無菌檢測方法在葯典的哪裡

1. 中國葯典無菌檢查法的供試品的無菌檢查

檢驗數量是指一次試驗所用供試品最小包裝容器的數量。除另有規定外，出廠產品按表1規定；上市產品監督檢驗按表2、表3規定。表1、表2、表3中最少檢驗數量不包括陽性對照試驗的供試品用量。一般情況下，供試品無菌檢查若採用薄膜過濾法，應增加1/2的最小檢驗數量作陽性對照用；若採用直接接種法，應增加供試品1支（或瓶）作陽性對照用。
（註：《中國葯典》2010版三部附錄ⅩⅡA無菌檢查法為「抽驗數量 系指一次試驗所用供試品最小包裝容器的數量（支或瓶），成品每亞批均應進行無菌檢查。除另有規定外，原液、半成品和成品按表1規定，上市產品監督檢驗按表2規定。 」） 是指一次試驗所用的供試品總量（g或ml）。除另有規定外，每份培養基接種的供試品量按表2、表3規定。若每支（瓶）供試品的裝量按規定足夠接種兩份培養基，則應分別接種硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基。採用薄膜過濾法時，檢驗量應不少於直接接種法的總接種量，只要供試品特性允許，應將所有容器內的全部內容物過濾。
（註：《中國葯典》2010版三部附錄ⅩⅡA無菌檢查法為「接種量 系指每個最小包裝的最少取樣量（ml或g），接種供試品量按表3規定。若採用直接接種法，按接種量要求等量分別接種至硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基中(兩種培養基的接種支（瓶）數之比為2:1);若採用薄膜過濾法，應採用三聯薄膜過濾器，其中兩聯假如硫乙醇酸鹽流體培養基，一聯加入改良馬丁培養基。只要供試品特性允許，應將所有容器內的全部內容物過濾。」） 應根據供試品特性選擇陽性對照菌：無抑菌作用及抗革蘭陽性菌為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為對照菌；抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對照菌；抗厭氧菌的供試品，以生孢梭菌為對照菌；抗真菌的供試品，以白色念珠菌為對照菌。陽性對照試驗的菌液制備同方法驗證試驗，加菌量小於100cfu，供試品用量同供試品無菌檢查每份培養基接種的樣品量。陽性對照管培養48～72小時應生長良好。
（註：《中國葯典》2010版三部附錄ⅩⅡA無菌檢查法為「以金黃色葡萄球菌為陽性對照菌。供試品用量同供試品無菌檢查每份培養基接種的樣品量。陽性對照的菌液制備同培養基靈敏度檢查項下金黃色葡萄球菌菌液制備方法，加菌量小於100cfu。陽性對照也可在供試品無菌檢查14天後，取其中一份硫乙醇酸鹽流體培養基，加入小於100cfu陽性對照菌，作為陽性對照。陽性對照置30℃～35℃培養48～72小時應生長良好。」） 供試品無菌檢查時，應取相應溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。
無菌試驗過程中，若需使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應證明其有效性，且對微生物無毒性。
無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法。只要供試品性狀允許，應採用薄膜過濾法。供試品無菌檢查所採用的檢查方法和檢驗條件應與驗證的方法相同。
操作時，用適宜的消毒液對供試品容器表面進行徹底消毒，如果供試品容器內有一定的真空度，可用適宜的無菌器材（如帶有除菌過濾器的針頭）向容器內導入無菌空氣，再按無菌操作起開容器取出內容物。

