❶ 生物製片的基本步驟
一 目的：
1.學習並掌握臨時裝片的製作方法。
2.完成基本實驗要求的基礎上，依自己的興趣，製作更多的臨時裝片
二 背景知識（點擊展開）
三 實驗內容
製作洋蔥表皮細胞臨時裝片
四 實驗用品
滴管、紗布、鑷子、吸水紙、載玻片、蓋玻片、清水、刀片、染液（碘液）
五 實驗材料
洋蔥表皮細胞、其他感興趣的生物材料
六 實驗步驟
1．擦拭載玻片、蓋玻片（動畫）
2．在載玻片的中央滴一滴清水（動畫）（圖zx-21）
3．在洋蔥內表皮用刀片劃出一個約1cm2的正方形（在使用刀片時注意安全），用鑷子撕取洋蔥內表皮（動畫）（圖zx-22）
4．將內表皮置於載玻片的清水中，並使之鋪開（動畫）（圖zx-23）
5．從一側開始慢慢蓋上蓋玻片，不能有氣泡產生（動畫） （圖zx-24）
6．在蓋玻片的一側滴一滴染液（動畫）
7．然後用吸水紙從另一側吸取多餘的染液，使洋蔥表皮細胞均勻染色（動畫）
8．顯微鏡下觀察。（圖zx-25）
染色後的洋蔥細胞(示細胞核)（圖）
顯微鏡使用的注意事項
1．搬動顯微鏡時，要一手握鏡臂，一手扶鏡座，兩上臂緊靠胸壁。切勿一手斜提，前後擺動，以防鏡頭或其他零件跌落。
2．觀察標本時，顯微鏡離實驗台邊緣應保持一定距離(5cm)，以免顯微鏡翻倒落地。鏡柱與鏡臂間的傾斜角度不得超過45度，用完立即還原。
3．使用時要嚴格按步驟操作，熟悉顯微鏡各部件性能，掌握粗、細調節鈕的轉動方向與鏡筒升降關系。轉動粗調節鈕向下時，眼睛必須注視物鏡頭。
4．觀察帶有液體的臨時標本時要加蓋片，不能使用傾斜關節，以免液體污染鏡頭和顯微鏡。
5．粗、細調節鈕要配合使用，細調節鈕不能單方向過度旋轉，調節焦距時，要從側面注視鏡筒下降，以免壓壞標本和鏡頭。
6．用單筒顯微鏡觀察標本，應雙眼同時睜開，左眼觀察物像，右眼用以繪圖，左手調節焦距，右手移動標本或繪圖。
7．禁止隨意擰開或調換目鏡、物鏡和聚光器等零件。
8．顯微鏡光學部件有污垢，可用擦鏡紙或綢布擦凈，切勿用手指、粗紙或手帕去擦，以防損壞鏡面。
9．凡有腐蝕性和揮發性的化學試劑和葯品，如碘、乙醇溶液、酸類、鹼類等都不可與顯微鏡接觸，如不慎污染時，應立即擦乾凈。不要任意取下目鏡，謹防灰塵落入鏡筒。
10．使用油鏡觀察樣品後，隨即用二甲苯將油鏡鏡頭和載波片擦凈，以防其他的物鏡玻璃上沾上香柏油。二甲苯有毒，使用後馬上洗手。
11．實驗完畢，要將玻片取出，用擦鏡紙將鏡頭擦拭乾凈後移開，不能與通光孔相對。用綢布包好，放回鏡箱。切不可把顯微鏡放在直射光線下曝曬。
顯微攝影操作的重要注意事項
1.攝影者對顯微攝影裝置的調整：包括兩目鏡瞳孔間距的調整和個人屈光不正的校正。前者指將兩目鏡的距離按個人的瞳孔間距進行調整，拉動目鏡或捻轉瞳孔間距調節螺旋。校正屈光時應轉動目鏡筒上的屈光度調節環，使物鏡視野中心的「十」字由單線調成雙線，達到完全清晰，並且左右眼應分別調整。每個拍攝者都不宜省略這一步。
2.物鏡與攝相目鏡不同組合的選擇：攝影目鏡除放大功能外，並不具備空間分辨功能，只有物鏡才具有空間分辨力。在一般條件下，對組織切片厚度在20 μm以下者，應盡量選擇較高倍物鏡，例如欲放大實物50倍時，選擇「20×」物鏡配以「2.5×」目鏡的組合方式，其清晰度比「10×」物鏡及「5×」目鏡的組合方式要高些。但是也要考慮切片薄厚和觀察標本的特異性的問題，例如在厚度為30 μm以上的冰凍切片上，觀察蜿蜒走行的神經纖維或血管時，由於較低倍物鏡的焦點深度較長，有利於從不同深度、層次或角度，連續觀察分析不在同一平面上走行的神經或血管影像。在這種情況下，還可將物鏡與目鏡不同組合多次拍攝，最終擇其效果最佳者。
