植物幼苗花青素的提取方法和步驟

『壹』 花青素的純化方法

原花青素(簡稱PC)是植物界中廣泛存在的一大類多酚類化合物。植物化學家通常將從植物中 分離得到的一切無色的，在無機酸存在和加熱處理下能產生紅色的花青素(cyanidin)的一類多酚化 合物統稱為原花青素。從20世紀60年代初至今，原花青素抗氧化、清除自由基等一系列化學反應已 被初步揭示，這類天然產物在醫葯、食品、日用化 學品等領域的應用日益廣闊。全世界對原花青素的研究越來越深入，其中對原花青素提取、分離、純 化方法的研究是一大重點，現將原花青素提取、分 離、純化方法綜述如下。

1 原花青素的提取方法

植物材料中原花青素的提取率與材料的狀況和 提取條件密切相關。植物材料的貯存、乾燥、粉碎 度，提取溶劑、溫度等都可能導致原花青素化學結 構的變化和提取率的改變，從而改變原花青素的理化性質和生物活性.

當測定原材料中的原花青素含量時，貯存時間 越長，可能會導致測定結果降低。同時樣品中的水 分含量也會導致測定結果降低。而且乾燥條件的不 同也會導致提取率的變化，最好是採用冷凍乾燥， 避免高溫。

樣品提取前一般要經過粉碎，通常較細的粉末 有利於提取，但過細時提取率反而會降低。

提取劑的選擇也是影響提取率的關鍵因素。因 為原花青素在植物體內通常與蛋白質、多糖等以氫 鍵和疏水鍵形式形成穩定的分子復合物，原花青素 分子間也是如此。因此原花青素的提取劑，不僅要 求對其有很好的溶解性，而且還必須有氫鍵斷裂作 用。因此有機溶劑和水的復合體系(有機溶劑占總 體積的50％～70％)最適合提取。有機溶劑的提 取能力順序為丙醇<乙醇<甲醇<丙酮<四氫呋喃，其中應用較多的是丙酮一水體系和甲醇一水體 系。

當植物樣品中鐵等金屬離子含量較大時，原花 青素在中性條件下與金屬離子發生絡合沉澱，沉積 在纖維中不利於提取。此時也必須採用酸化溶劑， 一方面斷裂原花青素與蛋白質、多糖及本身離子間 的氫鍵和疏水鍵，另一方面斷裂原花青素一金屬離 子絡合鍵，提高提取率。

1．1 傳統有機溶劑提取

Ayroles等在1991年發明酮類化合物水溶液作 提取劑提取銀杏葉中的原花青素的方法。採用酮類化合物的水溶液作提取劑，提取液過濾後，用鹼調 節濾液pH值至9左右，使原花青素沉澱，再用酸 調節濾液至pH值為2左右，在(NH4) SO 存在條件下用c ～c 酮類萃取濾液中的原花青素，除去酮類 化合物，乾燥。

Romanczyk等發明從可可中提取原花青素時， 對脫脂可可豆用質量分數70％MeOH／去離子水提 取後，再用質量分數70％丙酮／去離子水溶劑提取 2次，真空濃縮，除去有機溶劑後，再溶於水中， 用CHC1，提取，其水相用乙酸乙酯提取後，真空濃 縮除去乙酸乙酯，水相冷凍乾燥，得到原花青素。

1．2 綠色溶劑—— 水提取技術

由於丙酮等有機溶劑可能帶來環境污染和產品 的有毒有機物殘留，人們在大力發展對環境友好的綠色提取技術。1998年Duncan和Gilmour發明一 種從植物材料(樹皮、樹葉、葡萄籽、皮、大豆、綠茶)中提取原花青素的方法。將材料粉碎(≤15 mm)，常壓、60℃～100℃或高壓100℃～125℃條 件下採用脫氧熱水提取(1 min～20 h)，過濾採用超濾 或反滲透或兩者連用，濃縮濾液，真空噴霧或冷凍 乾燥，此法主要是提取分子量≤5 000 D的水溶性原花青素，得率為0．5％～10．0％之間，通常為6．5％ 一9．6％ (隨取樣部位的差異而定)，分離得到原花 青素B 、B，、B 和c 。獲得的產物對AAPH引發 的亞油酸的氧化有明顯抑製作用，1肛g／mL能達 到70％～79％的抑制率。毒理學檢測表明：對於按人體重劑量給葯組和100倍人體重量的劑量給葯組 24 h內無毒害和副作用產生，慢性毒理學(5個月) 實驗也無明顯毒、副作用。

