞呈淡硃紅色。
（3）瑞特—吉姆薩染色法（wrightgiemsaatain）；本方法多用於血液，骨髓細胞學檢查。胞質內顆粒與核安危質結構顯示較清晰。操作簡便。
㈢ 觀察細胞骨架的方法有哪些
一種簡單的方法就是通過用細胞鬆弛素b處理阻止肌動蛋白的聚合，觀察細胞骨架只解聚，不聚合從而反映骨架是動態裝配的；
也可以通過放射性標記的某種氨基酸處理細胞，觀察處理後原本的細胞骨架中是否會出現放射性，如果出現則說明是後期動態置換上去的；
或者將一種經過基因工程手段改造的含標記有熒光蛋白細胞骨架的細胞，與普通細胞進行細胞融合，觀察是否會出現雜合的細胞骨架；
發揮想像，應該還有很多其他的方案。