㈠ 根據目的基因構建重組質粒的步驟
（1）用限制酶將質粒切割開形成黏性末端，用DNA連接酶將目的基因與質粒連接起來． （2）質粒的實質是環狀DNA，基本組成單位是脫氧核苷酸；由圖中限制酶切割位置可知，目的基因插入的位置是氨苄青黴素抗性基因中． （3）步驟③是基因工程第三步：將目的基因導入大腸桿菌（受體細胞）．為了促進該過程，用Ca 2+ 處理大腸桿菌，使之成為感受態細胞． （4）培養基C是選擇培養基，培養基中有四環素，專一篩選含四環素抗性基因的大腸桿菌，能在C中生長的大腸桿菌有兩種，分別是含有抗四環素基因、同時抗四環素基因和含氨苄青黴素基因的大腸桿菌． （5）D培養基中大腸桿菌能抵抗四環素和含氨苄青黴素，而E中只抗一種四環素，所以在E中對應區域（D中沒有菌落的部位），該處為轉基因大腸桿菌，結果如圖： 故答案為： （1）限制酶 DNA連接酶 （2）脫氧核苷酸 氨苄青黴素抗性 （3）將重組質粒（目的基因）導入大腸桿 菌（受體細胞） Ca 2+ （4）2 （5）E 如下圖所示（兩點全圈出給分）． （1）限制酶 DNA連接酶 （2）氨苄青黴素抗性 （3）將重組質粒導入大腸桿菌（受體細胞） Ca 2+ （4）含四環素抗性基因的大腸桿菌 2 （5）E
㈡ 構建質粒載體的大體步驟是什麼
（1）根據你已知的序列設計帶有酶切位點的引物。
（2）PCR，跑膠，看看你的目的條帶大小對不。
（3）條帶對的話再重新跑個大孔膠，然後切膠回收。（具體步驟根據你們所用試劑盒上的說明書進行），切膠回收後還需電泳，看你回收後怎麼樣。
（4）拿著你的回收液與你的TA載體進行連接（具體操作見載體試劑盒說明書）
（5）連接後要轉化進大腸桿菌感受態中。37℃ 200rpm 搖菌一個小時。
（6）之後塗布至固體培養基上。（培養基是帶有抗生素的，這個抗生素的選擇要根據你的載體來選）
（7）37℃倒置培養一夜
（8）第二天早上，挑取單菌落，進行菌落PCR，檢測是否為假陽性。
（9）PCR之後如果條帶正確，則搖菌，搖的就是你檢測之後的那個單菌落。
（10）可以直接拿菌落測序，或者提取質粒測序。（記住要保存菌種）
（11）如果測序得到的序列確實為你最初設定的那個序列，則再搖你保存的那個菌種。
（12）提取質粒，做酶切。酶切的體系要看你所用的酶。
（13）酶切後還是需要進行回收。
（14）將回收的片段與你已經酶切好的表達載體的片段連接。
（15）再轉化至大腸桿菌擴增。
（16）PCR檢菌，酶切檢菌。
（17）檢菌正確，則你的表達載體構建完成。
因為我不知道你是否要構建到表達載體中，還是構建到克隆載體就可以，所以後面說的不是很詳細，但是大體的步驟就是這樣，只要你會構建克隆載體了，後面的表達載體基本也沒有問題了，只是多下些功夫就可以了。
我上面說的都是很簡單的語言，只供參考，不能作為書面語。有什麼問題可以再交流。
㈢ 怎樣構建質粒
分別將這兩個基因插入到相應的載體中使用酶切，連接，轉化，鑒定的方法就可以進行質粒構建了！
㈣ 怎麼構質粒
分別將這兩個基因插入到相應的載體中使用酶切,連接,轉化,鑒定的方法就可以進行質粒構建了!
㈤ 2020-08-24質粒構建
獲取一個基因CDS序列的方法如下：
打開NCBI（ https://www.ncbi.nlm.nih.gov ），如下圖，按照順序，在1處選擇Nucleotide，在2處輸入「PDCD1」，點擊3處的Search，等出來結果之後點擊4處的「Homo Sapiens」進行進一步篩選（如果你要做鼠源的就選Mus musculus，其他種屬選擇相應的名稱即可進一步篩選了）
然後第一條就是我們需要的序列信息，點擊進去，往下拉，直到看到CDS（如下圖）
點擊CDS，就出現了下圖中所示內容，其中加了底色的部分序列便是我們需要的序列了，可以看到這段序列開頭是ATG起始密碼子，最後三位是TGA終止密碼子。選中這段序列復制即可。
由於需要PCR整個CDS區域，所以正反向引物並沒有多少選擇的餘地，甚至可以參照上述原則簡單粗暴的從正反向各選擇22個鹼基左右作為引物，例如：!