2. 什麼是無菌檢查法

無菌檢查法
無菌檢查法系指檢查葯品與敷料是否無菌的一種方法。
無菌檢查的全部過程應嚴格遵守無菌操作，防止微生物的污染。
生物製品應按衛生部《生物製品製造及檢定規程》中有關無菌檢查的規定辦理。
培養基及其制備方法
1.需氣菌、厭氣菌培養基(硫乙醇酸鹽液體培養基)
酪腖（胰酶水解）
15g
氯化鈉
2.5g
葡萄糖
5g
新鮮配製的0.1％刃天青溶液
1.0ml
L－胱氨酸
0.5g
(或新鮮配製的0.2％亞甲藍溶液 0.5ml)
硫乙醇酸鈉
0.5g
瓊酯
0.5～0.7g
(或硫乙醇酸0.3ml)
水
1000ml
酵母浸出粉
5g
除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分加入水內，微溫溶解後，調節pH為弱鹼性，煮沸，濾清，按量加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調節pH值使滅菌後為7.1±0.2，分裝，115℃滅菌30分鍾。
在無菌檢查接種前, 培養基指示劑氧化層的顏色不得超過培養基深度約1/5。否則,須經水浴煮沸加熱, 只限加熱一次。
2.黴菌培養基
腖
5g
磷酸氫二鉀（K2HPO4)
1g
酵母浸出粉
2g
硫酸鎂（MgSO4·7H2O）
0.5g
葡萄糖
20g
蒸餾水
1000ml
除葡萄糖外，取上述成分加入水內，微溫溶解後，調節pH約6.8，煮沸,加葡萄糖溶解後，搖勻，濾清，調節pH值使滅菌後為6.4±0.2，分裝，115℃滅菌20分鍾。
3.選擇性培養基
(1) 對氨基苯甲酸培養基(用於磺胺類葯物的無菌檢查)
照上述需氣菌、厭氣菌培養基及黴菌培養基的處方及製法，各加對氨基苯甲酸0.125g，溶解後搖勻，分裝，115℃滅菌30分鍾。
(2) 吐溫培養基(用於油劑葯品的無菌檢查)
照上述需氣菌、厭氣菌培養基及黴菌培養基的處方及製法，各加10ml的吐溫80，搖勻後，分裝，115℃滅菌30分鍾。
4.營養肉湯培養基
腖
10g
肉浸液
1000ml
氯化鈉
5g
取腖與氯化鈉，加入肉浸液內，微溫溶解後，調節pH為弱鹼性，煮沸，濾清，調節pH值使滅菌後為7.2±0.2，分裝，115℃滅菌30分鍾。
5.營養瓊脂培養基
照上述營養肉湯培養基的處方及製法，加入15～20g瓊脂，調節pH值使滅菌後為7.2±0.2，分裝，115℃滅菌30分鍾。
6.0.5％葡萄糖肉湯培養基
腖
10g
葡萄糖
5g
氯化鈉
5g
肉浸液
1000ml
取腖與氯化鈉加入肉浸液內，微溫溶解後，調節pH為弱鹼性，煮沸，加葡萄糖溶解後，搖勻，濾清，調節pH值使滅菌後為7.2±0.2， 分裝，115℃滅菌30分鍾。
7.黴菌瓊脂培養基
照黴菌培養基的處方及製法，加入15～20g瓊脂，調節pH值使滅菌後為6.4±0.2，分裝，115℃滅菌20分鍾，趁熱斜放使凝固成斜面。
上述培養基分別按15ml與40ml分裝於試管中，裝量約為試管高度的2/5，在115℃滅菌30分鍾。細菌培養基經30～35℃培養48小時，黴菌培養基經20～25℃培養72小時後，應無菌生長。
培養基的質量應通過靈敏度檢查。
培養基靈敏度檢查法
1.菌種
(1)藤黃微球菌(Micrococcus Lutea)[CMCC(B)28001]

(2)生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B)64941]
(3)白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]
2.操作
取藤黃微球菌的營養瓊脂斜面和白色念珠菌的黴菌瓊脂斜面的新鮮培養物分別用0.9％滅菌氯化鈉溶液製成均勻的菌懸液;將生孢梭菌的不含瓊脂需氣菌、厭氣菌培養基的新鮮培養物,吸入滅菌離心管，離心，棄去上清液，菌體用0.9％滅菌氯化鈉溶液製成均勻菌懸液。分別取上述菌懸液用0.9％滅菌氯化鈉溶液稀釋至與細菌濁度標 准管相同的濃度，然後，作10倍系列稀釋並計數。

