abc染色法的實驗方法及步驟

A. 革蘭氏染色的步驟和原理

革蘭氏染色的步驟和原理如下:

步驟:

1、首先在載玻片上滴一小滴蒸餾水，用滾如灼燒過的接種針挑取少量細菌，置載玻片的水滴中與水混合並塗抹開，注意塗抹要均勻平坦，塗抹後直徑約為1 cm的薄層。

2、固定。將載玻片在火焰上方固定。

3、染色。加路哥式碘液大概一滴，作用1 min後用水沖洗，注意流水不要直接往薄層上沖，用過濾紙吸干。

4、脫色。用95%乙醇脫色，一般脫色時間大概為30 s。

5、觀察。

乾燥後，用油鏡鏡檢觀察，並做好記錄。

原理：染色後細菌與環境形成鮮明對比，可以清楚地觀察到細菌的形態、排列及某些結構特徵，而用以分類鑒大宏啟定。

B. 單染色法的基本步驟有哪些有何注意事項

一、單染色法的基本步驟：

1．塗片取兩塊干凈的載玻片，各滴一小滴生理鹽水於載玻片中央，用無菌操作，分別挑取金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌於二載玻片的水滴中，調勻並塗成薄膜。注意滴生理鹽水時不宜過多，塗片必須均勻。

2．乾燥於室溫中自然乾燥。

3．固定塗片面向上，於火焰上通過2—3次，使細胞質凝固，以固定細菌的形態，並使其不易脫落。但不能在火焰上敗爛侍烤，否則細菌形態將毀壞。

4．染察吵色放標本於水平位置，滴加染色液於塗片歷春薄膜上，染色時間長短隨不同染色液而定。呂氏鹼性美蘭染色液約染2-3分鍾，石炭酸復紅染色液約染1-2分鍾。

5．水洗染色時間到後，用自來水沖洗，直至沖下之水無色時為止。注意沖洗水流不宜過急，過大，水由玻片上端流下，避免直接沖在塗片處。沖洗後，將標本晾乾或用吹風機吹乾，待完全乾燥後才可置油鏡下觀察。

6．鏡檢按實驗程序進行顯微鏡觀察。

二、注意事項：

(1)載玻片要清潔無油污，否則菌液不易塗開。塗片時取培養物宜少，培養物塗層宜薄，塗層過厚則不易觀察細菌形態。

(2)乾燥和固定時，玻片不能直接在離火焰很近的位置上烘烤，否則會破壞細菌形態並使之變形，影響觀察結果。

(3)觀察時如需用到油鏡，油鏡檢查前玻片應完全乾燥，觀察後要將油鏡用擦鏡紙等徹底擦拭乾凈。

單染色法原理：

簡單染色法即只用一種染料對塗片進行染色，該法簡便易行，適用於菌體的一般形態觀察。通常情況下由於細菌菌體多帶負電荷，易和帶正電荷的鹼性染料結合而被染色，因此常用鹼性染料進行簡單染色，如美藍、鹼性復紅、結晶紫、孔雀綠、番紅等。

所有的苯胺染料，均可用來做簡單染色法的染色劑。在進行染色之前的製片過程是影響染色結果好壞的關鍵性步驟。

C. 革蘭染色法的步驟、結果及其臨床意義分別是什麼

一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟，具體操作方法是：1）塗片固定。2）草酸銨結晶紫染1分鍾。3）自來水沖洗。4）加碘液覆蓋塗面染約1分鍾。5）水洗，用吸水紙吸去水分。6）加95%酒精數滴，並輕輕搖動進行脫色，20秒後水洗，吸去水分。7）蕃紅染色液（稀）染1分鍾後，自來水核搏沖洗。乾燥，鏡檢。x0dx0a 具體試驗 流程x0dx0a 1、 取載玻片用紗布擦乾，載玻片的一面用marker筆畫一個小圈（用來大致確定菌液滴的位置）。塗菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。 2、 塗片：液體培養基：左手持菌液試管，在酒精燈火焰附近5cm左右打開管蓋；右手持接種環在火焰中燒灼滅菌，等冷卻後從試管中沾取菌液一環，在潔凈無脂的載玻片上塗直徑2mm左右的塗膜，最後將接種環在火焰上燒灼滅菌。固體培養基：先在載玻片上滴一滴無菌水，再用接種環取少量菌體，塗在載玻片上，使其薄而均勻。 3、 晾乾：讓塗片在空氣中自然乾燥。 4、 固定：讓菌膜朝上，通過火焰2-3次固定（以不燙手為宜）。 5、 染色：將固定過的塗片放報紙上，滴加草酸銨結晶做盯紫液，染1min。 6、 水洗：用水緩慢沖洗塗片上的染色液，用吸水紙吸干。簡單染色結束可觀察細胞形態。 7、 媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。 8、 脫色：吸去殘留水，連續滴加95%乙醇脫色20-30s至流出液無紫色，立即水洗。 9、 復染：滴加蕃紅復染3-5min，水洗。至此，革蘭氏染色結束。x0dx0ax0dx0a結果：革蘭氏陽性菌呈藍紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。x0dx0ax0dx0a其重要的臨床意義在於：1.鑒別細菌 2.選擇葯物 3.與致病性有關：革蘭氏陽性菌能產生外毒素，革蘭氏陰性菌能產生內毒素；而內毒素主要是指革蘭氏陰性菌胞壁成分中的脂改胡祥多糖，兩者的致病作用不同。

D. ABC法的介紹

ABC法是ABC免疫酶染色法的簡稱，又稱卵白素-生物素-酶復合物染色法，是目前最敏感的免疫組織化學染色法之一。其基本原理是將盯埋鎮特異凱粗性一抗與組織細胞相應抗原結合後，通過生物素化二抗與一抗結合，藉助卵白素與生物素的天然親和性液岩將生物素化辣根過氧化物酶鏈接為復合物，通過酶促反應，顯示組織細胞相應的抗原。

E. 什麼是免疫組織化學以ABC為例介紹免疫組織化學染色的步驟及在染色過程中應該注意的問題

免疫組化就是通過免疫反應來驗證組織中是否存在某個蛋白。A是待檢測的蛋白，也就是抗原，B就是一抗，只會和A發生反應，C就是二抗，只會和B反應，C通常會攜帶某種標記，比如說熒光，用於檢測。
結正塵果就是有A，B就能結合上，有AB，橘清和C就能結合上圓盯，通過檢測C是否存在就可以知道A是否存在。

F. 給細菌染色的方法都有幾種，怎麼操作，都用復紅染色

給細菌染色的方法都有幾種，怎麼操作，都用復紅染色
簡單染色法：利用單一染料對細菌進行染色的一種方法.例如番紅.
1．塗片：用灼燒滅菌冷卻後的接種環挑取少量菌體與水滴充分混勻,塗成極薄的菌膜.
2．乾燥：可自然晾乾,或將塗片置於火焰高處微熱烘乾,但不能直接在火焰上烘烤.
3．固定：手執玻片一端,有菌膜的一面朝上,通過迅速通過火焰2-3次（用手指觸塗片反面,以不燙手為宜）.
4．染色：加適量(以蓋滿菌膜為度)結晶紫染色液(或石炭酸復紅液),染l～2min.
5．水洗：用自來沖洗至流下的水中無染色液的顏色時為止.
6．乾燥
7．鏡檢
復染色：利用用兩種以上染料對細菌進行染色.例如革蘭氏染色法.
革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟,需要鹼性染料（basic dye）初染液；媒染劑（mordant）；脫色劑（decolorising agent）和復染液（counterstain）.
鹼性染料初染液的象在細菌的單染色法基本原理中所述的那樣,而用於革蘭氏染色的初染液一般是結晶紫（crystal violet）.媒染劑的作用是增加染料和細胞之間的親和性或附著力,即以某種方式幫助染料固定在細胞上,使不易脫落,碘（iodine ）是常用的媒染劑.脫色劑是將被染色的細胞進行脫色,不同類型的細胞脫色反應不同,有的能被脫色,有的則不能,脫色劑常用95%的酒精（ethanol）.復染液也是一種鹼性染料,其顏色不同於初染液,復染的目的是使被脫色的細胞染上不同於初染液的顏色,而未被脫色的細胞仍然保持初染的顏色,而且將細胞區分成G+和G-兩大類群,常用的復染液為番紅.
1.載玻片固定.在無菌操作條件下,用接種環挑取少量細菌於干凈的載玻片上塗布均勻,在火焰上加熱以殺死菌種並使其粘附固定.
2.草酸銨結晶紫染1分鍾.
3.自來水沖洗,去掉浮色.
4.用碘-碘化鉀溶液媒染1分鍾,傾去多餘溶液.
5.用中性脫色劑如乙醇（95%）或丙酮酸脫色30秒,革蘭氏陽性菌不被褪色而呈紫色,革蘭氏陰性菌被褪色而呈無色.
6.用番紅染液或者沙黃復染30秒,革蘭氏陽性菌仍呈紫色,革蘭氏陰性菌則呈現紅色.

G. 革蘭氏染色的關鍵步驟是什麼

酒精脫色為整個流程最關鍵的一步。

革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟，具體操作方法是：

（1）載玻片固定。在無菌操作條件下，用接種環挑取少量細菌於干凈的載玻片上塗布均勻，在火焰上加熱以殺死菌種並使其粘附固定。

（2）草酸銨結晶紫染1分鍾。

（3）自來水沖洗，去掉浮色。

（4) 用碘-碘化鉀溶液媒染1分鍾，傾去多餘溶液。

（5）用中性脫色劑如乙醇（95%）或丙酮酸脫色30秒，革蘭氏陽性菌不被褪色而呈紫色，革蘭氏陰性菌被褪色而呈無色。酒精脫色為整個流程最關鍵的一步。

（6）用蕃紅染液或者沙黃復染30秒，革蘭氏陽性菌仍呈紫色，革蘭氏陰性菌則呈現紅色。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌即被區別開。

(7)abc染色法的實驗方法及步驟擴展閱讀

染色原理：

該染色法所以能將細菌分為G+菌和G-菌，是由這兩類菌的細胞壁結構和成分的不同所決定的。G-菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質，而且肽聚糖層較薄、交聯度低。

故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質，增加了細胞壁的通透性，使初染的結晶紫和碘的復合物易於滲出，結果細菌就被脫色，再經蕃紅復染後就成紅色。

G+菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯度高，類脂質含量少，經脫色劑處理後反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌仍保留初染時的顏色，呈現藍紫色。

H. 什麼是革蘭氏染色法染色過程應注意什麼

革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由丹麥醫師、細菌學家漢斯·克里斯蒂安·約阿希姆·革蘭氏（HansChristianJoachimGram，1853-1938）創立。革蘭氏染色法一般包括初染、媒染、脫色、復染等四個步驟。

注意事項:

1.選用活躍生長期菌種染色,老齡的革蘭氏陽性細菌會被染成紅色而造成賀雹假陰性。

2.塗片不宜過厚,以免脫色不完全造成假陽性。

3.脫色是革蘭氏染色是否成功的關鍵,脫色不夠造芹拍答成假陽性,脫色過度造成假陰性。

方法原理：

用於生物染色的染料主要有鹼性染料、酸性染料和中性染料三大類。鹼性染料的離子帶正電荷，能和帶負電荷的物質結合。因細菌蛋白質等電點較低，當它生長於中性、鹼性或弱酸性的溶液中時常帶負電荷，所以通常採用鹼性染料（如美藍、結晶紫、鹼性復紅或孔雀綠等）使其著色。

酸性染料嫌慧的離子帶負電荷，能與帶正電荷的物質結合。當細菌分解糖類產酸使培養基pH下降時，細菌所帶正電荷增加，因此易被伊紅、酸性復紅或剛果紅等酸性染料著色。中性染料是前兩者的結合物又稱復合染料，如伊紅美藍、伊紅天青等。

I. 免疫組化原理、流程及結果分析

免疫組化原理
免疫組化染色是用一抗與被檢測組織中目的蛋白抗原結合，然後用HRP等標記的二抗與一抗進行結合，最後通過與DAB顯色劑反應，進而確認所要檢測蛋白抗原的定位、半定量等目的。
免疫組化更多的意義在於查看目的蛋白的定位。定量一般用western來實現。

免疫組化染色和HE染色的不同之處可能是HE染色比較粗略地辨認不同細胞形態學改變；而後者能夠針對特異性細胞標志物來檢測特異性細胞的改變（數量）、也可檢測細胞內細胞因子的轉位，組織中一些特異性蛋白的表達的量改變（通過圖像分析系統分析顏色深淺、分布的面積等綜合分析）。
通俗的講，HE僅僅是看大體病理改變，比如組織壞死，比如炎性滲出。免疫組化，看你的目的蛋白的表達情況。

免疫組化和****HE****染色的對比
DAB和HE一樣也是一種染色劑，HE染色相對簡單，能分辨出細胞中的嗜酸嗜鹼性物質；DAB染色全稱應該叫做免疫組化DAB染色，經過一系列復雜的生化反應後，DAB(二氨基聯苯胺)染色劑能將辣根過氧化物酶染成棕色。

常用的免疫組化染色方法:
組化用HRP的話，信號不夠強。通常用生物素標記HRP來增強信號。
1、 ABC法（卵白素-生物素-過氧化物酶復合物法）
ABC法是利用卵白素與生物素特有的高度親和力特性，與生物素化二抗結合，形成抗原＋特異性抗體＋生物素化二抗＋卵白素＋生物素＋HRP復合物，最後DAB顯色。
復合物配製：先將生物素與酶結合，形成生物素化HRP，以生物素化HRP與卵白素按一定比例混合，形成卵白素-生物襲森素-過氧化物酶復合物。
2、 SP法（抗生物素蛋白鏈酶素-過氧化物酶復合物）
本身沒有連接生物素，但有兩汪磨個生物素親和力極高的結合位點，可以與二抗上的生物素結合，敏感性高，復合物不需要使用前混合，更為簡便。
3、 PAP法
4、 直接法

樣本制備

免疫組化結果分析
免疫組化結果的判斷原則：
1 、必須設陽性對照和陰性對照。
2 、 抗原表達必須在特定部位。
3 、 陰性結果不能視為抗原不表達。

免疫組化染色實驗組與對照組結果分析表

從表可以看出只有6、7實驗結果有意義。1-5均因對照組的結果已否定Ab的特異性或IHC技術操作存在錯誤等而使實驗結果失去意義，必須重復實驗或換用Ab。

染色失敗的幾種情況及原因:
1、拍陵畝 所染的全部切片均為陰性結果，包括陽性對照在內。
2、 所有切片均呈陽性反應。
3、 所有切片背景過深。
4、 陽性對照染色良好，檢測的陽性標本呈陰性反應。

所有切片呈陽性反應，其原因:
1、 切片在染色過程中抗體過濃，或乾片了。
2、 緩沖液配置中未加氯化納和PH值不準確， 洗滌不徹底。
3、 使用已變色的呈色底物溶液，或呈色反 應時間過長。
4、 抗體溫育的時間過長。
5、 H ₂ O ₂ 濃度過高，呈色速度過快且粘附劑太厚。

所有切片背景過深，其原因:
1、 內源性過氧化酶沒有完全阻斷。
2、 切片或塗片過厚。
3、 漂洗不夠。
4、 底物呈色反應過久。
5、 蛋白質封閉不夠或所用血清溶血。
6 、使用全血清抗體稀釋不夠。

陽性對照染色良好，檢測的陽性標本呈陰性反應。
最常見的原因:標本固定和處理不當。

注意事項：
1、 蘇木素復染時間需要摸索，尤其要考慮陽性染色的位置。
2、 切片脫蠟和水化要充分；加反應液時要覆蓋組織充分；每次加液前甩乾洗滌液，但又防止乾片。
3、 以下原因可能導致片子著色不均勻：
①脫蠟不充分。可以60℃烤20min，立即放入新鮮的二甲苯中。
②水化不全。應經常配製新鮮的梯度乙醇。
③抗體沒混勻。用移液器充分混勻一抗/二抗等試劑。④抗體孵育時，切片放傾斜。
⑤抗體孵育後PBS沖洗不充分。
⑥製片厚薄不均勻等問題。
⑦染片盒不平，切片傾斜。
4、 一抗的清洗:
1、單獨沖洗，防止交叉反應造成污染。
2、溫柔沖洗，防止切片的脫落，推薦用浸洗方式。
3、沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去 結合的物質。
5、 PBS的PH和離子強度的使用：
1、建議PH在7.4-7.6濃度是0.01 M。
2、中性及弱礆性條件（PH7-8）有利 於免疫復合物的形成，而酸性條件則有利於分解；低離子強度有利於免疫復合物的形成，而高離子強度則有利 於分解。
6、 拍照：
1、有條件的話應該立即拍照，若不能及時拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度。