正向引物序列與CDS相同，反向引物序列與CDS互補。另外要注意的是寫引物等序列都是要5』到3』的方向，一般不會從3』到5』，所以我們的CDS雖然沒有註明方向，但是其實也是5』到3』。
雖然可以這么簡單粗暴的設計引物，但是還是想藉此教大家使用一下引物設計的經典軟體Primer Premier 5。
Primer 5的使用
如下圖，首先點擊File->New->DNA Sequence，
然後點擊空白處Ctrl+V粘貼我們的CDS序列，選擇As is，即我們復制的是什麼樣的序列就粘貼的什麼樣的序列。
下面的依次是「反向序列粘貼」、「互補序列粘貼」「反向互補序列粘貼」。
點擊左上角的Primer，如下圖，S=Sense，A=Antisense
如果對現在的引物不滿意，還可以點擊Edit Primers編輯序列，如下圖，我們刪除掉末尾三個鹼基，之後需要先點擊Analyse，然後才能點擊OK，我們可以看到正向引物已經從25個鹼基變為22個鹼基了。
最後點擊Edit->Copy->Sense Primer，粘貼到Word中即可得到正向引物，反向引物Copy之後粘貼也會自動變為5』到3』的序列。所以非常方便。
這樣我們PDCD1用於PCR的正反向引物就初步設計好了。如果你只是想P出PDCD1這個基因，現在的引物就可以送去合成了，但是如果你想將其構建到載體上，那麼我們還要對其進行進一步的加工。
Primer 5的使用
根據不同的目的，可以選擇不同的載體，如過表達（pcDNA 3.0）、敲減（pLKO.1-TRC）、原核純化（pGEX-4T1、pET-28a）、病毒包裝（pMSCV-puro）、敲除（lentiCRISPR v2）等。下面我們就以過表達載體pcDNA 3.0為例進行講解。
從質粒圖譜上可以看到多克隆位點有多個酶切位點可以選擇，那是不是每個位點都可以用呢？當然不是！我們要 選擇那些PDCD1（或其他目的基因）本身沒有的酶切位點！
所以我們還需要用Primer 5來分析一下哪些是PDCD1所沒有的。
還是打開Primer 5，然後粘貼CDS序列，點擊Enzyme，2為所有的酶，我們比對質粒圖譜選擇多克隆位點的酶，雙擊即可到3的框中，選好之後點擊OK，可以看到PDCD1中有ApaI和KpnI兩個酶切位點，所以這兩個不可以選，其他的都可以選。
不過一般選擇常用好用的最好是實驗室就有現成的那些酶了。比如我們選擇EcoRI和XhoI，那麼我們就可以在對引物加上相應的酶切位點了。
於是我們得到如下引物：
好了，我們現在就可以將這些引物送去相應公司合成了。
質粒構建
終於到正題了！
待引物合成之後，我們用ddH2O將其稀釋到 100 μM 作為母液，取一些稀釋到 10 μM 做下一步實驗了。
首先我們P出目的基因，這一步建議用高保真PCR酶，我常用的是 Toyobo公司的KOD-PLUS-Neo酶 。反應體系及反應條件如下圖：
模板的獲取
PCR完成之後跑1%的膠回收目的片段，也可以直接用PCR Clean試劑盒回收。回收之後將其雙酶切，同時需要酶切適量載體。如果你使用的是Fermentas (Thermo)的酶，還可以打開網址 http://t.cn/RVuwBVo 查詢雙酶切所用的最佳Buffer。
酶切回收之後的片段進行連接，我使用的是 Thermo公司的T4連接酶 ，體系如下：
現在的T4連接酶基本都是快酶，比如Thermo的這款聲稱10 min就可以連接完成，不過我保險起見，一般連接30 min， 切勿連接過夜！
連接完成之後便是轉化，挑菌（單克隆），搖菌抽提質粒，送去測序就OK了！
TRIzol法抽提RNA
提取RNA比較成熟的方法便是TRIzol法抽提，Invitrogen的TRIzol是比較穩定且廣泛應用的，當然現在一些國產的TRIzol類產品也能滿足大部分情況下的RNA抽提。
ABOUT TRIzol
注意事項及原理
注意事項：
1、RNA酶（RNase）非常穩定，是導致RNA降解最主要的物質。它在一些極端的條件可以暫時失活，但限制因素去除後又會迅速復性。用常規的高溫高壓蒸汽滅菌法和蛋白抑制劑都不能使RNase完全失活。它廣泛存在於人的皮膚上，因此，在與RNA制備有關的分子生物學實驗時，必須戴手套。RNase的又一污染源是取液器，一般情況下採用用DEPC配製的70%乙醇擦洗取液器的內部和外部。提取RNA時使用專門的RNase-free的槍頭和離心管。