3.聚光器的調控使用問題：經驗較少的攝影者往往缺少對聚光器高度的調節，也不知光源是否偏離視野中心。不少人只進行了物鏡與組織切片間的所謂「上聚焦」，而沒有進行聚光器與組織切片間的「下聚焦」，這當然也無法獲得最佳清晰度的成像底片。 Kohler 照明法操做步驟如下：①將視場光闌縮至最小，使光闌葉片的通孔呈現其八角形影像；②兩手分別捻轉載片台下的左右定心螺絲，使光闌影像與視場中心圓圈重合，以校正光路；③調節聚光器高度，使八角形光闌影像由模糊變清晰，即「下聚焦」；④散大該光闌至135幀幅邊框（指常規135型負片畫幅，24 mm×36 mm）影像外周。再次微調聚光器高度，使光闌象最清晰為止。每變換一次放大倍率時，都要重復進行如上調整步驟。
4.提高攝影反差：組織結構對比反差的好壞，當然取決於組織制備技術的質量。這是提高顯微攝影質量的重要環節。但是一般情況下，為了彌補切片中對比反差的不足，常可採用如下的補救措施：①按照物鏡上的數值孔徑值即NA值，相應地進行聚光器孔徑光闌的匹配調節。一般質量優良的物鏡鏡頭上，除標有放大倍率外，同時還標有NA值，NA值越大者空間解析度相對越高。②如果按此法調節NA值轉盤後，若由於組織制備欠佳致使影像反差仍然不足時，則可將物鏡孔徑光闌的NA值再適當縮小，例如10x物鏡可調至0.19等。③如經過上述措施影像反差仍不好，則可將視場光闌從135（指常規135照片畫幅24 mm×36 mm）邊框外縮至邊框內，然後在暗室擴放時，再將視場光闌影像除去。當然，上述的後兩種措施，只不過是一種稍作修正的補救辦法而已。
5.低倍攝影難度大：低倍攝影有其特殊優點，例如在1（物）×2.5（目）放大倍率下，可拍攝大鼠腦切片一側全貌，對總覽特異性標記物的分布有一目瞭然之效果，但是低倍物鏡分辨力低，焦深較長，利用微調螺旋進行精確聚焦有一定難度。為避免視力的個體差異,應採取欠焦、過焦、正焦3步,聚焦不宜反復進行。
6.油浸鏡頭的使用：100×的物鏡多為油浸鏡頭，然而，使用後常因鏡頭擦不凈而使鏡頭受損。替代的辦法是滴加超純水或雙蒸水，觀察效果與香柏油差別不大。由於100×物鏡鏡頭與切片距離極近，極易碰損鏡頭，必須先以40×物鏡聚焦，再轉至100×物鏡，輕輕轉動聚焦微調螺旋至焦點。為避免鏡頭損傷，新型100×物鏡常有彈簧裝置，可使鏡頭微動伸縮而避免其損傷。
7.其它注意事項: ①按照常規,彩色膠卷應加LBD（色溫變換）濾片,黑白膠卷應加IF550（綠色）濾片。LBD濾片可使日光型彩卷獲得最佳色溫補償，IF550 濾片則可使黑白卷分光感度與人眼者接近。盡管有人認為不一定需要濾光處理，但因為攝影取決於膠片的化學感光度，並不取決於人們眼睛對視野的直觀感受，還是加濾光片為好。②曝光時間的選定，也是一個必需注意的問題。已知在光強與曝光時間兩個參數之間，有許多不同的組合，均在曝光的「安全」范圍內，但所謂的「安全」范圍，並不等於最佳條件，所以作者認為限定曝光時間還是十分必要的，其道理在於膠卷化學感光度有一定限制，一個膠卷36個幀幅若隨意變動曝光時間，在36張之間差異將很大，而沖洗膠卷是在同一條件下，難免有些幀幅顯影不佳。依據作者的經驗，曝光時間一般限定在0.5～1 s，底片的影像效果較佳。③要將重點拍攝的結構置於視場中心，因為自動曝光裝置測得的曝光時間，是以視場中心區為標准，而偏離中心區越遠越不準。有時為了兼顧結構局解關系，而重點結構又不在視場中心時，則可採取點（spot）曝光法。④若需將一張切片上的結構拍為幾張,之後拼接時,可在New Vanox 顯微攝影儀器上設有一個鎖定鍵（lock），有利於解決這一問題，以使同一結構的幾個幀幅曝光時間一致，然後在洗照片時將這組照片同時放入顯影液與定影液。