抗生素的含量測量方法

㈠ 如何進行抗生素葯敏試驗

你好！
葯敏試驗
葯敏試驗根據美國臨床標准委員會（NCCLS）推薦的K-B瓊脂法進行，葯敏紙片選擇中國生物製品鑒定所葯敏紙片，試驗所選擇葯物必須包括下列抗生素：氨苄西林（AMP），阿莫西林/克拉維酸（AMC），頭孢噻吩（CFT），頭孢噻肟（CTX），慶大黴素（GEN），萘啶酸（NAL），環丙沙星（CIP），四環素（TBT），利福平（RFA），復方新諾明（SMZ）。葯敏結果判定標准按照NCCLs手冊2005版。
1. 操作方法：
（1）將待檢菌接種於普通營養瓊脂平板，37℃培養16～18小時，然後挑取普通營養瓊脂平板上的純培養菌落，懸於3ml生理鹽水中，混勻後與菌液比濁管比濁。以有黑字的白紙為背景，調整濁度與比濁管（0.5麥氏單位）相同。
（2）用無菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上擠壓去掉多餘菌液。用棉拭子塗布整個M-H培養基表面，反復幾次，每次將平板旋轉60度，最後沿周邊繞兩圈，保證塗均勻。
（3）待平板上的水分被瓊脂完全吸收後再貼紙片。用無菌鑷子取葯敏紙片貼在平板表面，紙片一貼就不可再拿起。每個平板貼5張紙片，每張紙片間距不少於24mm，紙片中心距平皿邊緣不少於15mm。在菌接種後15分鍾內貼完紙片。
（4）將平板反轉，孵育18～24小時後取出，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，從平板背面測量最接近的整數毫米數並記錄（附表6）。抑菌環的邊緣以肉眼見不到細菌明顯生長為限。有的菌株可出現蔓延生長，進入抑菌環，磺胺葯在抑菌環內出現輕微生長，這些都不作為抑菌環的邊緣。結果判斷依據鑒定所葯敏紙片判定標准。
（5）每次葯敏試驗必須用ATCC 25922大腸桿菌做質控。只有當質控菌株的抑菌圈直徑在允許范圍內測試菌株的結果才可以報告。ATCC 25922的結果必須與測試菌株同時記錄和報告在附表6中。
0.5麥氏比濁管配製方法：
0.048M BaCL2 (1.17% W/V BaCL2 . 2H2O) 0.5ml
0.36N H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml
將二液混合，置螺口試管中，放室溫暗處保存。用前混勻。有效期為6個月。

2. 注意事項：
(1) 制備MH瓊脂平板應用直徑90mm平皿，在水平的實驗台上傾注。瓊脂厚為4±0.5mm（約25-30ml培養基），瓊脂凝固後塑料包裝放4℃保存，在5日內用完，使用前應在37℃培養箱烤乾平皿表面水滴。傾注平皿前應用pH計測pH值是否正確(pH應為7.3)。pH過低會導致氨基糖苷類，大環內酯類失效，而青黴素活力增強。
(2) 葯敏紙片長期儲存應於－20℃，日常使用的小量紙片可放在4℃，但應至於含乾燥劑的密封容器內。使用時從低溫取出後,放置平衡到室溫後才可打開，用完後應立即將紙片放回冰箱內的密封容器內。 過期紙片不能使用, 應棄去。
(3) 不穩定葯物如亞胺培南, 頭孢克洛, 克拉維酸復合葯等, 應冷凍保存, 最好在-40 ℃以下。
(4) 保證質控菌株不變異的簡便方法，將新得到的凍干菌株接種含血的M-H平板復活。然後每株細菌接種10支高層瓊脂管，放置冰箱保存。每月取出一支，傳出細菌供常規用。待用剩至最後一支，可傳種在M-H平板上，再接種一批高層瓊脂管備用。如此可保證原始菌種永不接觸抗菌素。
3.質量控制
質量控制方法 是用與常規實驗相同的操作方法，測定質控菌株的抑菌環。應使用新鮮傳代的菌種。接種菌液的塗布方法等均同常規操作，測定的抗菌素種類也應與常規測定的種類相同。