2、TRIzol試劑具有較強毒性，如沾到皮膚立刻用大量的清潔劑和水沖洗！
溶液配方及原理：
1、TRIzol試劑：TRIzol能在破碎細胞、溶解細胞內含物的同時保持RNA的完整。其主要成分是苯酚和異硫氰酸胍。苯酚的主要作用是裂解細胞，使細胞中的蛋白、核酸物質解聚得到釋放。異硫氰酸胍，是一種強力的蛋白質變性劑，可溶解蛋白質並使蛋白質二級結構消失，導致細胞結構降解，核蛋白迅速與核酸分離。
2、氯仿：氯仿可增強TRIzol中的8-羥基喹啉對RNase的抑製作用。另外氯仿作為有機溶劑，加入氯仿後離心可使溶液分層，上層為水相，下層為有機相。苯酚為弱酸性，酸性條件下（一般為Ph5.0）DNA和蛋白質進入有機相，而RNA留在水相；反之亦然，弱鹼性（Ph8.0）時DNA留在水相。
3、異丙醇、無水乙醇、70%乙醇：異丙醇和乙醇能與水任意比例互溶，因此加入異丙醇能夠奪取RNA周圍的水分，使其脫水沉澱。
4、DEPC水：DEPC是RNase的化學修飾劑，它與RNase的活性基團組氨酸的咪唑環反應而抑制其活性。DEPC有毒性，操作時應小心。誰說是最優秀的；誰是最自由的，誰也就是最優秀的，在他們身上，才會有最大的美。
操作步驟
1、細胞破碎
A、組織：按1 mL/50~100 mg組織樣品的比例向打散的組織塊中加入TRIzol試劑，樣品的體積不能超過TRIzol體積的10%。
B、貼壁細胞：按1 mL/10 cm2的比例直接加入TRIzol試劑，並用移液槍反復吹吸數次。TRIzol試劑過少會導致DNA污染。
C、懸浮細胞：懸浮細胞離心收集後，直接按1 mL/5~10×106個細胞（動物、植物或酵母）的比例加入TRIzol試劑。加入TRIzol前不要洗細胞，否則易造成mRNA的降解。
如果樣品中含有較多的蛋白、脂肪、多糖或其他細胞外物質，如肌肉、脂肪組織或植物的塊根等，可在2℃~8℃，12000×g離心10 min去除這些物質。
關於TRIzol的用量，Invitrogen官方說明書中有建議用量：
一般情況下，根據細胞量的多少我的用量是：2~3 mL/10 cm Dish、500μL~1 mL/6 cm Dish、200~500 μL/3.5 cm Dish（僅供參考）
2、氯仿抽提分層
加入TRIzol後，室溫（15℃~30℃）孵育5 min保證核蛋白復合體充分解離。按0.2 mL/1 ml TRIzol的比例加入氯仿。蓋緊管蓋後劇烈搖晃15s，室溫靜置2 3分鍾。12000×g，2℃ 8℃離心10 min，轉速不可過高否則會導致RNA斷裂。離心後液體分為三層，下層為紅色的有機相（酚-氯仿），中間為白色的沉澱，上層為無色的水相。RNA在上層水相中，水相的體積約為加入的TRIzol體積的60%。
3、用異丙醇使RNA沉澱
將上層水相轉移到一個干凈的1.5 mL管中，如需提取DNA或蛋白質就保存下層有機相。
加入與水相等體積的異丙醇，室溫孵育10 min。12000×g，2℃~8℃離心10 min。RNA沉澱一般附著在遠離離心機軸心的管底，為無色膠狀。
4、用乙醇洗滌去除殘留的蛋白質和無機鹽
去除上清後，用1 mL 75%乙醇（用Rnase-free的水配製）洗滌RNA沉澱。震盪混勻RNA後，7500×g 2℃~8℃離心5 min。
5、用DEPC水溶解RNA
去除上清後，將管子敞口晾5~10 min，使RNA沉澱呈現半透明狀。不要讓RNA沉澱變成完全不透明，那時RNA完全乾燥將會大大影響RNA的溶解。根據後續實驗要求加入適量的DEPC水，用移液槍反復吹吸數次後。
逆轉錄法合成cDNA
一般逆轉錄（也可稱作反轉錄）都有現成的試劑盒，只要大家按照試劑盒的說明書來操作，問題都不大，在這里我就以TAKARA的逆轉錄試劑盒為例稍加說明。
Random 6 mers 為隨機的6核苷酸引物，引物序列為5'-(P)NNNNNN-3'，特點是產物量大，特異性差，適用於長的或具有Hairpin構造的RNA。包括rRNA、mRNA、tRNA等在內的所有RNA的反轉錄反應都可使用本引物。
Oligo dT Primer 適用於具有Poly（A）Tail的RNA，因而特異性好，但因其只結合Poly A尾巴，對於較長的mRNA，經常不能延伸到5'端。（原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些種類真核生物的mRNA等不具有Poly（A）Tail）。