將藤黃微球菌1:10<5>～1:10<8>菌液、生孢梭菌1:10<6>～1:10<9>菌液、白色念珠菌1:10<5>～1:10<8>菌液各1ml,分別接種至9ml試驗培養基中,每個稀釋度至少接種3管,以未接種的培養基管作對照，細菌試驗管置30～35℃培養3天,白色念珠菌試驗管置20～25℃培養5天。逐日記錄結果。
3.結果判定
以接種後培養基管數的2/3以上呈現生長的最高稀釋度為該培養基的靈敏度（且接種菌量均應小於10個），三次試驗中，以兩次達到的最高靈敏度為判定標准。
需氣菌、厭氣菌培養基靈敏度為藤黃微球菌1:10<6>；生孢梭菌1:10<7>，黴菌培養基靈敏度為白色念珠菌1:10<6>。
[附註]
肉浸液制備法
取新鮮牛肉，除去肌腱及脂肪，切細，絞碎後,每1000g加水3000ml，充分拌勻，在2～10℃浸泡20～24小時，煮沸1小時，濾過，壓干肉渣，補足液量，分裝，121℃滅菌30分鍾，置冷暗處備用。也可用牛肉浸出粉3g，加水1000ml,配成溶液代替。
對照用菌液
1.金黃色葡萄球菌（Staphylococcus
aureus）菌液
取金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]的營養瓊脂斜面新鮮培養物1白金耳，接種至需氣菌、厭氣菌培養基內,在30～35℃培養16～18小時後，用0.9％滅菌氯化鈉溶液稀釋成1:10<6>。
2.生孢梭菌（Clostridium sporogenes）菌液
取生孢梭菌[CMCC(B)64941]的需氣菌、厭氣菌培養基新鮮培養物1白金耳,再接種至相同培養基內，在30～35℃培養18～24小時，用0.9％滅菌氯化鈉溶液稀釋至1:10<6>。
3.白色念珠菌（Candida albicans）菌液
取白色念珠菌[CMCC(F)98001]的黴菌瓊脂培養基斜面新鮮培養物1白金耳,接種至黴菌培養基內，在20～25℃培養24小時後，用0.9％滅菌氯化鈉溶液稀釋至1:10<5>。
檢查法
1. 直接接種法
(1) 供試品如為注射液、供角膜創傷及手術用的滴眼劑或滅菌溶液, 任取供試品2支（瓶）以上，用適當消毒液清潔供試品容器的外表面後,以無菌操作吸取規定接種量的供試品溶液，分別接種於需氣菌、厭氣菌培養基5管，其中1管接種對照用菌液1ml，供作陽性對照；取1支需氣菌、厭氣菌培養基管作陰性對照, 另接種於黴菌培養基2管，供試品溶液的每管接種量與培養基的分裝量，應根據供試品的裝量,按下列規定取用：
供試品裝量
每管接種量
培養基分裝量
2ml或2ml以下
0.5ml
15ml
2ml以上至20ml
1.0ml
15ml
20ml以上
5.0ml
40ml
接種後輕輕搖動,使勻。需氣菌、厭氣菌培養基在30～35℃培養5日, 黴菌培養基在20～25℃培養7日，抗生素類葯品均培養7日，放射性葯品培養5～7日。培養期間應逐日檢查是否有菌生長（陽性對照在24小時內應有細菌生長）；如在加入供試品溶液後，培養基出現渾濁或沉澱，經培養後不能從外觀上判斷時,可取該培養液轉種入另1支相同的培養基中或斜面培養基上，培養48～72小時後，觀察是否再現渾濁或在斜面上有無菌落生長，並在轉種的同時，取培養液少量，塗片製成染色標本，用顯微鏡觀察是否有菌生長。
(2) 供試品如為注射用滅菌粉末或無菌凍干品，照該葯品項下的規定或按該葯品劑量項下的溶劑用量，加入滅菌水或0.9％滅菌氯化鈉溶液,使內容物溶解成均勻的供試品溶液，取規定接種量的供試品溶液，接種於上述培養基中。
(3) 供試品如為供直接分裝成注射用無菌粉末的原料葯，按各該葯品項下的規定製成溶液，依法接種於培養基中。
(4) 供試品如為外科敷料，取供試品2個包裝，以無菌操作拆開包裝,於不同部位剪取約1cm×3cm的樣品，分別接種於40ml培養基中。
(5) 供試品如有抑菌作用或含有抑菌物質時，可選用適宜的培養基，或種入較大量的培養基中，使該供試品稀釋至不具有抑菌使用的濃度；或照下述「薄膜過濾法」處理並接種於培養基中。
(6) 供試品如為抗生素葯品,取該品種正文中最大規格量的供試品不少於2瓶(支)。原料葯按制劑規格項下,取最大規格量2份，分別加入足夠使青黴素滅活的無菌青黴素酶溶液適量，搖勻，分別等量接種於每管裝量為40ml的培養基中。
(7) 供試品如為放射性葯品，取供試品1瓶(支)，以每管接種量為0.2ml，接種於每管裝量為7.5ml的培養基中。
2. 薄膜過濾法
(1)供試品如為抗生素葯品，取該品種正文中最大規格量的供試品不少於2瓶(支)。原料葯按制劑規格項下取最大規格量2份, 分別按該葯品項下規定的方法處理後, 加入0.9％滅菌氯化鈉溶液至少100ml或其他適宜的溶劑中, 搖勻, 以無菌操作加入裝有直徑約50mm、孔徑不大於0.45±0.02μm微孔濾膜的薄膜過濾器內,減壓抽干後,用0.9％滅菌氯化鈉溶液或其他適宜的溶劑沖洗濾膜3次,每次至少100ml；取出濾膜,分成4片, 取3片分別放在3管各40ml需氣菌、厭氣菌培養基中, 其中1管接種對照用菌液1ml,供作陽性對照, 另1片放在黴菌培養基管中。取1支需氣菌、厭氣菌培養基管作陰性對照。

(2) 供試品如為抗厭氧菌葯品，取規定量的供試品，按上述方法經薄膜過濾器處理後，取出濾膜，分成4片，其中3片放在3管需氣菌、厭氣菌培養基管中，1管接種生孢梭菌對照用菌液1ml，供作陽性對照。另1片放在黴菌培養基管中。 取1支需氣菌、厭氣菌培養基管作陰性對照。
(3) 供試品如為抗真菌葯品，取規定量的供試品,按上述方法經薄膜過濾器處理後,取出濾膜,分成4片，取2片分別放在2管需氣菌、厭氣菌培養基管中；2片分別放在2管黴菌培養基管中,其中1管接種白色念珠菌對照用菌液1ml，供作陽性對照。取1支需氣菌、厭氣菌培養基管作陰性對照。
結果判斷
當陽性對照管顯渾濁並確有細菌生長，陰性對照管陰性時,可根據觀察所得的結果判定：如需氣菌、厭氣菌及黴菌培養管均為澄清或雖顯渾濁但經證明並非有菌生長,均應判為供試品合格；如需氣菌、厭氣菌及黴菌培養管中任何1管顯渾濁並確證為有菌生長，應重新取樣，分別依法倍量復試，除陽性對照管外，其他各管均不得有菌生長，否則應判為供試品不合格。

