組織中rna表達水平測量方法

A. 檢測基因表達的方法

主要用探針檢測mRNA或用抗體檢測出表達的蛋白質(轉錄水平上對特異mRNA的檢測和翻譯水平上對特異蛋白質的檢測)

一、外源基因轉錄水平的鑒定

基因表達分為轉錄及翻譯兩階段，轉錄是以DNA（基因）為模板生成mRNA的過程，翻譯是以mRNA為模板生成蛋白質的過程，檢測外源基因的表達就是檢測特異mRNA及特異蛋白質的生成。所以基因表達檢測分為兩個水平。

即轉錄水平上對特異mRNA的檢測和翻譯水平上對特異蛋白質的檢測。轉錄水平上的檢測主要方法是Northern雜交，它是以DNA或RNA為探針，檢測RNA鏈。和Southern雜交相同，Northern雜交包括斑點雜交和印跡雜交。

也可用RT-PCR（reversetranscribedPCR）方法檢測外源DNA在植物體內的轉錄表達。其原理是以植物總RNA或mRNA為模板進行反轉錄，然後再經PCR擴增。

如果從細胞總RNA提取物中得到特異的cDNA擴增條帶，則表明外源基因實現了轉錄。此法簡單、快速，但對外源基因轉錄的最後決定，還需與Northern雜交的實驗結果結合。

二、外源基因表達蛋白的檢測

表達蛋白的檢測方法有三種：

1、生化反應檢測法：主要通過酶反應來檢測；

2、免疫學檢測法：通過目的蛋白（抗原）與其抗體的特異性結合進行檢測，具體方法有Western雜交、酶聯免疫吸附法（ELISA）及免疫沉澱法；

3、生物學活性的檢測。

Western雜交是將聚丙烯醯胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離抗原（Antigen）固定在固體支持物上（如硝酸纖維素膜，NC膜）。不同分子量大小的蛋白質在凝膠中遷移率不同，據此可確定特定的抗原存在與否以及相對豐度，或者蛋白質是否遭到降解等。

蛋白質電泳後轉到NC膜，放在蛋白質（如牛血清蛋白BSA）或奶粉溶液中，溫育，以封閉非特異性位點，然後用含有放射性標記或酶標記的特定抗體雜交，抗原-抗體結合，再通過放射性自顯影或顯色觀察。

(1)組織中rna表達水平測量方法擴展閱讀

外顯子與內含子表達過程中的相對性從內含子與外顯子的定義來看，兩者是不能混淆的，但是真核生物的外顯子也並非都「顯」（編碼氨基酸），除了tRNA基因和rRNA基因的外顯子完全「不顯」之外，幾乎全部的結構基因的首尾兩外顯子都只有部分核苷酸順序編碼氨基酸，還有完全不編碼基酸的外顯子，如人類G6PD基因的第一外顯子核苷酸順序。

已發現一個基因的外顯子可以是另一基因的內含子，所這亦然。以小鼠的澱粉酶基因為例，來源於肝的與來源於唾液腺的是同一基因。澱粉酶基因包括4個外顯子，肝生成的澱粉酶不保留外顯子1，而唾液腺中的澱粉酶則保留了外顯子1的50bp順序，但把外顯子2與前後兩段內含子一起剪切掉，經過這樣剪接，外顯子2就變成唾液澱粉酶基因中的內含子。

同一基因在不同組織能生成不同的基因產物來源於不同組織的類似蛋白，可以由同一基因編碼產生，這種現象首先是由於基因中的增強子等有組織特異性，它能與不同組織中的組織特異因子結合，故在不同組織中同一基因會產生不同的轉錄物與轉錄後加工作用。

此外真核生物基因可有一個以一的poly(A)位點，因此能在不同的細胞中產生具有不同3』末端的前mRNA，從而會有不同的剪接方式。由於大多數真核生物基因的轉錄物是先加poly(A)尾巴，然後再行剪接，因此不同組織、細胞中會有不同的因子干預多聚腺苷酸化作用，最後影響剪接模式。

B. 如何測量RNA的純度和含量

RNA膠（凝膠成像）檢測。例如：原核生物的核糖體所含的rRNA有5S、16S及23S三種。在膠上就有三條明顯大小不一的條帶。

凝膠遷移分析。可以用來研究RNA-蛋白相互作用。基本原理是：結合了蛋白的RNA在凝膠中的遷移速率更慢，因而可以區分出結合蛋白與未結合蛋白的RNA條帶。RNA-seq即轉錄組測序技術，把mRNA，smallRNA等用高通量測序技術把RNA的序列測出來。反映出RNA的表達水平。

RNA純度：RNA在純化過程中容易受到DNA、蛋白質及有機溶劑的影響，這些殘存物將會影響以後的操作。光譜分析(NANODROP)利用物質對不同波長光的吸收度的不同，可以鑒別出溶液純度及濃度。