兩種引物可據實際情況使用一種，也可同時使用。還有一種情況，當只擴增一種目的基因時，也可以使用Specific Primer（PCR時的下游引物）作為反轉錄引物。
操作步驟
步驟簡述如下：按照下圖中1配製溶液，然後65℃處理後加入3中所配製溶液繼續後續反應即可。
連接產物的轉化
常用的感受態細胞有DH5α、BL21（DE3）、Rossetta等，而抽提質粒一般用DH5α，可以自己制備也可以購買商業化的感受態。
ABOUT Transformation
注意事項
1. 感受態細胞要現用現融，剛剛融化的感受態轉化效率最高；
2. 避免反復凍融感受態細胞；
3. 整個操作過程要輕柔，不要用移液器猛烈吹吸；
4. 感受態和連接產物（或質粒）用量要適中，並不是越多越好。
操作步驟
1. 取50 μL感受態細胞置於冰上融化；
2. 加入5 μL連接產物（質粒一般只需用白色槍頭沾取一下即可），混勻，置於冰上靜置30 min（此時應該打開水浴鍋並調溫至42℃）；
3. 42℃水浴中熱激90 s，迅速置於冰上靜置2 min；
4. 加入500 μL無菌的LB培養基（不含抗生素），混勻後置於37℃，200rpm的恆溫搖床中培養1 h，使細胞復甦；
5. 連接產物：3000 rpm離心5 min，棄上清，留取少量LB（50 μL左右），重懸沉澱，全部均勻塗布於LB培養板（需含相應抗生素）上，37℃ 倒置培養 16 18h；質粒：直接取20 50 μL塗於LB培養板上培養即可。
質粒的小量提取
ABOUT 質粒抽提
實驗原理：
較常用的質粒提取方法有三種：鹼裂解法、煮沸法和去污劑（如Triton和SDS）裂解法。前兩種方法比較劇烈，適用於較小的質粒（<15kb）。去污劑裂解法則比較溫和，一般用於分離大質粒（>15kb）。
鹼裂解法是一種應用最為廣泛的制備質粒的方法，其原理為：當細菌暴露於高pH值的強陰離子洗滌劑中，會使細胞壁破裂，染色體DNA和蛋白質變性，將質粒DNA釋放到上清中。
由於質粒DNA分子比染色體DNA大得多，且前者為共價閉合環狀分子，後者為線狀分子。只要鹼處理的強度和時間不要太過，當pH值恢復到中性時，質粒DNA雙鏈就會再次形成。
在裂解過程中，細菌蛋白質、破裂的細胞壁和變性的染色體DNA會互相纏繞成大型復合物，後者被十二烷基硫酸鹽（SDS）包蓋。
當用鉀離子取代鈉離子時，這些復合物會從溶液中有效地沉澱下來。離心除去沉澱之後，就可以從上清中回收復性的質粒DNA。
本方法採用Tiangen小提中量試劑盒進行提取，其純化系統是硅基質吸附材料，其原理為在高鹽環境下質粒DNA能夠結合到硅基質上，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質和其它細菌成分去除，最後用低鹽緩沖液或水將質粒DNA從硅基質上洗脫下來。得到的質粒可以用於酶切、PCR、測序、細菌轉化、轉染等分子生物學實驗。
實驗試劑（試劑盒試劑配方不清楚，以下配方見《分子克隆實驗指南》）
1、溶液P1：50 mM葡萄糖，25 mM Tris-Cl（pH 8.0），10 mM EDTA，100μg/ml RNase A
原理：Tris-Cl用於提供一個合適的緩沖體系；50 mM葡萄糖可以使懸浮後的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部；而EDTA 作為Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，起到了抑制DNase的作用；RNase作用為去除質粒中混有的RNA，其不受EDTA的影響。
2、溶液P2：0.2 N NaOH，1% SDS
原理：0.2 N NaOH的作用在於使細菌裂解，而SDS作用在於加入P3之後是被其包蓋的細菌蛋白，染色體DNA一起作為沉澱析出。
3、溶液P3：3 M 醋酸鉀，2 M 醋酸
原理：這一步的K+置換了SDS（十二烷基磺酸鈉）中的Na+，得到PDS（十二烷基磺酸鉀）沉澱；SDS易與蛋白質結合，平均兩個氨基酸上結合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產生的大量沉澱自然就將絕大部分蛋白質也沉澱了，同時染色體DNA也被PDS共沉澱。而醋酸用於中和鹼，使溶液恢復中性，從而使質粒DNA復性。