㈡ 微生物實驗紙片法測定測定抗生素效價方法的整套實驗步驟

實驗前准備：4個培養皿，2支移液管，1支塗布棒，並將培養皿包好滅菌，取一定的蒸餾水滅菌製成無菌水。
1、配製營養瓊脂培養基：稱取營養瓊脂9.6g，加入300ml蒸餾水，加熱煮沸後將培養基導入錐形瓶，然後包紮滅菌(121°C，20min)。
2、倒平板：在無菌環境操作下，將上述培養基倒入4個平板，並編號1，2,，3，4.
3、制菌懸液：用5ml無菌移液管在無菌操作下，吸取3ml無菌水到菌種斜面，用接種環輕刮下菌苔，搗碎，塞上棉塞，振盪片刻。
4、將抗生素稀釋成10-3,10-4，10-5,10-6四種不同稀釋度的梯度液。
5、取直徑1cm圓形濾紙若干，取4個圓形濾紙分別放入10-3,10-4，10-5,10-6的抗生素溶液中浸泡一會。
6、待平板凝固後接種，各取0.2ml菌懸液倒入平板中，用塗布棒抹勻。
7、在1,2,3,4,號已接種的平板中分別放入4個浸泡在10-3,10-4，10-5,10-6抗生素溶液中的濾紙片，並注意個紙片間的距離應較大。
8、培養，放入37°c恆溫箱中培養24h。
9、觀察測量並記錄數據，觀察抗生素濾紙周圍的透明抑菌圈，測量16個抑菌圈的大小，求算不同濃度抗生素濾紙抑菌圈的大小。

㈢ MIC的幾種測定抗菌葯物最低抑菌濃度（MIC）方法

1.1.常量肉湯稀釋法
1.1.1.抗菌葯物貯存液制備 抗菌葯物貯存液濃度不應低於1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍於最高測定濃度。溶解度低的抗菌葯物可稍低於上述濃度。抗菌葯物直接購自廠商或相關機構。所需抗菌葯物溶液量或粉劑量可公式進行計算。例如：需配製100 ml濃度為1280μg/ml的抗生素貯存液，所用抗生素為粉劑，其葯物的有效力為750μg/mg。用分析天平精確稱取抗生素粉劑的量為182.6 mg。根據公式計算所需稀釋劑用量為：（182.6 mg×750μg/mg）/1280μg/ml=107.0ml，然後將182.6 mg抗生素粉劑溶解於107.0ml稀釋劑中。制備抗菌葯物貯存液所用的溶劑和稀釋劑見表5。配製好的抗菌葯物貯存液應貯存於-60℃以下環境，保存期不超過6個月。
1.1.2.葯敏試驗用抗菌葯物濃度范圍 根據NCCLS抗菌葯物敏感性試驗操作標准，葯物濃度范圍應包含耐葯、中介和敏感分界點值，特殊情況例外。
1.1.3. 培養基 NCCLS推薦使用Mueller-Hinton（MH）肉湯，pH7.2~7.4。需氧菌及兼性厭氧菌在此培養基中生長良好。在測試葡萄球菌對苯唑西林的敏感性時，應在肉湯中加入2%（W/V）氯化鈉，按製造廠家的要求配製需要量的MH肉湯。嗜血桿菌屬菌使用HTM肉湯，肺炎鏈球菌和其它鏈球菌使用含2%~5%溶解馬血的MH肉湯。
1.1.4.接種物的制備 有2種方法配製接種物，一是細菌生長方法，用接種環挑取形態相似待檢菌落3-5個，接種於4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉湯中，35℃孵育2-6h。增菌後的對數生長期菌液用生理鹽水或MH肉湯校正濃度至0.5麥氏比濁標准，約含1~2×108CFU/ml。二是直接菌落懸液配製法，對某些苛養菌，如流感嗜血桿菌、淋病奈瑟菌和鏈球菌及甲氧西林耐葯的葡萄球菌等菌株，推薦直接取培養18~24h的菌落調配成0.5麥氏比濁標準的菌懸液。用MH肉湯將上述菌懸液進行1∶100稀釋後備用。注意應在15分鍾內接種完配製好的接種物，並取一份接種物在非選擇性瓊脂平板上傳代培養，以檢查接種物純度。
1.1.5.稀釋抗菌葯物的制備及菌液接種 取無菌試管（13×100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉湯外，其餘每管加入MH肉湯1ml，在第1管加入抗菌葯物原液（如1280μg/ml） 0.4ml混勻，然後吸取1ml至第2管，混勻後再吸取1ml至第3管，如此連續倍比稀釋至第11管，並從第11管中吸取1ml棄去，第12管為不含葯物的生長對照。此時各管葯物濃度依次為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然後在每管內加入上述制備好的接種物各1ml，使每管最終菌液濃度約為5×105CFU/ml。第1管至第11管葯物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125μg/ml。
1.1.6.孵育 將接種好的稀釋管塞好塞子，置35℃普通空氣孵箱中孵育16~20h；嗜血桿菌和鏈球菌在普通空氣孵箱中孵育20~24h；對可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐萬古黴素腸球菌應持續孵育滿24h。
1.1.7.結果判斷與解釋 在讀取和報告所測試菌株的MIC前，應檢查生長對照管的細菌生長情況是否良好，同時還應檢查接種物的傳代培養情況以確定其是否污染，質控菌株的MIC值是否處於質控范圍。以肉眼觀察，葯物最低濃度管無細菌生長者，即為受試菌的MIC。甲氧苄胺嘧啶或磺胺葯物的肉湯稀釋法終點判斷，與陽性生長對照管比較抑制80%細菌生長管葯物濃度為受試菌MIC。
根據NCCLS推薦的分界點值標准，判斷耐葯（resistant, R）、敏感(susceptible, S)或中介（intermediate, I）。S表示被測菌株所引起的感染可以用該抗菌葯物的常用劑量治療有效，禁忌症除外。R指該菌不能被抗菌葯物的常用劑量在組織液內或血液中所達到的濃度所抑制，或屬於具有特定耐葯機理（如β-內醯胺酶），所以臨床治療效果不佳。I是指MIC接近葯物的血液或組織液濃度，療效低於敏感菌。還表示被測菌株可以通過提高劑量（如β-內醯胺類葯物）被抑制，或在葯物生理性濃集的部位（如尿液）被抑制。另外，中介還作為「緩沖域」，以防止由微小的技術因素失控，所導致較大的錯誤解釋。
