葯物篩選濃度方法的步驟

Ⅰ 葯物中測定某物質含量的常用方法有那些(3種以上)

方法的驗證：
訂入質量標準的含量測定法不同於一般質量考察的方法，須經過嚴格的方法學驗證，不同原理的測定法具有不同的驗證內容及要求：
（1）容量分析法的驗證：①精密度：用原料葯精製品考察方法精密度，平行試驗5個樣本的RSD≤0.2%；②准確度：以測定原料精製品（含量>99.5%）的回收率（測定值與理論值的比值）計算，應在99.7%～100.3%之間（n＝5,RSD≤0.1%）；③滴定終點確定的依據：包括滴定曲線的繪制，如用指示劑法確定終點，應用電位法校準終點顏色，提供指示劑顏色與電位變化情況的對比結果；④耐用性：考察測定條件（供試液穩定性、樣品提取次數、時間等）有微小變動時，測定結果不受影響的承受程度，如測試條件要求苛刻時則應在方法中註明。
（2）HPLC法的驗證：①精密度：RSD≤2%（n＝5）；②准確度：用於制劑時，要考察輔料的影響，將一定量葯物加到按處方比例配製的輔料中（為標示量的80%～120%）製成高、中、低三個劑量，混合均勻後，每個劑量取三份樣品，按擬定方法測定回收率，應在98%～102%之間（n＝9,
RSD≤2%）。③線性范圍：用已知含量的精製品配製一系列濃度的溶液（n＝5～7），用濃度C對峰面積A或峰高h或被測物的響應值之比進行回歸處理，線性方程的相關系數r≥0.999，截距應趨於零，並提供線性關系圖；④專屬性：輔料、有關物質或降解產物峰對主葯峰應無干擾；⑤耐用性：考察測定條件（供試液穩定性、流動相組成和pH值、不同品牌或批號的同類色譜柱、柱溫、流速、樣品提取次數、時間等）有微小變動時，測定結果不受影響的承受程度，如測試條件要求苛刻時則應在方法中註明；⑥靈敏度：作為常量分析法，此項可不作主要要求。
（3）UV法的驗證：①精密度：RSD≤1%（n＝5）；②准確度：方法同HPLC法，回收率應在98%～102%之間（n＝9,
RSD≤2%），同時要求輔料、有關物質或降解產物在測定波長處無吸收。③線性范圍：用已知含量的精製品配製一系列濃度的溶液（n＝5～7，吸收度A在0.2～0.7間），用濃度C對峰面積A或峰高h或被測物的響應值之比進行回歸處理，線性方程的相關系數r應≥0.999，截距應趨於零，並提供線性關系圖；④耐用性：考察測定條件（供試液穩定性、樣品提取次數、時間、比色法中顯色劑用量、反應溫度、時間、pH值等）有微小變動時，測定結果不受影響的承受程度，如測試條件要求苛刻時則應在方法中註明；⑤靈敏度：作為常量分析法，此項可不作主要要求。
吸收度A在0.2～0.8間其線形關系好，利用標准品建立標准曲線後，受測溶液做適當的稀釋，使其吸收度在0.2～0.8，如果太小或太大，都將影響測定的准確性的。

Ⅱ 細胞內葯物濃度測定應該怎麼做

⒈選擇適當的細胞接種濃度。一般情況下，96孔培養板的一內貼壁細胞長滿時約有105個細胞。但由於不同細胞貼壁後面積差異很大，因此，在進行MTT試驗前，要進行預實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細胞數和培養時間，以保證培養終止致細胞過滿。這樣，才能保證MTT結晶形成數量與細胞數呈的線性關系。否則細胞數太多敏感性降低，太少觀察不到差異。
⒉葯物濃度的設定。一定要多看文獻，參考別人的結果再定個比較大的范圍先初篩。根據自己初篩的結果縮小濃度和時間范圍再細篩。切記！否則，可能你用的時間和濃度根本不是葯物的有效濃度和時間。
⒊ 時間點的設定。在不同時間點的測定OD值，輸入excel表，最後得到不同時間點的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什麼時候變得平坦了（到了平台期）那個時間點應該就是最好的時間點（因為這個時候的細胞增殖抑製表現的最明顯）。
⒋培養時間。200ul的培養液對於10的4～5次方的增殖期細胞來說，很難維持68h，如果營養不夠的話，細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨於靜止，影響結果，我們是在48h換液的。
⒌MTT法只能測定細胞相對數和相對活力，不能測定細胞絕對數。做MTT時，盡量無菌操作，因為細菌也可以導致MTT比色OD值的升高。
⒍理論未必都是對的。要根據自己的實際情況調整。
⒎實驗時應設置調零孔，對照孔，加葯孔。調零孔加培養基、MTT、二甲基亞碸。對照孔和加葯孔都要加細胞、培養液、MTT、二甲基亞碸，不同的是對照孔加溶解葯物的介質，而加葯組加入不同濃度的葯物。
⒏避免血清干擾。用含15%胎牛血清培養液培養細胞時，高的血清物質會影響試驗孔的光吸收值。由於試驗本底增加，會試驗敏感性。因此，一般選小於10%胎牛血清的培養液進行。在呈色後，盡量吸凈培養孔內殘余培養液。 MTT 溶液的配製方法
通常，此法中的MTT 濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT 0.5克，溶於100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養基中，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細菌，放4℃ 避光保存即可。在配製和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。
需要注意的是，MTT法只能用來檢測細胞相對數和相對活力，但不能測定細胞絕對數。在用酶標儀檢測結果的時候，為了保證實驗結果的線性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范圍內。
MTT一般最好現用現配，過濾後4℃避光保存兩周內有效，或配製成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現配，直接往培養板中加，沒必要一下子配那麼多，尤其當MTT變為灰綠色時就絕對不能再用了。
MTT有致癌性，用的時候小心，有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作台上的照明燈關掉.
配製MTT時用用PBS溶解，也有人用生理鹽水配，60℃水浴助溶。