操作步驟
1、將過夜培養的菌液（5-15ml）從搖床中取出，並擰緊蓋子，9000 rpm離心10 min，用泵盡量吸除上清。若暫時不提取，可將沉澱保存於-20℃，也可直接將菌液保存於4℃（短時間）。
注意：如果菌液較多時可以通過幾次離心將菌體沉澱收集到一個離心管中。
2、柱平衡步驟：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL, 12000 rpm（-13400g）離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中（請使用當天處理過的柱子）。
注意：若柱子放置較久，需要進行這一步驟；否則，可省。
3、向留有菌體沉澱的離心管中加入500μl溶液P1（請先檢查是否已加入RNaseA，並置於冰上 ) ，使用移液器或渦旋振盪器徹底懸浮細菌細胞沉澱，並移至2ml離心管中。如果沉澱的菌體較多，則相應增加P1的用量（之後P2和P3的用量也應成比例增加），並分到幾個管子中分別進行步驟4和5的操作（不然P1+P2+P3的總體積超過2ml離心管容積），步驟6過上清時可過同一個吸附柱。
注意：菌體量以能夠充分裂解為佳，過多的菌體裂解不充分會降低質粒的提取效率。另外，務必徹底懸浮細菌沉澱，如果有未徹底混勻的菌塊會影響裂解，導致提取量和純度偏低。
4、向離心管中加入500μl溶液P2 ，溫和地上下翻轉6-8 次使菌體充分裂解。由於P2裂解不應超過5 min，以免質粒受到破壞。故加入P2前將計時器定時4 min，以免超過時間。但是時間也不可過短，以免裂解不徹底。每管操作時間盡量一致。
注意：溫和地混合不要劇烈震盪，以免污染基因組DNA 。此時菌液應變得清亮粘稠，如果未變得清亮，可能由於菌體過多，裂解不徹底，應減少菌體量。
5、向離心管中加入700μl溶液P3（記得冰上預冷），立即溫和地上下翻轉6-8 次，充分混勻，此時會出現白色絮狀沉澱。放置冰上10min，之後12000rpm ( -13400g ）離心10 min，此時在離心管底部形成沉澱。如果上清量較大，需要多次過柱，可將上清轉移至新的離心管中，以免沉澱飄起。
注意：P3 加入後應立即混合，避免產生局部沉澱。如果上清中還有微小白色沉澱，可再次離心後取上清。
6、將上一步收集的上清液分次加入吸附柱中（吸附柱放入收集管中，其容量為750-800μl）,注意盡量不要吸出沉澱。 12000rpm（-13400g ）離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。
7、可選步驟：向吸附柱中加入500ul去蛋白液PD，12000rpm（-13400g ）離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
注意：如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM101，ET12567等），這些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解質粒DNA，推薦採用此步。
如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α，TOP10等），這步省略。
8、向吸附柱中加入600μl漂洗液PW（請先檢查是否已加入無水乙醇），12000rpm（-13400g）離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。
注意：加入漂洗液PW後，如果室溫靜置2-5 min，有助於更好地去除雜質。
9、重復操作步驟8。
10、將吸附柱重新放回收集管中置於12000rpm（-13400g ）離心2 min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。
注意：漂洗液中乙醇的殘留會影響後續的酶反應（酶切、PCR 等）實驗。為確保下游實驗不受殘留乙醇的影響，建議將吸附柱開蓋，置於室溫放置數min，以徹底晾乾吸附材料中殘余的漂洗液。