1.2.微量肉湯稀釋法
1.2.1.抗菌葯物和培養基制備 同常量肉湯稀釋法。
1.2.2.MIC板制備 無菌操作，將倍比稀釋後不同濃度的抗菌葯物溶液分別加到滅菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加葯液，每孔10μl，第12孔不加葯作為生長對照，冰凍乾燥後密封，-20℃以下保存備用。
1.2.3.接種物制備 將用生長法或直接菌懸液法制備的濃度相當於0.5麥氏比濁標準的菌懸液，經MH肉湯1∶1000稀釋後，向每孔中加100μl，密封後置35℃普通空氣孵箱中，孵育16~20h判斷結果。當試驗嗜血桿菌屬，鏈球菌屬時，孵育時間為20~24h，試驗葡萄球菌和腸球菌對苯唑西林和萬古黴素的葯敏試驗時孵育時間必須滿24h。此時，第1孔至第11孔葯物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。
1.2.4.結果判斷 以在小孔內完全抑制細菌生長的最低葯物濃度為MIC。當陽性對照孔（即不含抗生素）內細菌明顯生長試驗才有意義。當在微量肉湯稀釋法出現單一的跳孔時，應記錄抑制細菌生長的最高葯物濃度。如出現多處跳孔，則不應報告結果，需重復試驗。通常對革蘭陰性桿菌而言，微量肉湯稀釋法測得的MIC與常量肉湯稀釋法測得的結果相同或低一個稀釋度（1孔或2倍）。
2.瓊脂稀釋法 瓊脂稀釋法是將不同劑量的抗菌葯物，加入融化並冷至50℃左右的定量MH瓊脂中，製成含不同遞減濃度抗菌葯物的平板，接種受試菌，孵育後觀察細菌生長情況，以抑制細菌生長的瓊脂平板所含最低葯物濃度為MIC。本法優點是可在一個平板上同時作多株菌MIC測定，結果可靠，易發現污染菌；缺點是制備含葯瓊脂平板費時費力。
2.1.培養基制備 使用MH瓊脂，按商品說明書進行配製，pH7.2~7.4。淋病奈瑟菌使用GC瓊脂基礎加1%添加劑；其它鏈球菌使用含5%（V/V）綿羊血的MH瓊脂（當試驗磺胺葯時，使用溶解的馬血）。
2.2.含葯瓊脂平板制備 根據實驗設計，將已倍比稀釋的不同濃度的抗菌葯物分別加入已加熱溶解，並在45~50℃水浴中平衡的MH瓊脂中，充分混勻傾倒滅菌平皿，瓊脂厚度3~4mm。通常按1∶9比例配製葯物瓊脂平板，根據需要來選擇葯物濃度范圍。配製好的含葯瓊脂平板應裝入密封塑料袋中，置2~8℃冰箱可貯存5天。
2.3.接種物制備與接種 制備濃度相當於0.5麥氏標准比濁管的菌懸液，再1∶10稀釋，以多點接種器吸取制備好菌液（約1~2μl）接種於瓊脂平板表面，每點菌數約為104CFU，形成直徑為5~8mm的菌斑。接種好後置35℃孵育16~20h（甲氧西林耐葯葡萄球菌、萬古黴素耐葯腸球菌孵育時間應滿24h），觀察結果。奈瑟菌屬、鏈球菌屬細菌置5%二氧化碳、幽門螺桿菌置微需氧環境中孵育。
2.4.結果判斷 將平板置於暗色、無反光物體表面上判斷試驗終點，以抑制細菌生長的最低葯物濃度為MIC。在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺瓊脂平板上可見輕微細菌生長，與生長對照比較抑制80%以上細菌生長的最低葯物濃度作為終點濃度。
如果出現有2個以上菌落生長於含葯濃度高於終點水平的瓊脂平板上，或低濃度葯物瓊脂平板上不長而高濃度葯物瓊脂平板上生長現象，則應檢查培養物純度或重復試驗。
3.E試驗（E-test） E試驗是指濃度梯度瓊脂擴散試驗，其原理基本同擴散法，即濃度呈連續梯度的抗菌葯物從塑料試條中向瓊脂中擴散，在試條周圍抑菌濃度范圍內受試菌的生長被抑制，從而形成透明的抑菌圈。E試驗綜合了稀釋法和擴散法的原理和特點，同時還彌補了二者的一些不足，可以像稀釋法一樣直接定量測出抗菌葯物對受試菌的MIC。
3.1.培養基、菌液制備和接種 同紙片擴散法。
3.2.貼E試驗條 同紙片擴散法，E試驗條的刻度面朝上，不得貼反，一旦接觸瓊脂後不得再移動。直徑150mm的平皿內可放置6根E試驗試條，90mm者一般只能放置1根。
3.3.孵育時間和溫度 同紙片擴散法。
3.4.結果閱讀 孵育後圍繞試條可形成一個橢圓形的抑菌圈，在抑菌圈和試條的橫切相交處試條上的讀數刻度即是測定抗菌葯物對受試菌的MIC。閱讀時應注意的問題見供應商的產品說明書。

