流式細胞檢測b細胞亞群方法步驟

1. 流式細胞鑒定有哪些步驟

最基本的步驟：
1、制備樣品的單細胞懸液；
2、標記流式抗體；
3、流式上機檢測。

2. 流式細胞術的步驟

流式細胞儀的操作和使用①打開電源，對系統進行預熱； ②打開氣體閾，調節壓力，獲得適宜的液流速度；開啟光源冷卻系統； ③在樣品管中加入去離子水，沖洗液流的噴嘴系統； ④利用校準標准樣品，調整儀器，使在激光功率、光電倍增管電壓、放大器電路增益調定的基礎上，0和90散射的熒光強度最強，並要求變異系數為最小； ⑤選定流速、測量細胞數、測量參數等，在同樣的工作條件下測量樣品和對照樣品；同時選擇計算機屏上數據的顯示方式，從而能直觀掌握測量進程； ⑥樣品測量完畢後，再用去離子水沖洗液流系統； ⑦因為實驗數據已存入計算機硬碟（有的機器還備有光碟系統，存貯量更大），因此可關閉氣體、測量裝置，而單獨使用計算機進行數據處理； ⑧將所需結果列印出來。 細胞凋亡研究：細胞凋亡是細胞在基因控制下的有序死亡，在疾病發生、發展中有重要作用，因而研究細胞凋亡有重要意義。細胞凋亡檢測方法很多，應用流式細胞儀技術可根據細胞在凋亡過程中發生一系列形態、生化變化從多個角度對細胞凋亡進行定性和定量的測定。

細胞分選：流式細胞儀能夠分選某一亞群細胞,分選純度＞95%。目前細胞分選主要用於研究，臨床應用較少。利用流式細胞儀分選免疫擔當細胞進行細胞免疫學研究也是目前的熱門課題。流式細胞儀能夠分選出你想得到的任何一亞群細胞，只要你想得到的某一亞群細胞有合適的單克隆抗體標記。 細胞因子的檢測：隨著多標記及胞內細胞因子標記流式細胞技術的出現，使對細胞內細胞因子的研究推向了一個新的階段。本文主要對胞內細胞因子流式細胞技術作介紹。 血液學應用：文向您介紹流式細胞儀在血液研究領域的應用，包括DNA倍體分析及細胞周期分析，淋巴細胞亞群測定，白血病免疫分型，淋巴瘤免疫分型，紅細胞疾病診斷，血小板功能分析和血小板病診斷，微小殘留白血病檢測，白細胞吞噬功能測定，NK和LAK細胞活性測定，造血干/祖細胞測定等

3. 流式細胞術的步驟

1，制備細胞懸液，計數
2，分裝，按照每個EP（1.5ml）管1-2*10 6個細胞分裝（要設空白對照，單標和isotype control），3500rpm，4度，離心。
3，用100ulPBS重懸，加入10ul大鼠血清封閉（或者其他封閉劑），4度，避光，30min。
4，加入相應的熒游標記的抗體，混勻，避光，4度孵育30min。
5，加入1mlPBS洗兩遍（3500rpm，4度，離心）。
6，用200ul PBS重懸，經紗布過濾轉至流式管，上級檢測。