3. 中國葯典無菌檢查法的附表

表1批出廠產品最少檢驗數量 供試品 批產量N（個） 接種每種培養基所需的最少檢驗數量 注射劑
大體積注射劑（>100 ml） ≤100
100<N≤500
>500 10%或4個（取較多者）
10個
2%或20個（取較少者）
2%或10個（取較少者） 眼用及其他非注射產品 ≤200
>200 5%或2個（取較多者）
10個 桶裝無菌固體原料
抗生素固體原料葯（≥5克） ≤4
4<N≤50
>50 每個容器
20%或4個容器（取較多者）
2%或10個容器（取較多者）
6個容器 醫療器具 ≤100
100<N≤500
>500 10%或4件（取較多者）
10件
2%或20件（取較少者） 註：若供試品每個容器內的裝量不夠接種兩種培養基，那麼表中的最少檢驗數量加倍。
（註：「抗生素固體原料葯（≥5克）和醫療器具」為《中國葯典》2010版二部附錄ⅩⅠH無菌檢查法項目。《中國葯典》2010版三部附錄ⅩⅡA無菌檢查法
表1 出廠製品不同規格及原液和半成品最少抽驗數量） 供試品 批產量（N）；裝量（V） 最少抽驗數量 注射劑 N≤100 5個 100<N≤500 10個 N>500 20個 凍干血液製品 V>5ml 每櫃凍干N≤200 5個 每櫃凍干N>200 10個 V≤5ml N≤100 5個 100<N≤500 10個 N>500 20個 原液或半成品 每個容器取樣，取樣量為每個容器製品總量的0.1%或不少於10ml。每開瓶1次，應如上法抽驗。體外用診斷製品半成品每批抽驗量應不少於3ml。 表2液體制劑最少檢驗量及上市抽驗樣品的最少檢驗數量 供試品裝量V（ml） 每支供試品接入每種培養基的最少量 供試品最少檢驗數量（瓶或支） ≤1
1<V<5
5≤V<20
20≤V<50
50≤V<100
50≤V<100(靜脈給葯)
100≤V≤500
V>500 全量
半量
2ml
5ml
10ml
半量
半量
500ml 10①
10
10
10
10
10
6①
6 註：①若供試品每個容器內的裝量不夠接種兩種培養基，那麼表中的最少檢驗數量加倍。
（註：《中國葯典》2010版三部附錄ⅩⅡA無菌檢查法
表2上市製品監督抽驗數量） 品種及裝量（V） 最少抽驗量 血液製品V<50ml 6個 血液製品V≥50ml 2個 其它生物製品 10個 表3固體制劑最少檢驗量及上市抽驗樣品的最少檢驗數量 供試品裝量M/支或瓶 每支供試品接入每種培養基的最少量 供試品最少檢驗數量(瓶或支) M <50mg
50mg≤M<300mg
300mg≤M<5g
M≥5g
外科用敷料棉花及紗布
縫合線、一次性醫用材料
帶導管的一次性醫療器具
（如輸液袋）
其它醫療器具 全量
半量
150 mg
500 mg
取100 mg或1cm×3cm
整個材料③
整個器具③（切碎或拆散開） 10①
10
10
10②
10
10①
10
10① 註：①若供試品每個容器內的裝量不夠接種兩種培養基，那麼表中的最少檢驗數量加倍。②抗生素粉針劑（≥5克）及抗生素原料葯（≥5克）的最少檢驗數量為6瓶（支）。桶裝固體原料的最少檢驗數量為4個包裝。③如果醫用器械體積過大，培養基用量可在2000ml以上，將其完全浸沒。
（註：《中國葯典》2010版三部附錄ⅩⅡA無菌檢查法
表3不同規格製品的最少接種量） 規格每支（瓶）供試品的最少接種量液體制劑（ml）V≤1 全量1<V≤5半量5<V<202ml20≤V<5010mlV≥50半量原液或半成品M <50mg半量固體制劑 M <50mg 全量50mg≤M<300mg半量300mg≤M<5g150mgM≥5g半量

4. 中國葯典無菌檢查法的供試品處理及接種培養基

除另有規定外，按下列方法進行。 薄膜過濾法應優先採用封閉式薄膜過濾器，也可使用一般薄膜過濾器。無菌檢查用的濾膜孔徑應不大於0.45μm。直徑約為50mm。根據供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質。抗生素供試品應選擇低吸附的濾器及濾膜。濾器及濾膜使用前應採用適宜的方法滅菌。使用時，應保證濾膜在過濾前後的完整性。
水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應充分乾燥。為發揮濾膜的最大過濾效率，應注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經薄膜過濾後，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量一般為100ml，總沖洗量不得超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。
水溶液供試品取規定量，直接過濾，或混合至含適量稀釋液的無菌容器內，混勻，立即過濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑，須用沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數一般不少於3次，所用的沖洗量、沖洗方法同方法驗證試驗。沖洗後，如用封閉式薄膜過濾器，分別將100ml硫乙醇酸鹽流體培養基及改良馬丁培養基加入相應的濾筒內。如採用一般薄膜過濾器，取出濾膜，將其分成3等份，分別置於含50ml硫乙醇酸鹽流體培養基及改良馬丁培養基容器中，其中一份做陽性對照用。
（註：《中國葯典》2010版三部附錄ⅩⅡA無菌檢查法為「取規定量，每支（瓶）供試品裝量為5ml及以下者，全部轉移至含適宜稀釋液100ml的無菌容器內，混勻，立即過濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑，須用沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數一般不少於3次，所用的沖洗量、沖洗方法同方法驗證試驗。沖洗後，2個濾器中加入硫乙醇酸鹽流體培養基各100ml，另一濾器中加入改良馬丁培養基100ml。」）
可溶於水的固體制劑供試品取規定量，加適宜的稀釋液溶解或按標簽說明復溶，然後照水溶液供試品項下的方法操作。
（註：《中國葯典》2010版三部附錄ⅩⅡA無菌檢查法為「水溶性固體供試品」）
β-內醯胺類抗生素供試品取規定量，按水溶液或固體制劑供試品的處理方法處理，立即過濾，用適宜的沖洗液沖洗濾膜。再用含適量β-內醯胺酶的沖洗液清除殘留在濾筒、濾膜上的抗生素後接種培養基，必要時培養基中可加少量的β-內醯胺酶；或將濾膜直接接種至含適量β-內醯胺酶的培養基中。接種培養基照水溶液供試品項下的方法操作。
（註：此類供試品處理方法為《中國葯典》2010版二部附錄ⅩⅠH無菌檢查法添加項目）
非水溶性制劑供試品取規定量，直接過濾；或混合溶於含聚山梨酯80或其他適宜乳化劑的稀釋液中，充分混合，立即過濾。用含0.1～1%聚山梨酯80的沖洗液沖洗濾膜至少3次。濾膜於含或不含聚山梨酯80的培養基中培養。接種培養基照水溶液供試品項下的方法操作。
（註：《中國葯典》2010版三部附錄ⅩⅡA無菌檢查法為「用含0.1～1%聚山梨酯80的沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數一般不少於3次。」）
可溶於十四烷酸異丙酯的膏劑和粘性油劑供試品取規定量，混合至適量的無菌十四烷酸異丙酯①中，劇烈振搖，使供試品充分溶解，如果需要可適當加熱，但溫度不得超過44℃，趁熱迅速過濾。對仍然無法過濾的供試品，於含有適量的無菌十四烷酸異丙酯中的供試液中加入不少於100ml的稀釋液，充分振搖萃取，靜置，取下層水相作為供試液過濾。過濾後濾膜沖洗及接種培養基照非水溶性制劑供試品項下的方法操作。
注①：無菌十四烷酸異丙酯的制備 採用薄膜過濾法過濾除菌。選用孔徑為0.22μm的脂溶性濾膜，在140℃乾熱滅菌2小時。
無菌氣（噴）霧劑供試品取規定量，將各容器置至少－20℃的冰室冷凍約1小時。以無菌操作迅速在容器上端鑽一小孔，釋放拋射劑後再無菌開啟容器，並將供試液轉移至無菌容器中，然後照水溶液或非水溶性制劑供試品項下的方法操作。
裝有葯物的注射器供試品取規定量，排出注射器中的內容物置無菌容器中，若需要可吸入稀釋液或標簽所示的溶劑溶解，然後照水溶液或非水溶性制劑供試品項下的方法操作。同時應採用直接接種法進行包裝中所配帶的無菌針頭的無菌檢查。
（註：《中國葯典》2010版三部附錄ⅩⅡA無菌檢查法為「取規定量，將注射器中的內容物（若需要可吸入稀釋液或標簽所示的溶劑溶解），直接過濾，或混合至含適量稀釋液的無菌容器內，混勻，立即過濾。然後按水溶性供試品項下方法操作。」）