㈣ 固相萃取高效液相色譜測定土壤中四環素類抗生素的方法

1）將適量的土壤碾成粉末，溶於適量水。充分攪拌，靜置一段時間，再攪拌。過濾除去不溶雜質。
2）水相用二氯甲烷萃取三次以上。合並後的萃取液用無水硫酸鎂乾燥。過濾，濃縮。
3）濃縮液用HPLC檢測。

㈤ 葯物雜質對照品的含量要求，不懂的趕緊來看

        對照品（標准品）是執行 葯品質量標准 的實物對照，是量值傳遞的重要載體，是用來檢查葯品質量的一種特殊的專用量具、測量葯品質量的基準、確定葯品真偽優劣的物質對照，也是作為校正測試儀器與方法的物質標准。對國家葯品標准而言，它是國家頒發的一種葯品計量、定性的標准物質。 葯品標准物質 必須具備材料均勻、性能穩定、量值准確等條件，才能發揮其統一量值的作用。

       在葯物研發當中，對照品（標准品）涉及量值溯源、產品定性、雜質控制等重要環節，其制備和標定情況與葯品的質量研究、穩定性研究乃至葯理毒理學研究中劑量的確定等臨床前基礎研究間存在密切關系，因此，葯品對照品（標准品）的制備與標定是葯品技術審評的一項重要內容。一般來講， 葯品研發中標准物質 的使用一般可參照如下原則：

        在新葯研製中，有些含量測定方法採用了葯典收載的鑒別用對照品，應該按含量測定用對照品要求作純度與含量考察，如符合要求可以採用，如純度差應經精製後選用，如在檢驗方法研究中只要雜質峰不幹擾測定可以暫用，但如制定標准限度，必須確切了解對照品的純度與含量。

       含量測定缺乏專屬性關於含量測定，並非每個葯品都需用專屬性好的方法，由於化學原料葯大多數是單一的較純物質，並在檢查項下已對其主要雜質進行控制，因此健全而的方法較專屬但性較差的方法為好， 歐洲葯典 也認為如果鑒別和純度實驗已能充分反映被測物質的特性和品質，那麼分析方法的性就成為選擇含量測定方法的主要依據，因而UV法常被國內外葯典應用。

        但有的葯品含量測定，卻必須注意方法的選擇性，特別是許多性質不穩定的抗生素含量測定。例如 中國葯典 1995年版頭孢拉定採用HPLC法，這是由於頭孢拉定的環己二烯基團在氧氣和水分的作用下易氧化為苯基而成為頭孢氨苄，微量金屬如鐵也能加速這種反應，所以頭孢拉定中不可避免地存在有頭孢氨苄，且其含量不可忽視。葯典中頭孢拉定原料中頭孢氨苄控制在0%以下，制劑控制在0%以下就是這個道理。

        但有文獻卻採用UV法監測頭孢拉定半成品的含量，由於UV法選擇性差，測定的只能是頭孢氨苄和頭孢拉定及其它相關物質的總和，頭孢氨苄的大吸收波長為，吸收系數為220～245，頭孢拉定大吸收波長為，吸收系數為215～240，兩者基本相同，當頭孢拉定降解而含量不合格時，UV法不能反映頭孢拉定中頭孢氨苄的變化。

         中國葯典 中對頭孢拉定及其中所含頭孢氨苄均有限度要求，而UV法既不能准確反映頭孢拉定的含量，又不能反映頭孢氨苄的含量，因此UV法監測頭孢拉定製劑含量是不可行的，可能會使不合格的產品得不到控制而造成重大損失，這也是我們在實際檢驗中遇到的問題：頭孢拉定原料中頭孢氨苄含量一般較低，約2%，但由於貯藏或生產工藝不當，其制劑中出現頭孢拉定含量低於葯典限度或頭孢氨苄含量超過葯典限度的情況。部標准中肌苷制劑的含量測定也存在同樣的問題。

㈥ 牛奶廠主要檢測方式有什麼

理化檢測法：理化檢測法是通過抗生素分子的特殊反應或性質，如高效液相色譜法，測定其鹼性基含量的方法，氣相色譜法、比色法、熒光分光光度法等，最常用的是高效液相色譜及其組合技術。

這些方法不僅可以用於定性分析，而且可以用於定量檢測，檢測速度快，靈敏度、特異性和解析度都很高，重復性好，應用廣泛。但其檢測要求高，需要昂貴的檢測設備，檢測程序復雜，檢測成本高，且普遍用於科研，難以推廣到基層應用。

1、高效液相色譜法：高效液相色譜（HPLC）是近年來發展最快的一種快速分離分析技術。介紹了氣相色譜原理，採用高壓泵、高效固定相、高靈敏度檢測器等技術，實現了分離速度快、效果好、操作自動化，幾乎所有待測化合物包括高極性／離子型化合物和大分子物質都能用高效液相色譜法測定。