Ⅲ 如何篩選微生物葯物

市面上有很多微生物制劑的菌種，多種多樣，造成在選擇上產生很大困惑，下邊是選擇菌種的方法：
1、微生物菌種選擇
動物消化道微生物具有多樣性和特異性，不同動物種類對菌種的要求不同，同一菌株用於不同動物，產生的效果差異也較大。使用時一定要掌握菌種的特性和功效，選擇不當起不到應有效果，反而會破壞原有菌群，甚至引發疾病
2、微生物菌種應用時間
微生物制劑應用要從子畜開始使用，以保證有益菌優先定植。因為制劑進入體內後要有一段時間進行微生物菌群調整才能定植下來。
一般認為，乳酸菌類在各種動物的各階段添加均較好，芽孢桿菌類在生長期添加較好，在幼齡期可以添加;麴黴菌類在幼齡期，水產動物全期不必添加;酵母菌類在生長期不必添加;在水產動物養殖中，以改善水質為目的時，可將微生物制劑或光合細菌直接灑於水中。
3、微生物菌種添加方式
一般粉狀飼料添加微生物制劑效果較好，顆粒飼料和膨化飼料在加工過程中的高溫可造成10%~30%的芽孢桿菌，90%以上的腸球菌以及99%以上的酵母失活，而乳酸桿菌幾乎全部被殺滅。因此，在顆粒飼料中要使用耐熱，耐擠壓的芽孢桿菌制劑。乳酸菌不耐高溫，應採用凍干後包被或採用噴霧乾燥的方式製成的乳酸菌制劑。使用時最好採用飲水方式，以利於乳酸菌優先粘附於腸壁。
4、微生物菌種劑量與濃度
微生物制劑中必須含有相當數量的活菌才能達到效果。當進入動物腸道食糜中外源菌數大於1000萬個每克時，都會對腸道內原有菌群產生較大的影響。因此，微生物制劑在產品中活菌數含量為10億~20億每克時效果最佳。
我國正式批准生產的微生物制劑中規定每克芽孢桿菌含量要多於5億個。以酵母菌產品為例，目前市場上銷售的產品活菌數從每克幾億到200億不等，在選擇是要認真鑒別。
5、微生物菌種抗生素的影響
細菌類的微生物制劑對抗生素敏感，不宜與抗生素同時使用，使用微生物制劑的前後二天應停止使用抗生素。最好先用抗菌葯物清理腸道，為益生菌的定植和繁殖掃除障礙，然後再飼喂微生物制劑，可提高使用效果。酵母菌類屬於真核生物，生物學活性與細菌完全不同，對抗生素、磺胺類葯物和一些抗菌劑有天然抗性，可與抗生素同時使用。
6、微生物菌種保存條件和期限
微生物制劑均為活菌制劑，由於大多數菌種在飼料加工、運輸中容易失活，應用中要注意保存期限。通常微生物制劑應密封保存於陰涼避光處，儲存時間不宜過長，有效期一般為一年左右，隨著保存時間的延長，活菌數量不斷減少。厭氧菌類暴露在空氣中容易死亡，有的產品對其進行了包被或真空包裝處理，應在打開包裝後規定的時間內用完。酵母類屬於兼性厭氧菌，可以保存較長時間。芽孢桿菌類有效期比其他類型長，可達2年左右。