11、將吸附柱置於一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100-300μl洗脫緩沖液EB（65℃預熱），室溫放置或65℃水浴2 min，12000rpm（-13400g ）離心2min將質粒溶液收集到離心管中。
注意：為了增加質粒的回收效率，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中．重復步驟
11、洗脫液的pH 值對於洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液，應保證其pH 值在7.0-8.5 范圍內（可以用NaOH 將水的pH 值調到此范圍）, pH 值低於7.0 會降低洗脫效率。洗脫緩沖液體積不應少於100μl，體積過小影響回收效率，但也不應過大，以免所提質粒濃度過低，影響後面的使用。且DNA產物應保存在-20 ℃ ，以防DNA 降解。
結果判斷
1、使用紫外分光光度計對質粒濃度及純度進行測定
（1）檢測波長為260nm和280nm，濃度看OD260，OD260值為1相當於大約50μg/ml；純度看OD260/OD280，OD260/OD280比值應為1.7-1.9，偏低可能是蛋白質污染，偏高則可能是DNA降解或RNA污染，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會偏低，但並不表示純度低，因為pH值和離子存在會影響光吸收值。另外，測出來的OD260和OD280都應該在0.1-2.0之間，不然所得出的濃度和純度不準確。
（2）應該注意的是作為空白對照的blank管稀釋方法應該和所測樣品管一樣（如樣品為2μl所提質粒+48μl ddH2O，則blank為2μl洗脫液+48μl ddH2O）。
2、酶切鑒定，並用瓊脂糖凝膠電泳檢測
（1）選用合適的內切酶對所提質粒進行酶切，並與未切質粒及轉化用原質粒一起用瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據酶切結果及所提質粒與原質粒位置是否一致，可以判定所提質粒是否為目的質粒。
（2）所提質粒（未酶切）的電泳條帶可能為一條帶，也可能為二到三條帶，這是因為質粒提取過程中操作過於劇烈可能使環狀超螺旋結構的質粒DNA單鏈出現缺口（保持環狀，失去超螺旋），或雙鏈斷裂（變成線狀），三種構型的質粒分子在瓊脂糖凝膠電泳中的遷移速率是不一樣的，因此會出現多條帶，這也說明所得質粒不夠理想。
測序結果的分析
構建好質粒之後我們一般先酶切鑒定，鑒定正確的可以直接拿去轉染然後做WB檢測表達即可。
可以正常表達的質粒我們需要送到測序公司測序，也可以直接送菌液測序，有些測序公司還提供質粒返還服務（即送菌液返還他們抽提的質粒）。
測序的引物一般使用通用引物，如果沒有通用引物需要自行設計。常用的通用引物如下：
在公眾號內回復「 通用測序引物 」獲取此Excel！
測序結果返回之後我們就可以分析測序結果了。
一般常用的序列比對軟體有DNAMAN和Chromas，當然，還有很多類似軟體，大家可以根據個人習慣選擇，在這里就不一一介紹了。
DNAMAN
1. 首先打開軟體，左側數字為各個通道的編號，每個通道只能載入一個序列：
2. 然後點擊File->New，將我們目的基因的CDS序列粘貼進去，Ctrl+A全選，右鍵選擇Load Selected Sequence，將序列載入通道1。
3. 選擇通道2（點擊數字2即可），點擊File->Open打開測序回來的序列信息（後綴為.seq），同樣全選右鍵載入通道2，之後點擊Sequence->Multiple Sequence Alignment；
4. 在彈出窗口中，點擊Channel，選中需要比對序列的通道，點擊OK即可：
5. 後面基本是一直點擊下一步，在如下圖窗口中選中Try both strands：
6. 然後一直下一步，出來如下結果，即可比對測序結果和原CDS序列，如果有突變我們需要看一下是否是同義突變，如果是即質粒序列正確。
Chromas
1. 用Chromas軟體打開測序返還的序列信息，然後點擊File->Blast Search: