A. 經驗總結：細胞轉染那些事兒
細胞轉染對初接觸細胞實驗的科研人員而言，是一道難過的坎兒，細胞轉染率低的話，你珍貴的細胞可能就只能扔掉了。
大家都知道，細胞是由帶負電荷的磷脂雙分子層構成，這對大分子州消物質來說是個不可透過的屏障，比如DNA和RNA的磷酸骨架，為了使核酸穿過細胞膜，開發了多種技術，大致可分為物理介導、化學介導和生物介導。
幾種常見的轉染方法：
1、脂質體轉染法
陽離子脂質體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用，將DNA分子包裹入內，形成DNA脂復合物，也能被表面帶負電的細胞膜吸附，再通過融合或細胞內吞進入細胞。脂質體轉染適用於把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞中，是目前實驗室最方便的轉染方法之一，其轉染率較高，優於磷酸鈣法。
2、磷酸鈣共沉澱法
該方法可重復性差，而且磷酸鈣溶液對溫度、pH和緩攔顫沖鹽濃度的變化十分敏感，對細胞尤其是原代細胞毒性較大，也不能採用RPMI培養基，因為其含有高濃度的磷酸鹽。
3、電穿孔轉染法
電流能夠可逆地擊穿細胞膜形成瞬時的小孔促使DNA分子進入胞內，這種方法就是電穿孔。
當遇到某些脂質體轉染效率很低或幾乎無法轉入時可以用電穿孔法轉染。
一般情況下，高電場強度會殺死50%-70% 的細胞。現在針對細胞死亡開發出了一種電轉保護劑，可以大大的降低細胞的死亡率，同時提高電穿孔轉染效率。
4、病毒感染
對於脂質體轉染與電穿孔轉染都無法成功轉染的細胞系可以採用病毒感染，腺病毒，腺相關病毒，逆轉錄病毒和慢病毒載體已廣泛用於哺乳動物細胞體內外的基因轉染，簡跡敗轉染效率比較高，適用於較難轉染的細胞。
但是插入的片段長度有一定限制，最重要的是技術難度比較高，在一般實驗室中很難普及，而且某些病毒起效時間比較慢，跟不上細胞這種快速繁殖的速度，如果只是做簡單細胞系的轉染性價比不高。
沒有一種方法適用於所有的細胞和實驗，理想的方法應根據細胞類型和實驗需要進行選擇，如果只是在細胞水平做，而且用的是簡單細胞系，那麼脂質體轉染是綜合比較起來不錯的一個方法。
所以，我們主要來探討一下脂質體轉染：
進行實驗之前，請先規劃好你的實驗，一般細胞轉染需要24h-72h，所以要充分了解細胞生長速度，計算所需脂質體和DNA的儲備量，並確認有足夠的下列材料：Opti-MEM無血清培養基，Lipofectamine轉染試劑，以及DNA，這個一定要確認好，否則生氣都沒辦法怪別人。
做好以上准備後，具體的操作步驟如下：
1、細胞鋪板
(1)一般會選擇復甦細胞傳代3-4次(匯合率達到90%之前對細胞進行傳代，不要長到100%)，從解凍過程中恢復過來可以穩定生長的細胞進行細胞轉染，傳代次數高(>30-40)時，細胞的生長速度和形態會改變。
(2)如果提總蛋白，一般選擇六孔板進行轉染，因為轉染的細胞提取蛋白的總量能達到200ug，一般夠做並且需要的DNA和Lipofectamine又相對比較少。
(3)傳代條件取決於所用的細胞系。對於快速生長的細胞，倍增時間為16小時(如HEK293)。對於生長緩慢的細胞，倍增時間為36小時(如原代細胞)。
(4)轉染當天，將細胞鋪板。如果在轉染前一天或更早時間鋪板，轉染效率可能下降，如果是簡單細胞系的轉染，可以直接在前一天晚上鋪板，第二天來轉染。轉染時，細胞密度會影響轉染效率，細胞密度保持在匯合率為70-90%(這個前提是轉染24h，如果轉染48h則需要匯合率為50-70%)，細胞的鋪板和轉染也可同時進行。