1999年Karim等人發明了在加壓條件下，採用 脫氧去離子水提取植物材料中的原花青素。將提取 液超濾後，採用疏水性微孔聚合物樹脂作填料的柱 色譜方法，選用極性洗脫液(乙醇+水)洗脫，將 洗脫液採用反滲透方法除去乙醇，乾燥得到原花青素。

1．3 超臨界流體萃取技術

孫傳經等發明一種採用超臨界二氧化碳加丙酮 和水組成的極性改性劑，從銀杏葉中萃取含有原花青素提取物的方法。在萃取溫度60℃～90℃，萃取 壓力20 MPa～35 MPa下加入丙酮與水的體積比為 (50％～80％)：(50％～20％)的極性改性劑，萃 取時向2 h-4 h，進行靜態、動態萃取。萃取液經傳統的樹脂濃縮和噴霧乾燥器乾燥，得到精製銀杏葉 提取物。產品含銀杏黃酮甙>35 g／100 g，萜內酯> 8 g／100 g，原花青素<7 g／100 g，酚酸<5 mg／kg。該法的優點是流程短，能萃取最強的天然抗氧化劑原花青素。2000年孫傳經等又發明一種超臨界CO 從黑加侖籽中提取黑加侖籽油和原花青素低聚物的方法。該法分兩步進行：第一步，是利用超臨界 CO 提取黑加侖籽油，控制萃取壓力在25 MPa一 29 MPa，溫度為60℃ ；第二步是超臨界CO2加人 丙酮與水的體積比為70：30的改性劑，CO 與改性 劑流量體積比為4：1，壓力為22 MPa～25 MPa，溫度為60℃，提取原花青素低聚物。黑加侖籽油得 率為16％，原花青素低聚物得率為4％。該法優 點是同時獲得兩種產品，流程簡單可靠，CO 和改 性劑循環利用，產品中無溶劑殘留，對環境無污 染。

1．4 微波提取技術

劉征濤等發明了一種採用頻率為2450 MHz或 915 MHz、功率為500 W～15 000 W 的微波對葡萄籽 在選用水、碳鏈長為C ～C，的醇、乙醚、丙酮、乙 酸乙酯、甲苯或其混合物的溶劑中進行處理，從葡 萄籽提取原花青素類物質的新方法。該方法較常規 化學法工藝簡便、高效、快速，成本低，廢液排放 量少。

1．5 雙水相萃取方法

自1956年瑞典倫德大學的Albertsson發現雙水 相體繫到1979年德國GBF的Kula等人將雙水相萃取分離技術應用於生物產品分離，雖然只有20多 年歷史，但由於其條件溫和，容易放大，目前已成 功地應用於蛋白質、核酸和病毒等生物產品的分離純化。近幾年來，有關雙水相萃取技術提取中草葯 有效成分的文獻開始報道，盡管數量不多，但是已 有的實例充分表明其有良好的應用前景。用雙水相萃取體系富集分離銀杏葉浸提液的研究，表現良好 的分配系數和分離效果。研究認為雙水相體系具有 分相快，使用溫度低，易於操作等待點，且所使用的PEG及鹽類對人體及環境無毒害，萃取率高，為 銀杏黃酮化合物富集分離的一種有效方法。盡管雙 水相萃取對中草葯提取研究的應用處於起步階段，這一技術的應用有望為從天然產物中提取有效成分 提供一個新的思路。

2 原花青素的純化、分離

2．1 液相萃取法

原花青素的純化多採用乙酸乙酯、甲苯、二氯 甲烷、醚等多級有機溶劑通過液相萃取的方法進行，這類方法因為有機溶劑用量大，對環境可能帶 來污染，同時也容易造成產品中有毒有機物殘留。

2-2 柱層析法

目前常採用的純化方法多用柱層析法進行。王 建清等對大麥中的原花青素丙酮提取液，採用 PVPP樹脂作柱層析的填料，以CH CN作流動相進 行純化。

Ricardo da silva等將葡萄用甲醇提取，提取液 回收甲醇後，通過聚醯胺柱進行初步分離，先用中 性水洗去酚酸，再用體積比30：70的乙腈／水洗脫 兒茶素，再用體積比75：25丙酮水洗脫原花青素， 進行純化。