具有導管的醫療器具(輸血、輸液袋等)供試品取規定量，每個最小包裝用50～100ml沖洗液分別沖洗內壁，收集沖洗液於無菌容器中，然後照水溶液供試品項下方法操作。同時應採用直接接種法進行包裝中所配帶的針頭的無菌檢查。
（註：此類供試品處理方法為《中國葯典》2010版二部附錄ⅩⅠH無菌檢查法添加項目） 直接接種法即取規定量供試品分別接種至各含硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基的容器中。除另有規定外，每個容器中培養基的用量應符合接種的供試品體積不得大於培養基體積的10%，同時，硫乙醇酸鹽流體培養基每管裝量不少於15ml，改良馬丁培養基每管裝量不少於10ml。若供試品具有抑菌作用，可加入適量的無菌中和劑或滅火劑，或加大每個容器的培養基用量。供試品檢查時培養基的用量和高度同方法驗證試驗。
（註：《中國葯典》2010版三部附錄ⅩⅡA無菌檢查法為「直接接種法適用於無法用薄膜過濾法進行無菌檢查的供試品。取規定量供試品，等量分別接種至硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基中（2種培養基的接種支數或瓶數之比為2:1）。除另有規定外，每個容器中培養基的用量應符合接種的供試品體積不得大於培養基體積的10%，同時，硫乙醇酸鹽流體培養基每管裝量不少於15ml，改良馬丁培養基每管裝量不少於10ml。供試品檢查時，培養基的用量和高度同方法驗證試驗。」）
混懸液等非澄清水溶液供試品取規定量，接種至各管培養基中。
固體制劑供試品取規定量直接接種至各管培養基中。或加入適宜的溶劑溶解，或按標簽說明復溶後，取規定量接種至各管培養基中。
非水溶性制劑供試品取規定量，混合，加入適量的聚山梨酯80或其它適宜的乳化劑及稀釋劑使其乳化，接種至各管培養基中。或直接接種至含聚山梨酯80或其它適宜乳化劑的各管培養基中。
敷料供試品取規定數量，以無菌操作拆開每個包裝，於不同部位剪取約100mg或1cm×3cm的供試品，接種於各管足以浸沒供試品的適量培養基中。
（註：此類供試品處理方法為《中國葯典》2010版二部附錄ⅩⅠH無菌檢查法添加項目）
腸線、縫合線等供試品腸線、縫合線及其它一次性使用的醫用材料按規定量取最小包裝，無菌拆開包裝，接種於各管足以浸沒供試品的適量培養基中。
（註：此類供試品處理方法為《中國葯典》2010版二部附錄ⅩⅠH無菌檢查法添加項目）
滅菌醫用器具供試品取規定量，必要時應將其拆散或切成小碎段，接種於足以浸沒供試品的適量培養基中。
（註：此類供試品處理方法為《中國葯典》2010版二部附錄ⅩⅠH無菌檢查法添加項目）
放射性葯品取供試品1瓶(支)，接種於裝量為7.5ml的硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基中。每管接種量為0.2ml。
（註：此類供試品處理方法為《中國葯典》2010版二部附錄ⅩⅠH無菌檢查法添加項目） 上述含培養基的容器按規定的溫度培養14天。培養期間應逐日觀察並記錄是否有菌生長。如在加入供試品後或在培養過程中，培養基出現渾濁，培養14天後，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養液適量轉種至同種新鮮培養基中，細菌培養2天，真菌培養3天，觀察接種的同種新鮮培養基是否再出現渾濁；或取培養液塗片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。
（註：《中國葯典》2010版三部附錄ⅩⅡA無菌檢查法為「將上述接種後的硫乙醇酸鹽流體培養基平均分成兩份，一份置30℃～35℃培養14天，另一份與接種後的改良馬丁培養基置20℃～25℃培養14天，培養期間應逐日觀察並記錄是否有菌生長。如在加入供試品後或在培養過程中，培養基出現渾濁，培養14天後，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養液適量轉種至同種新鮮培養基中及營養瓊脂斜面和改良馬丁瓊脂斜面培養基上，細菌培養2天，真菌培養3天，觀察接種的同種新鮮培養基及營養瓊脂斜面和改良馬丁瓊脂斜面培養基上是否有菌生長；或取培養液（物）塗片，染色，鏡檢，判斷是否有菌，必要時做菌種鑒定。） 陽性對照管應生長良好，陰性對照管不得有菌生長。否則，試驗無效。
若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經確證無菌生長，判供試品符合規定；若供試品管中任何一管顯渾濁並確證有菌生長，判供試品不符合規定，除非能充分證明試驗結果無效，即生長的微生物非供試品所含。當符合下列至少一個條件時方可判試驗結果無效：
⑴無菌檢查試驗所用的設備及環境的微生物監控結果不符合無菌檢查法的要求。
⑵回顧無菌試驗過程，發現有可能引起微生物污染的因素。
⑶供試品管中生長的微生物經鑒定後，確證是因無菌試驗中所使用的物品和（或）無菌操作技術不當引起的。
試驗若經確認無效，應重試。重試時，重新取同量供試品，依法檢查，若無菌生長，判供試品符合規定；若有菌生長，判供試品不符合規定。