2、細胞轉染
吸去培養皿中的培養基，用PBS或者無血清培養基清洗一次。更換無血清培養基。准備轉染制備液，用滅菌後的EP管制備。
以六孔板為例，A液：用200μl Opti-MEM稀釋4μg質粒;B液:用200μl Opti-MEM稀釋10μl lipo2000，分別將A液、B液輕輕混勻，靜置5min，吸取B液加入至A液中，輕輕混勻，室溫靜置20min。
加入轉染試劑到每個孔的培養基中，6h後，更換成完全培養基，繼續培養到24-48小時(不同的質粒和脂質體最佳搭配比例不同，轉染前，應該摸一個最佳配比。質粒：脂質體=1：1，1：1.5，1：2，1：2.5，1：3，1：3.5的梯度比例來檢測最佳轉染比例，一般質粒有帶熒光，可以通過觀察每組熒光強弱來判斷轉染效率)。以下為不同規格的培養板需要加DNA和lipo2000的量。
轉染時，應使用優質質粒：
1、通過測量OD 值來確定DNA純度和濃度，測得的OD值應介於1.7-1.9之間。脂質體轉染基於電荷吸引原理，如果DNA不純，如帶少量的鹽離子，蛋白，代謝物污染都會顯著影響轉染復合物的有效形成及轉染的進行。
2、含有內毒素的質粒對細胞有很大的毒性作用。
轉染時，小心輕柔的將lipo2000加到培養基中並輕輕混勻，避免粗暴用力吹打，會導致脂質體失效。
血清一度曾被認為會降低轉染效率，老一代的轉染方法往往要求轉染前後用PBS洗細胞然後在無血清培養基條件下轉染，但有些對此敏感的細胞會受到損傷，甚至死亡(比如貼壁較差的細胞，在PBS洗滌時很容易沖刷細胞)導致轉染效率極低。
不過轉染產品配方幾經革新後的今天，對於主流的轉染試劑來說，血清的存在已經不會影響轉染效率，甚至還有助於提高轉染效率，但是血清的存在會影響DNA-轉染復合物的形成，在DNA-轉染復合物形成時需用無血清培養基opti-MEM來稀釋DNA和轉染試劑，在轉染過程中是可以使用血清的。
轉染後6小時更換培養基，因為lipo2000具有一定毒性。
細胞培養過程中往往會添加抗生素來預防污染，但是抗生素可能對轉染造成困擾。比如青黴素和鏈黴素，青鏈黴素是我們常用來預防污染的抗生素，就會影響轉染，雖然這些抗生素一般情況下對於真核細胞無毒，但當轉染試劑增加了細胞的通透性時，就會使抗生素也進入細胞從而間接導致細胞死亡，造成轉染效率低。
目前轉染試劑有些已經可以全程都用有血清和抗生素的完全培養基來操作，非常方便，省去了污染等麻煩。
3、觀察轉染的效果
在轉染後24小時，用熒光顯微鏡觀察實驗結果並記錄熒光蛋白表達情況，如下圖所示，說明轉染成功，且轉染效率還可以，如果不帶有熒光，可以用GFP來對照，可以放在一個單獨的孔中，或是與目標質粒共轉染，同時用Q-PCR和者WB來檢測。
轉染後發現轉染效率不高，可以通過兩種方法：
1、復轉染，即轉染後12-24小時再次進行轉染，前提是該細胞對脂質體的耐受性較好，轉染後細胞死亡數較少。
2、通過葯篩來殺死未轉入成功的細胞。前提是該質粒帶有抗生素抗性的基因。
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B. RNA mimic細胞轉染實驗操作步驟
下面以 Entranster-R4000 試劑為例，說一下 RNA
mimic 轉染步驟漏虧（ 24 孔板）
1. 提前 1 天細胞種植
貼壁細胞：提前一天將細胞種植在24孔板中，以轉染時細胞匯合度（Confluence）在30％左右為返蔽神宜，轉染前全培養基總量為0.45ml。
懸浮細胞：採用對數生長期的細胞，數量為常規培養細胞數的1/3進行轉染實驗。如某細胞常規培養的細胞數是6×105，那麼就用2×105的細胞進行轉染。
2. 轉染過程
⑴取0.67ug(50pmol)的RNA mimic，加入一定量無血清稀釋液，充分混勻，製成RNA稀並輪釋液，終體積為25μl。
注意：無血清稀釋液建議採用OPTI-MEM、無血清DMEM或1640。
⑵取1ul的EntransterTM-R4000，然後加入24ul無血清稀釋液體，充分混勻，製成EntransterTM-R4000稀釋液，終體積為25μl。室溫靜置5分鍾。
⑶將EntransterTM-R4000稀釋液和RNA稀釋液充分混合（可用振盪器振盪或用加樣器吹吸10次以上）混合，室溫靜置15分鍾。轉染復合物制備完成。
⑷將50μl轉染復合物滴加到有0.45ml全培養基（可含10%血清和抗生素）的細胞上，前後移動培養皿，混合均勻。
注意：對本試劑，採用含血清的全培養基有助於提升轉染效率。
⑸轉染後6小時觀察細胞狀態，如狀態良好可不必更換培養基，繼續培養24-96小時得到結果。
C. 細胞轉染的方法
DEAE-葡聚糖法。
磷酸鈣共沉澱轉染。
電穿孔法。
脂質體法。
病毒介導的感染，病毒感染增強劑。
非脂質體轉染 。
D. RAW264.7細胞轉染詳細點的注意事項及操作步驟
1.細胞接種：一般做轉染前一天接種/鋪板（細胞計數大約5*10^4cell/ml），使做轉染前細胞密度在30-50%。
2.為了能在使用時有較好的轉染效果，第一次使用建議您用24孔板做，每孔2ul轉染試劑即可。將最佳轉染條件（siRNA與轉染試劑的用量、比例）放大到對應的孔板即可。
3.設置siRNA終濃度10nM,30nM,50nM,100nM四個尺頃梯度，每個梯度最好做2-3個復孔（至少2個復孔，避免實驗誤差）。
4.用來稀釋siRNA和Rfect的培養基必須是無血清培養基，缺讓因為血清的存在會干擾siRNA與轉染試劑的混合，並且影響轉染效率。
5.檢測方法：轉染後48h收細陵扮陸胞做qPCR基因水平檢測或者轉染後72h收細胞提蛋白做western Blotting蛋白水平檢測。
1．配置TBS-D溶液
100mlTBS加入20％葡萄糖溶液0.5ml，至終信野賣濃度為1％。
2．配置DEAE-dextran-DNA-TBS-D轉染液
DEAE-dextran 1mg/ml
DNA(超螺旋) 5-10ug/ml(DNA濃度根據細胞種類、細胞密度及質粒種類決定，最適濃度經預實驗確定)
轉染液數量根滑逗據細胞多少決定，一般每瓶細脊指胞需300ul。
3．以5×105/瓶密度接種細胞，培養24小時。
4．細胞棄培養基, PBS 5ml洗兩遍, TBS-D洗一遍，吸盡殘液。
5．加入轉染液，搖動培養瓶，使其與細胞充分接觸，放入孵箱溫育20－40分鍾，觀察細胞至皺縮變圓為止。
6．吸去轉染液，TBS-D洗兩遍, PBS洗一遍（動作必須輕柔，避免已轉染DNA的細胞脫落），加入10ml全培養基 3％CO2濃度37℃培養。
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F. 把質粒轉入細胞的方法步驟是什麼啊請教一下
要看你是什麼細胞，是想過表達還是knock down一個基因，穩轉還是瞬轉。
細胞轉染是指將外源分子如DNA，RNA等導入真核細胞的技術。隨著分子生物學和細胞生物學研究的不斷發展，轉染已經成為研究和控制真核細胞基因功能的常規工具。在研究基因功能、調控基因表達、突變分析和蛋白質生產等生物學試驗中，其應用越來越廣泛。
方法
脂質體轉染法
陽離子脂質體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用，將DNA分子包裹入內，形成DNA脂復合物，也能被表面帶負電的細胞膜吸附，再通過融合或細胞內吞進入細胞。脂質體轉染適用於把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞中，是目前實驗室最方便的轉染方法之一，其轉染率較高，優於磷酸鈣法。由於脂質體對細胞有一定的毒性，所以轉染時間一般不超過24小時。常用細胞類型：cos-7 、BHK、NIH3T3 、Hela等。
電穿孔轉染法
電流能夠可逆地擊穿細胞膜形成瞬時的水通路或膜上小孔促使DNA分子進入胞內，這種方法就是電穿孔。當遇到某些脂質體轉染效率很低或兒乎無法轉入時建議用電穿孔法轉染。一般情況下，高電場強度會殺死50%-70% 的細胞。現在針對細胞死亡開發出了一種電轉保護劑，可以大大的降低細胞的死亡率，同時提高電穿孔轉染效率。
病毒感染
對於脂質體轉染與電穿孔轉染都無法成功轉染的細胞系建議用病毒感染，此法可以快速100%感染，檢測成功率高。
常用步驟
1. 轉染試劑的准備
① 將400ul去核酸酶水加入管中，震盪10秒鍾，溶解脂狀物。
② 震盪後將試劑放在－20攝氏度保存，使用前還需震盪。
2. 選擇合適的混合比例(1：1－1：2/脂質體[1] 體積：DNA質量)來轉染細胞。在一個轉染管中加入合適體積的無血清培養基。加入合適質量的MyoD或者EGFP的DNA，震盪後在加入合適體積的轉染試劑，再次震盪。
3. 將混合液在室溫放置10―15分鍾。
4. 吸去培養板中的培養基，用PBS或者無血清培養基清洗一次。
5. 加入混合液，將細胞放回培養箱中培養一個小時。
6. 到時後，根據細胞種類決定是否移除混合液，之後加入完全培養基繼續培養24－48小時。
G. 轉染6孔板後，怎麼收集我的細胞，然後提蛋白
轉染6孔板後，一般長到十的六次方級別就可以提蛋白了
可以用移液器將細胞吸出來並高速離賀余枯心，沉澱重懸於PBS中毀配洗滌，接著就可以裂解提取蛋白了。可以用超聲，酶解等等，裂解後離禪洞心收集上清。
H. 慢病毒轉染細胞的操作步驟，求大神發一份，感激不盡！！！
你好，慢病毒轉染細胞的操作步驟如下：
1、慢病毒轉染前18-24小時，將貼壁細胞以1×10^5/孔鋪到24孔板中。使細胞在慢病毒轉染時的數量為2×10^5/孔左右。
2、第二天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鮮培養基替換原培養基，加入適量病毒懸液。37℃孵育。
3、(對polybrene毒性敏禪櫻感的細胞選作此步驟)4小時後加入2ml新鮮培養基以稀釋polybrene。
4、繼續培養24小時，用新鮮培養基替換含有病毒的培養基。
5、繼續培養。如果慢病毒含有熒光蛋白，一般轉染48小時後可見明顯熒光表達，72小時後更加明顯。如需FACS檢測轉染效率，可在轉染後72-96小時進行。如果慢病毒含有抗性基因並且需要加葯篩選，可以在轉染3-4天後開始加葯。
二、慢病毒轉染懸浮細胞實驗方法
1、在2×10^5/ml懸浮細胞中加入polybrene至6 μg/ml和適量病毒，充分混勻。37℃昌襲指孵育。或者150g室溫離心4小時(選作，部分難轉染的細胞系採用此步驟可以提高轉染效率)。
2、(對polybrene毒性敏感的細胞選作此步驟)4小時後(或耐配離心結束後)加入等體積新鮮培養基以稀釋polybrene。
3、繼續培養3-4天。中間視細胞生長情況可傳代或換液。