組成結構

RNA和DNA一樣，也是由各種核苷酸通過3′，5′-磷酸二酯鍵連接構成的多核苷酸鏈，但與DNA有一系列差異。

在化學組成方面，RNA含核糖而不含脫氧核糖。含尿嘧啶而不含胸腺密啶。例外的是，每個tNA分子含有一個胸腺嘧啶，這是在RNA鏈合成後由尿嘧啶甲基化生的，此外，前面已提到，少數DNA含有少量核糖，但這些個別的例外並不能以此否定兩類核酸組成上的差異。

以上內容參考：網路-核糖核酸

C. 如何檢測基因表達水平

1 western bloting
a.將編碼目標蛋白基因通過載體進行體外重組，然後導入宿主細胞表達
b.將目標蛋白注入兔子或其他動物體內獲得一抗
c.將樣品蛋白進行聚丙烯醯胺凝膠電泳、轉移、吸附固定
d.用一抗與之雜交再用二抗檢測其是否表達
2 fluorescent real-time PCR
a.提取樣品總RNA，再通過超速離心獲得mRNA
b.用逆轉錄酶獲得cDNA
c.加入特異性探針
d.利用專門的儀器檢測熒光強度即可
3半定量 PCR
a.提取樣品總RNA，再通過超速離心獲得mRNA
b.用逆轉錄酶獲得cDNA
c.做半定量PCR
4cDNA microarray
5蛋白質 晶元
實質就是高通量的分子雜交，免疫酶連反應再運用計算機處理

D. 如何測量RNA濃度

1、超微量分光光度計測260nm吸收值計算。

可以定量溶於緩沖液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長260 nm。

2、也可以用RNA膠（凝膠成像）檢測。例如：原核生物的核糖體所含的rRNA有5S、16S及23S三種。在膠上就有三條明顯大小不一的條帶。凝膠遷移分析。可以用來研究RNA-蛋白相互作用。基本原理是：結合了蛋白的RNA在凝膠中的遷移速率更慢，因而可以區分出結合蛋白與未結合蛋白的RNA條帶。

(4)組織中rna表達水平測量方法擴展閱讀

1、RNA的功能是：

（1）具有肽醯轉移酶的活性。

（2）為tRNA提供結合位點。

（3）在蛋白質合成起始時，參與同mRNA選擇性的結合，在肽鏈的延伸中與mRNA結合。

2、原核生物的rRNA分三類：5SrRNA、16SrRNA和23SrRNA。

真核生物的rRNA分四類：5SrRNA、5.8SrRNA、18SrRNA和28SrRNA。

S為大分子物質在超速離心沉降中的一個物理學單位，可間接反映分子量的大小。原核生物和真核生物的核糖體均由大、小兩種亞基組成。

3、凝膠成像對DNA或RNA膠 進行切膠、拍照、觀察、分析的實驗室類儀器，凝膠成像系統可以應用於分子量計算、密度掃描、密度定量、PCR定量等生物工程常規研究。

E. 檢測基因表達水平差異的方法有哪些

基因的表達是dna-rna-蛋白,期間有轉錄水平調控、轉錄後調控、翻譯後調控等多種調控機制影響該基因的表達.

所以蛋白水平高低的原因就可能是多方面的.蛋白表達多,可能是mrna多,也可能mrna變化不大,而是翻譯多了；蛋白表達少,原因亦然.

從2個水平檢測一個基因的表達,可以更全面地了解該基因在該組織某個時期或某種條件下的變化受到什麼水平的調控.

所謂基因表達,就是從dna到mrna再到蛋白的一個過程,基因表達水平一般是通過該基因轉錄的mrna的多少來衡量的.

每個基因轉錄產生的mrna的量,是受到時空等多種因素調控的,個體在不同的生長發育階段,或者不同的組織水平,基因轉錄出mrna的量都是不一樣的.

例如,當某種植物長期生長在高鹽的環境里,該植物體內與抗鹽相關的基因的表達量就會增加,以適應這種高鹽環境,是植物能夠生存下來,這時植物抗鹽相關的基因表達水平就相對高

檢測基因表達的方法：

轉錄水平檢測：rt-pcr，real-time pcr，northern blot

翻譯水平檢測：western blot

還有直接檢測，如報告基因、融合熒光蛋白等。

rt-pcr是反轉錄pcr，是半定量方式。real-time pcr可以精確定量。 二者不同。後者為了區別於rt-pcr，一般不縮寫。

各位觀眾老爺們大家好!我是吆五，打算從今以後不定期分享一些生物類的專業知識。

一方面供自己學習積累，另一方面也希望對大家有所幫助。

生物是很枯燥的呢