這個是正對細胞表面分子，如果檢測細胞內分子，需要在加封閉劑之前加入穿膜液。如果細胞內的分子表達量很少，需要加刺激劑。

4. 請教流式細胞的具體實驗步驟是怎樣的

一 、細胞表面標記的檢測
1.試劑平衡至室溫。准備：消毒檯面；穿戴工作服，帽子，口罩和手套，放置棉簽，草紙和有蓋垃圾桶（內裝有消毒劑）。
2.寫編號紙並編號。1----IgG1/ IgG1/ IgG12----CD4/CD8/CD33----CD14/CD454----
3.每管加相應的抗體10l/每種和50l全血，震盪，室溫避光20分鍾。加血前搖勻血樣。
4.加入溶血素1ml，震盪後室溫避光10分鍾。
5.離心，1200轉， 5分鍾。棄上清，震盪。
6.加入PBS洗液2ml，震盪，離心，1200轉， 5分鍾。棄上清，震盪。
7.加入PBS 900l。上機前4度保存。
8.上機。
二 、細胞內細胞因子的檢測
1.准備：消毒檯面；穿戴工作服，帽子，口罩和手套，放置棉簽，草紙和有蓋垃圾桶（內裝有消毒劑）。
2.寫編號紙並編號。IgG1/ CD8/CD3IFN-gamma; /CD8/CD3
3.（3－5在超凈台操作）取出PMA（1∶100），BFA（1∶10）和離子黴素（1∶10），使用無菌無疊氮鈉PBS稀釋儲存液。
4.刺激：取全血或PBMCs（細胞數在0.5-1 106 ）50l/管，再加入50l RPMI1640進行稀釋一倍，加入刺激劑PMA，離子黴素和BFA，混勻。最後在全血中的終濃度：PMA:50ng/ml離子黴素：1g/mlBFA：10g/ml。
5.37℃，5% CO2 ，4小時孵育(最好用培養箱，松蓋) 。
6.胞外染色：各管中加入相應的表面抗體20l和激活的全血100l混勻，室溫避光20分鍾。
7.溶血：每管加入溶血素2ml，室溫避光10分鍾。離心，1200轉， 5分鍾。棄上清。
8.破膜通透：每管加入0.5ml通透劑，室溫避光10分鍾。加入2mlPBS，1000轉，離心5分鍾。棄上清。
9.胞內染色：加入IFN-gamma;或IgG1的抗體20l，混勻，室溫避光30分鍾。加入2ml PBS，1000轉，離心5分鍾，棄上清。
10.加入PBS 500l。上機前4度保存。
11.上機檢測。
注意：本實驗室可提供流式細胞檢測服務或流式細胞儀,不會的新手可以自行上門觀察.本實驗室為正規三甲醫院科研共享平台,所有開放的實驗均為本實驗最常規的技術服務,暫時開放的除了流式細胞術外還有熒光定量pcr,ChIP免疫沉澱,wester blot,細胞培養,細胞株.

5. 流式細胞儀的原理和操作過程

原理：
流式細胞儀可同時進行多參數測量，信息主要來自特異性熒光信號及非熒光散射信號。測量是在測量區進行的，所謂測量區就是照射激光束和噴出噴孔的液流束垂直相交點。液流中央的單個細胞通過測量區時，受到激光照射會向立體角為2π的整個空間散射光線，散射光的波長和入射光的波長相同。散射光的強度及其空間分布與細胞的大小、形態、質膜和細胞內部結構密切相關，因為這些生物學參數又和細胞對光線的反射、折射等光學特性有關。未遭受任何損壞的細胞對光線都具有特徵性的散射，因此可利用不同的散射光信號對不經染色活細胞進行分析和分選。經過固定的和染色處理的細胞由於光學性質的改變，其散射光信號當然不同於活細胞。散射光不僅與作為散射中心的細胞的參數相關，還跟散射角、及收集散射光線的立體角等非生物因素有關。
在流式細胞術測量中，常用的是兩種散射方向的散射光測量：①前向角（即0角）散射（FSC）；②側向散射（SSC），又稱90角散射。這時所說的角度指的是激光束照射方向與收集散射光信號的光電倍增管軸向方向之間大致所成的角度。一般說來，前向角散射光的強度與細胞的大小有關，對同種細胞群體隨著細胞截面積的增大而增大；對球形活細胞經實驗表明在小立體角范圍內基本上和截面積大小成線性關系；對於形狀復雜具有取向性的細胞則可能差異很大，尤其需要注意。側向散射光的測量主要用來獲取有關細胞內部精細結構的顆粒性質的有關信息。側向散射光雖然也與細胞的形狀和大小有關，但它對細胞膜、胞質、核膜的折射率更為敏感，也能對細胞質內較大顆粒給出靈敏反映。
在實際使用中，儀器首先要對光散射信號進行測量。當光散射分析與熒光探針聯合使用時，可鑒別出樣品中被染色和未被染色細胞。光散射測量最有效的用途是從非均一的群體中鑒別出某些亞群。
熒光信號主要包括兩部分：①自發熒光，即不經熒光染色細胞內部的熒光分子經光照射後所發出的熒光；②特徵熒光，即由細胞經染色結合上的熒光染料受光照而發出的熒光，其熒光強度較弱，波長也與照射激光不同。自發熒光信號為雜訊信號，在多數情況下會干擾對特異熒光信號的分辨和測量。在免疫細胞化學等測量中，對於結合水平不高的熒光抗體來說，如何提高信噪比是個關鍵。一般說來，細胞成分中能夠產生的自發熒光的分子（例核黃素、細胞色素等）的含量越高，自發熒光越強；培養細胞中死細胞/活細胞比例越高，自發熒光越強；細胞樣品中所含亮細胞的比例越高，自發熒光越強。
減少自發熒光干擾、提高信噪比的主要措施是：①盡量選用較亮的熒光染料；②選用適宜的激光和濾片光學系統；③採用電子補償電路，將自發熒光的本底貢獻予以補償。