5. 中國葯典中葯物微生物檢測在哪部

你好，微生物檢測方法在中國葯典2010年版二部附錄XI J，具體方法為附錄XI J微生物限度檢查法
微生物限度檢査法系檢查非規定滅菌制劑及其原料、輔
料受微生物污染程度的方法。檢查項目包括細菌數、黴菌數、
酵母菌數及控制菌檢查。
微生物限度檢查應在環境潔凈度10 000級下的局部潔
凈度100級的單向流空氣區域內進行。檢驗全過程必須嚴格
遵守無菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品
中微生物的檢出。單向流空氣區域、工作檯面及環境應定期
按《醫葯工業潔凈室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方
法》的現行國家標准進行潔凈度驗證。
供試品檢查時，如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活
劑，應證明其有效性及對微生物無毒性。
除另有規定外，本檢査法中細菌及控制菌培養溫度為
30〜35°C;黴菌、酵母菌培養溫度為23〜28°C
檢驗結果以lg,lml、10g、10ml或10cm
2為單位報告，特
殊品種可以最小包裝單位報告。
檢驗量
檢驗量即一次試驗所用的供試品量(g、ml或cm
2
)。
除另有規定外，一般供試品的檢驗量為10g或10ml;膜劑
為100cm
2
»貴重葯品、微量包裝葯品的檢驗量可以酌減。要
求檢查沙門菌的供試品，其檢驗量應增加20g或20ml(其中
10g或10ml用於陽性對照試驗）。
檢驗時，應從2個以上最小包裝單位中抽取供試品，膜劑
還不得少於4片。
一般應隨機抽取不少於檢驗用量（兩個以上最小包裝單
位）的3倍量供試品。
供試液的制備
根據供試品的理化特性與生物學特性，採取適宜的方法
制備供試液。供試液制備若需加溫時，應均勻加熱，且溫度不
應超過451C。供試液從制備至加人檢驗用培養基，不得超過
1小時。
除另有規定外，常用的供試液制備方法如下。
1. 液體供試品
取供試品10ml ，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液至
100ml，混勻，作為1 ： 10的供試液。油劑可加人適量的無菌
聚山梨酯80使供試品分散均勻。水溶性液體制劑也可用混
合的供試品原液作為供試液。
2. 固體、半固體或黏稠性供試品
取供試品10g ，加PH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液至
100ml，用勻漿儀或其他適宜的方法，混勻，作為1 ： 10的供試
液。必要時加適量的無菌聚山梨酯80，並置水浴中適當加溫
使供試品分散均勻。
3. 需用特殊方法制備供試液的供試品
(1) 非水溶性供試品
方法1取供試品5g(或5ml)，加至含溶化的（溫度不超
過45'C)5g司盤80、3g單硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80無
菌混合物的燒杯中，用無菌玻棒攪拌成團後，慢慢加人45"的
pH7. 0無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液至100ml，邊加邊攪拌，使供
試品充分乳化，作為1 ： 20的供試液。
方法2 取供試品10g，加至含20ml無菌十四烷酸異丙
酯（製法見附錄H H無菌檢査法中供試品的無菌檢查項下）
和無菌玻璃珠的適宜容器中，必要時可增加十四烷酸異丙酯
的用量，充分振搖，使供試品溶解。然後加人45\：的pH7.0
無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液100ml,振搖5〜：L0分鍾，萃取，靜
置使油水明顯分層，取其水層作為1 •• 10的供試液。
(2) 膜劑供試品.
取供試品100cm
2
，剪碎，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩
沖液lOOmK必要時可增加稀釋液），浸泡，振搖，作為1 ： 10的
供試液(3) 腸溶及結腸溶制劑供試品
取供試品10g,加pH6. 8無菌磷酸鹽緩沖液（用於腸溶制
劑）或pH7. 6無菌磷酸鹽緩沖液（用於結腸溶制劑）至100ml，
置45t:水浴中，振搖，使溶解，作為1 :
10的供試液。
(4) 氣霧劑、噴II劑供試品
取規定量供試品，置冰凍室冷凍約1小時，取出，迅速消
毒供試品開啟部位，用無菌鋼錐在該部位鑽一小孔，放至室
溫，並輕輕轉動容器,使拋射劑緩緩全部釋出。用無菌注射器
吸出全部葯液，加至適量的PH7. 0無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液
(若含非水溶性成分，加適量的無菌聚山梨酯80)中，混勻，取
相當於10g或10ml的供試品，再稀釋成1 ： 10的供試液。
(5) 貼劑供試品
取規定量供試品，去掉貼劑的保護層，放置在無菌玻璃或
塑料片上，粘貼面朝上。用適宜的無菌多孔材料（如無菌紗
布）覆蓋貼劑的粘貼面以避免貼劑粘貼在一起。然後將其置
於適宜體積並含有表面活性劑（如聚山梨酯80或卵磷脂）的
稀釋劑中，用力振盪至少30分鍾，製成供試液。貼劑也可采
用其他適宜的方法制備成供試液。
(6) 具抑菌活性的供試品
當供試品有抑菌活性時，採用下列方法進行處理，以消除
供試液的抑菌活性，再依法檢查。常用的方法如下。
① 培養基稀釋法取規定量的供試液，至較大量的培養
基中，使單位體積內的供試品含量減少，至不含抑菌作用。測
定細菌、黴菌及酵母菌的菌數時，取同稀釋級的供試液2ml,每
lml供試液可等量分注多個平皿，傾注瓊脂培養基,混勻，凝固，
培養，計數。每lml供試液所注的平皿中生長的菌落數之和即
為lml的菌落數，計算每lml供試液的平均菌落數，按平皿法
計數規則報告菌數;控制菌檢查時，可加大增菌培養基的用量。
② 離心沉澱法取一定量的供試液，500轉/分鍾離心3
分鍾，取全部上清液混合。用於細菌檢査。
③ 薄膜過濾法見細菌、黴菌及酵母菌計數項下的"薄
膜過濾法"。
④ 中和法凡含汞、砷或防腐劑等具有抑菌作用的供試
品，可用適宜的中和劑或滅活劑消除其抑菌成分。中和劑或
滅活劑可加在所用的稀釋液或培養基中。

6. 中國葯典無菌檢查法的檢驗條件

無菌檢查應在環境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區域內或隔離系統中進行，其全過程應嚴格遵守無菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區、工作檯面及環境應定期按《醫葯工業潔凈室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標准進行潔凈度驗證。隔離系統應按相關的要求進行驗證，其內部環境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。日常檢驗還需對試驗環境進行監控。
註：《醫葯工業潔凈室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行版國家標准分為：
GB/T16292-2010醫葯工業潔凈室(區)懸浮粒子的測試方法
GB/T16293-2010醫葯工業潔凈室(區)浮游菌的測試方法
GB/T16294-2010醫葯工業潔凈室(區)沉降菌的測試方法 培養基可按以下處方制備，亦可使用按該處方生產的符合規定的脫水培養基。配製後應採用驗證合格的滅菌程序滅菌。制備好的培養基應保存在2℃～25℃、避光的環境，若保存於非密閉容器中，一般在三周內使用；若保存於密閉容器中，一般可在一年內使用。
1．硫乙醇酸鹽流體培養基
酪腖(胰酶水解) 15.0g 酵母浸出粉 5.0g
葡萄糖 5.0g 氯化鈉 2.5g
L-胱氨酸 0.5g 新配製的0.1%刃天青溶液 1.0 ml
硫乙醇酸鈉 0.5g 瓊脂 0.75g
(或硫乙醇酸) （0.3ml) 水 1000 ml
除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微溫溶解，調節pH 為弱鹼性，煮沸，濾清，加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調節pH值使滅菌後為7.1±0.2。分裝至適宜的容器中，其裝量與容器高度的比例應符合培養結束後培養基氧化層（粉紅色）不超過培養基深度的1/2。滅菌。在供試品接種前，培養基氧化層的高度不得超過培養基深度的1/5 ，否則，須經100 ℃水浴加熱至粉紅色消失（不超過20分鍾），迅速冷卻，只限加熱一次，並防止被污染。
硫乙醇酸鹽流體培養基置30℃～35℃培養。
2．改良馬丁培養基
腖 5.0g 磷酸氫二鉀 1.0g
酵母浸出粉 2.0g 硫酸鎂 0.5g
葡萄糖 20.0g 水 1000 ml
除葡萄糖外，取上述成分混合，微溫溶解，調節pH值約為6.8，煮沸，加入葡萄糖溶解後，搖勻，濾清，調節pH值使滅菌後為6.4±0.2，分裝，滅菌。
改良馬丁培養基置23℃～28℃培養。
3．選擇性培養基
按上述硫乙醇酸鹽流體培養基或改良馬丁培養基的處方及製法，在培養基滅菌或使用前加入適宜的中和劑、滅活劑或表面活性劑，其用量同驗證試驗。
4．0.5%葡萄糖肉湯培養基（用於硫酸鏈黴素等抗生素的無菌檢查）
腖 10.0g 氯化鈉 5.0g
葡萄糖 5.0g 水 1000 ml
牛肉浸出粉 3.0g
除葡萄糖外取上述成分混合，微溫溶解，調節pH為弱鹼性，煮沸，加入葡萄糖溶解後，搖勻，濾清，調節pH值使滅菌後為7.2±0.2，分裝，滅菌。
（註：此培養基為《中國葯典》2010版二部附錄ⅩⅠH無菌檢查法中特有項目。）
5．營養肉湯培養基
腖 10.0g 氯化鈉 5.0g
牛肉浸出粉 3.0g 水 1000 ml
取上述成分混合，微溫溶解，調節pH為弱鹼性，煮沸，濾清，調節pH值使滅菌後為7.2±0.2，分裝，滅菌。
6．營養瓊脂培養基
按上述營養肉湯培養基的處方及製法，加入14.0g瓊脂，調節pH值使滅菌後為7.2±0.2，分裝，滅菌。
7．改良馬丁瓊脂培養基
按改良馬丁培養基的處方及製法，加入14.0g瓊脂，調節pH 值使滅菌後為6.4±0.2，分裝，滅菌。 無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養基及改良馬丁培養基等應符合培養基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。本檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進行。
無菌性檢查每批培養基隨機取不少於5支（瓶），培養14天，應無菌生長。
靈敏度檢查
菌種培養基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍乾燥菌種為第0代），試驗用菌種應採用適宜的菌種保存技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕
銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC(B) 10 104〕
枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕
生孢梭菌(Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 64 941〕
白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕
黑麴黴(Aspergillus niger)〔CMCC(F) 98 003〕
菌液制備接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中或營養瓊脂培養基上，接種生孢梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中，30℃～35℃培養18小時～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中或改良馬丁瓊脂培養基上，23～28℃培養24～48小時，上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液製成每1ml含菌數小於100 cfu（菌落形成單位）的菌懸液。接種黑麴黴的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基上，23～28℃培養5～7天，加入3～5ml 含0.05%（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然後，用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05%（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液製成每1ml含孢子數小於100 cfu的孢子懸液。
菌懸液在室溫下放置應在2小時內使用，若保存在2～8℃可在24小時內使用。黑麴黴孢子懸液可保存在2～8℃，在驗證過的貯存期內使用。
培養基接種取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養基9支，分別接種小於100 cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照，置30～35℃培養3天；取每管裝量為9ml的改良馬丁培養基5支,分別接種小於100 cfu的白色念珠菌、黑麴黴各2支，另1支不接種作為空白對照，20～25℃培養5天。逐日觀察結果。
（註：以上培養溫度為《中國葯典》2010版三部附錄ⅩⅡA無菌檢查法添加，一部、二部無溫度。）
結果判定空白對照管應無菌生長，若加菌的培養基管均生長良好，判該培養基的靈敏度檢查符合規定。
（註：《中國葯典》2010版一部附錄ⅩⅢB無菌檢查法、《中國葯典》2010版二部附錄ⅩⅠH無菌檢查法稱為「結果判斷」。）