劉睿等採用大孔樹脂對高粱中的原花青素用乙醇 的水溶液進行純化，得到產物純度大於95 g／100 g的 低聚體原花青素。

2．3 固相萃取法

從復雜體系中選擇性地萃取所需成分，固相萃 取(SPE)是其中最為有效的方法之一。1999年 Lazarus等人對杏仁皮、葡萄汁和紅葡萄酒中的原花 青素採用SPE方法進行純化，條件：supelcosil Envi一18 20mL SPE柱，流動相：丙酮：水：乙酸= 70：29．5：0．5 (體積比)。Kennedy和Waterhouse 對紅葡萄酒中的原花青素採用c一18柱(Alhech)， 流動相：水和甲醇。洗脫除去有機酸、糖類和其他 不溶於有機相中的化合物而將提取得到的原花青素 進行純化。

2，4 凝膠色譜法

凝膠色譜也常用於原花青素的純化。 SephadexLH一20是一種對黃酮類化合物具有高度親 和性的羥丙基化葡聚糖凝膠，Sephadex LH一20凝 膠色譜目前多用於原花青素的純化和分離。但 Sephadex LH一20凝膠的物理特性決定其並不能對原花青素進行高效率分離。所以進一步的純化和分離 要採用凝膠過濾色譜或HPLC進行。

此外，Sepherdex 75HR作為平均粒度為13 m 的葡聚糖聚合物，也用於原花青素的純化、分離， 其能承受超過1．8 MPa的反壓，盡管這種材料的商業 柱通常用於蛋白質的分離，發現其分離原花青素的 能力優於Sephadex LH一20。McMurrough和Madigan 將大麥提取液濃縮後，直接採用高效凝膠過濾色譜 (Sepherdex 75HR)，用甲醇洗脫，根據uV檢測， 收集洗脫物，用DMACA鑒定每個組分。Escribano— Bail 6 n et al採用Sephadex LH一20和半制備RP—HPLC對葡萄籽中的原花青素進行純化。

Rigaud等對可可和葡萄籽的提取物，採用凝膠 滲透色譜(GPC)TSK G 2500 Hxl和TSK G3000 Hxl， 採用四氫呋喃(流速1 mL／min)洗脫進行純化。

2．5 微生物發酵法

Ariga等發明一種由活性酵母，可將用水和有 機溶劑提取得到的提取物中的澱粉發酵除去而達到 純化原花青素的目的；同時還發現純化的原花青素 中金屬離子也能較好的被除去，如果提取劑是水和 水／乙醇，能直接濃縮後發酵，若提取劑是丙酮， 則要除去丙酮後才能進行發酵。常用的酵母有：葡 萄酒酵母、酵母屬和接枝酵母屬的菌株。

2．6 高速逆流色譜法

高速逆流色譜技術由美國國家醫學院Ito Yiochiro 博士20世紀60年代首創，最初是一種制備型色譜技術，是一種不用固體載體或支撐體的液液分配色 譜，主要根據化合物在不相溶的兩相間的分配能力 進行分離，具有分離效率高，產品純度高，不存在載體對樣品的吸附和污染，制備量大，溶劑消耗 少，而且操作條件簡單(室溫、Teflon惰性柱材) 的特點。目前已被廣泛用於天然葯物材料的制備和分析。

目前高速逆流色譜儀已成功開發出分析型和制 備型兩大系列。即高速逆流色譜儀既可用於天然葯 物成分的制備分離，又可定量。進樣量從幾毫克到克，進樣體積從幾毫升到幾十毫升，不但適於非極 性化合物的分離，也適用於極性化合物的分離，既 適合於天然產物功效成分的粗分，也可進一步精製、純化。

2-7 分子烙印技術

分子烙印技術(molecular imprinting technology， MIT)是20世紀末出現的一種高選擇性分離技術，由於MIT模仿了生物界的鎖匙作用原理，使制備的 材料具有極高的選擇性，因而很快在許多相關領域 如手性分離和底物選擇性分離、固相萃取、化學或生物感測器、不對稱催化和模擬酶等方面得到了應 用。在普通分離方面，較之傳統方法，MIT法具有 高效、快速、專一的優點。MIT法在手性分離方面的作用更是無與倫比。據統計，現有葯物60％具 有一個或一個以上的手性中心，而對映體間的葯效 及對人體影響有很大不同，因此1992年美國食品和葯物管理局規定，今後含不對稱中心的葯物必須 將光學異構體分離開。相對於傳統方法的一籌莫展，MIT法就顯得非常珍貴了。P>