操作過程：
①打開電源，對系統進行預熱；
②打開氣體閾，調節壓力，獲得適宜的液流速度；開啟光源冷卻系統；
③在樣品管中加入去離子水，沖洗液流的噴嘴系統；
④利用校準標准樣品，調整儀器，使在激光功率、光電倍增管電壓、放大器電路增益調定的 基礎上，0和90散射的熒光強度最強，並要求變異系數為最小；
⑤選定流速、測量細胞數、測量參數等，在同樣的工作條件下測量樣品和對照樣品；同時選 擇計算機屏上數據的顯示方式，從而能直觀掌握測量進程；
⑥樣品測量完畢後，再用去離子水沖洗液流系統；
⑦因為實驗數據已存入計算機硬碟（有的機器還備有光碟系統，存貯量更大），因此可關閉 氣體、測量裝置，而單獨使用計算機進行數據處理；
⑧將所需結果列印出來。

6. 流式細胞術檢測細胞表面抗原的步驟

1. 定量細胞濃度
2. 分為2組，一組為實驗組，另一組為抗體對照組
3. 兩組都先加入非特異性的IgG，封閉可能的Fc受體
4. 按照抗體生產廠家的推薦濃度加入抗體，對照組加入同樣熒游標記的非特異性同型抗體。
5. 4°孵育半小時
6. 用含0.5% BSA的PBS洗2遍
7. 上機後先用抗體對照組設置陰性Gate。
8. 檢測樣本。

7. 流式細胞術實驗步驟是什麼

流式細胞術實驗：

1、制備細胞懸液，計數

2、分裝，按照每個EP（1.5ml）管1-2*10 6個細胞分裝，3500rpm，4度離心。

3、用100ulPBS重懸，加入10ul大鼠血清封閉，4度避光30min。

4、加入相應的熒游標記的抗體，混勻，避光，4度孵育30min。

5、加入1mlPBS洗兩遍。

6、用200ul PBS重懸，經紗布過濾轉至流式管，上級檢測。

細胞或者大小接近的顆粒物質都可以檢測。

樣本通過鞘液的輸送，成單個隊列依次通過激光束。樣本事先可以根據檢測需要被熒游標記，通過激光束的時候就會得到熒光信號，被記錄下來。可以同時標記不同的熒游標記做不同的檢查。優點就是可以在短時間內檢測大量的樣本（每秒幾千個到幾萬個細胞）。

主要應用於各種生物醫學研究和臨床診斷。國際上通用的白細胞和淋巴瘤的診斷標准就是靠流式細胞儀的分型來確定的。

以上內容參考：網路-流式細胞術

8. 如何運用流式細胞儀進行T淋巴細胞亞群分析

簡單的概括：

1、先在FSC/SSC散點圖gate出淋巴細胞；
2、然後把淋巴細胞顯示到柱狀圖，gate出CD3陽性的（T細胞）；
3、再把T細胞顯示到散點圖，橫坐標，縱坐標分別為CD4和CD8。