周力等人在2002年制備了以槲皮素為模板的 分子烙印聚合物(MIP)，從沙棘粗提物中分離提取槲皮素和異鼠李素兩種黃酮，得到良好的分離效果。 謝建春等用非共價法，在極性溶劑中、以丙烯醯胺 作功能單體，以強極性化合物槲皮素為模板，制備了分子烙印聚合物(MIP)。液相色譜實驗表明，MIP 對懈皮素具有特異的親合性，將此MIP直接分離銀杏葉提取物水解液，得到主要含模板槲皮素及與槲 皮素結構相似化合物山奈酚兩種黃酮的組分。研究 證實了MIP技術用於直接分離、提取中草葯中具有特定葯效化合物的可行性。

『貳』 如何提取花青素

花青素，是一種熱敏性活性物質。屬於水溶性多酚黃酮類化合物，其特殊的結構和化學成分賦予了花青素多種生物活性，這些活性物質對溫度較為敏感，當所在環境溫度超過一定界限後，就會失活，也就是我們俗話說的死掉。（比如我們都知道，乳酸菌、益生菌等都屬於熱敏性活性物質，不能加熱，否則失去活性就會失去其主要作用。）花青素失活就會失去其特有的功效作用。
有機溶劑萃取法
這是目前國內外最廣泛使用的提取方法。多數選擇甲醇、乙酮、丙酮等混合溶劑對材料進行溶解過濾，通過調節溶液酸鹼度萃取濾液中的花青素。國內吳信子等用鹽酸一甲醇溶液提取，然後用紙層析法(中號)和柱層析法(聚乙醯胺)進行花色苷的分離 。目前，有機溶劑萃取法已成功地應用於諸如葡萄籽、石榴皮、藍莓等絕大多數含花青素物質的提取分離。有機溶劑萃取法的關鍵是選擇有效溶劑，要求既要對被提取的有效成分有較大溶解度，又要避免大量雜質的溶解。該方法原理簡單，對設備要求較低，不足之處是大多數有機溶劑毒副作用大且產物提取率低。
2水溶液提取法
有機溶劑萃取的花青素多有毒性殘留且生產過程環境污染大，有鑒於此，水溶液提取應運而生。該方法一般將植物材料在常壓或高壓下用熱水浸泡，然後用非極性大孔樹脂吸附；或直接使用脫氧熱水提取，再採用超濾或反滲透，濃縮得到粗提物。它是Duncan和Gilmour(1998)發明的提取花青素的方法 ，此方法設備要求簡單，但產品純度低。
3超臨界流體萃取法
超臨界流體萃取是利用壓力和溫度對超臨界流體溶解能力的影響進行提取。這種方法產品提取率高，但設備成本過高。孫傳經 採用超臨界CO：萃取法從銀杏葉、黑加侖籽及葡萄籽中提取花青素工藝進行了研究。該工藝中CO 和改性劑可循環使用，對環境無污染。

『叄』 如何提取花青素

藍曉科技花青素提取樹脂介紹

花青素提取純化方法較多，但受保健食品與化妝品行業對原料溶劑殘留的嚴格限制要求，目前行業使用較為普遍的是水提+大孔吸附樹脂吸附的工藝，即將植物原料在常壓或高壓下用水浸提，經必要的過濾預處理後，提取清液採用非極性大孔吸附樹脂吸附富集，再用乙醇解吸。

為了達到更好的分離純化效果，需要選擇不同類型的吸附樹脂進行富集純化，藍曉科技在多年的花青素樹脂分離純化研究與工業實踐過程中，自主研發出了適用不同原料進行花青素提取的樹脂系列：

▲XDA-6和LSA-12 主要應用於越橘、黑加侖、藍莓、漿果類來源花青素等提取。

▲LSA-10 主要用於葡萄籽、松樹皮、花生衣等來源花青素提取。

▲LX-32 主要用於紫薯、紫甘藍、蘿卜等蔬菜類來源花青素的提取。

『肆』 如何證明花青素的存在

如何證明花青素的存在？

花青素是一種水溶性色素，可以隨著細胞液的酸鹼改變顏色。細胞液呈酸性則偏紅，細胞液呈鹼性則偏藍。花青素(anthocyanins)是構成花瓣和果實顏色的主要色素之一。經由苯基丙酸類合成路徑(phenylpropanoid pathway)和類黃酮生合成途徑(flavonoids biosynthetic pathway)生成。影響花青素呈色的因子包括花青素的構造、pH値、共色作用(copigmentation)等。果皮呈色受內在、外在因子和栽培技術的影響。光可增加花青素含量；高溫會使花青素降解。花青素為植物二級代謝產物，在生理上扮演重要的角色。花瓣和果實的顏色可吸引動物進行授粉和種子傳播 (Stintzing and Carle, 2004)。常見於花、果實的組織中及莖葉的表皮細胞與下表皮層。部分果實以顏色深淺決定果實市場價格。花青素屬於酚類化合物中的類黃酮類(flavonoids)。基本結構包含二個苯環，並由一3碳的單位連結(C6-C3-C6)。花青素經由苯基丙酸路徑和類黃酮生合成途徑生成，由許多酵素調控催化。以天竺葵色素(pelargonidin)、矢車菊素(cyanidin)、花翠素(delphinidin)、芍葯花苷配基(peonidin)、矮牽牛苷配基 (petunidin)及錦葵色素(malvidin)六種非配醣體(aglycone)為主。花青素因所帶羥基數(-OH)、甲基化(methylation)、醣基化(glycosylation)數目、醣種類和連接位置等因素而呈現不同顏色 (范和邱, 1998)。顏色的表現因生化環境條件的改變，如受花青素濃度、共色作用、液胞中pH値的影響 (Clifford, 2000)。本文目的為了解影響花青素生合成的因子，以作為田間栽培管理的參考。
橙色和黃色是胡蘿卜素的作用。1910年在胡蘿卜中發現了β-胡蘿卜素，以後共發現另外2種胡蘿卜素異構體，分別是：α、β、γ三種異構體。1958年β-胡蘿卜素獲得專利（US2849495，1958年8月26日，專利權人：Hoffmann La Roche），目前主要從海洋中提取，也可人工合成

自然界有超過300種不同的花青素。他們來源於不同種水果和蔬菜如越橘、酸果蔓、藍莓、葡萄、接骨木紅、黑加侖、紫胡羅卜和紅甘藍、顏色從紅到藍。這些花青素主要包含飛燕草素（Delchindin）、矢車菊素（Cyanidin）、 牽牛花色素（Petunidin）、芍葯花色素（Peonidin）.

花青素顏色隨PH值發生變化，從當PH值為3時的覆盆子紅到當PH值為5時的深藍莓紅。在大多數應用中這些色素具有良好的光、熱和PH穩定性，並且能夠承受巴氏和UHT熱處理。花青素廣泛地應用在飲料、糖果、果凍和果醬中。

近年來對作為多酚的花青素對健康可能帶來的好處的關注越來越集中。將來花青素的這種特性在功能食品和保健食品中有可能得到日益應用。目前市場上有比較成熟的花青素產品，這些花青素主要是越橘花青素、藍莓花青素、蔓越橘花青素、接骨木花青素、黑莓花青素和黑豆皮花青素等，含量均為25%或40%。國內西安天一生物技術有限公司的 薛西峰先生做了詳細的提取工藝研究，並於2001年開始大規模生產25%的花青素成品。

花青素的作用
花青素為人體帶來多種益處。從根本上講，花青素是一種強有力的抗氧化劑，它能夠保護人體免受一種叫做自由基的有害物質的損傷。花青素還能夠增強血管彈性，改善循環系統和增進皮膚的光滑度，抑制炎症和過敏，改善關節的柔韌性。下面列出花青素的部分功效：

1.有助於預防多種與自由基有關的疾病，包括癌症、心臟病、過早衰老和關節炎；

2.通過防止應激反應和吸煙引起的血小板凝集來減少心臟病和中風的發生；

3.增強免疫系統能力來抵禦致癌物質；

4.降低感冒的次數和縮短持續時間；

5.具有抗突變的功能從而減少致癌因子的形成；

6.具有抗炎功效，因而可以預防包括關節炎和腫脹在內的炎症；

7.緩解花粉病和其它過敏症；

8.增強動脈、靜脈和毛細血管彈性；

9.保護動脈血管內壁；

10.保持血細胞正常的柔韌性從而幫助血紅細胞通過細小的毛細血管，因此增強了全身的血液循環、為身體各個部分的器官和系統帶來直接的益處，並增強細胞活力；

11.鬆弛血管從而促進血流和防上高血壓（降血壓功效）；

13.防止腎臟釋放出的血管緊張素轉化酶所造成的血壓升高（另一個降血壓功效）；

14.作為保護腦細胞的一道屏障，防止澱粉樣β蛋白的形成、谷氨酸鹽的毒性和自由基的攻擊，從而預防阿爾茨海默氏病；

15.通過對彈性蛋白酶和膠原蛋白酶的抑制使皮膚變得光滑而富有彈性，從內部和外部同時防止由於過度日曬所導致的皮膚損傷等等。