Ⅳ 高通量葯物篩選的簡介

1. 化合物樣品庫
化合物樣品主要有人工合成和從天然產物中分離純化兩個來源。其中,人工合成又可常規化學合成和組合化學合成兩種方法。
2.自動化的操作系統
自動化操作系統利用計算機通過操作軟體控制整個實驗過程。操作軟體採用實物圖像代表實驗用具，簡潔明了的圖示代表機器的動作。自動化操作系統的工作能力取決於系統的組分，根據需要可配置加樣、沖洗、溫解、離心等設備以進行相應的工作。
3.高靈敏度的檢測系統
檢測系統一般採用液閃計數器、化學發光檢測計數器、寬譜帶分光光度儀、熒光光度儀等。
4.資料庫管理系統
資料庫管理系統承擔4個方面的功能: 樣品庫的管理功能;生物活性信息的管理功能; 對高通量葯物篩選的服務功能; 葯物設計與葯物發現功能。 常用的篩選模型都在分子水平和細胞水平，觀察的是葯物與分子靶點的相互作用，能夠直接認識葯物的基本作用機制。
1.分子水平的葯物篩選模型:受體篩選模型;酶篩選模型;離子通道篩選模型
1.1受體篩選模型:指受體與放射性配體結合模型。以受體為作用靶的篩選方法,包括檢測功能反應、第二信使生成和標記配體與受體相互作用等不同類型。
1.2酶篩選模型:觀察葯物對酶活性的影響。根據酶的特點,酶的反應底物,產物都可以作為檢測指標,並由此確定反應速度。典型的酶篩選包括1) 適當緩沖液中孵化;(2)控制反應速度,如:溫度,緩沖液的pH值和酶的濃度等;(3)單時間點數器, 需測量產物的增加和底物的減少。
1.3離子通道篩選模型: (1)貝類動物毒素的高通量篩選,其作用靶為Na+通道上的蛤蚌毒素結合位點，用放射性配體進行競爭性結合試驗考察受試樣品。(2)用酵母雙雜交的方法高通量篩選干擾N型鈣通道β3亞單位與α1β亞單位相互作用的小分子，尋找新型鈣通道拮抗劑。
2.細胞水平葯物篩選模型
觀察被篩樣品對細胞的作用,但不能反映葯物作用的具體途徑和靶標,僅反映葯物對細胞生長等過程的綜合作用。包括: 內皮細胞激活; 細胞凋亡; 抗腫瘤活性; 轉錄調控檢測; 信號轉導通路; 細菌蛋白分泌; 細菌生長。
高通量篩選技術與傳統的葯物篩選方法相比有以下幾個優點:反應體積小；自動化；靈敏快速檢測；高度特異性。但是，高通量篩選作為葯物篩選的方法,並不是一種萬能的手段，首先，高通量篩選所採用的主要是分子、細胞水平的體外實驗模型，任何模型都不可能充分反映葯物的全面葯理作用；其次，用於高通量篩選的模型是有限的和不斷發展的，要建立反映機體全部生理機能的理想模型，也是不現實的。但我們應該相信，隨著對高通量篩選研究的深入，隨著對篩選模型的評價標准、新的葯物作用靶點的發現以及篩選模型的新穎性和實用性的統一，高通量篩選技術必將在未來的葯物研究中發揮越來越重要的作用。 光學測定技術。美、英兩國研究人員在高通量篩選檢測中，努力進行了光學測定方法的研究，建立了大量的非同位素標記測定法，如用分光光度檢測法篩選蛋白酪氨酸激酶抑制劑、組織纖溶酶原激活劑等，均獲得成功。
放射性檢測技術。美國學者GanieSM在高通量葯物篩選研究中，應用放射性測定法，特別是親和閃爍（SPA）檢測方法，使在96孔板上進行的樣本量實驗得到發展。該方法靈敏度高，特異性強，促進了高通量葯物篩選的實現，但存在環境污染問題。
熒光檢測技術。美國學者GiulianokA研究認為，採用FLIPR（fluor ometricimaging readet）熒光檢測法，可在短時間內同時測定熒光的強度和變化，對測定細胞內鈣離子流及測定細胞內pH和細胞內鈉離子流等，是非常理想的一種高效檢測方法。
多功能微板檢測系統。由西安交通大學葯學院研製的1536孔板高通量多功能微板檢測系統，是國際上先進的高通量檢測系統，它可使篩選量進一步提高，現已在該院投入使用。
1．基本原理
高通量葯物篩選技術是將多種技術方法有機結合而形成的新的技術體系，它以分子水平和細胞水平的實驗方法為基礎，以微板形式作為實驗工具載體，以自動化操作系統執行實驗過程，以靈敏快速的檢測儀器採集實驗數據，以計算機對實驗獲得的數據進行分析處理。它的正常開展需要有一個高容量的化合物庫、自動化的操作系統、高靈敏度的檢測系統、高效率的數據處理系統以及高特異性的葯物篩選模型。
1.1 化合物樣品庫
高通量篩選是一種利用已有的化合物進行的體外隨機篩選。因此通過高通量葯物篩選發現先導化合物(leading compounds)的有效性取決於化合物樣品庫中化合物的數量及其質量。化合物樣品的數量是指不同樣品的數量。化合物樣品的質量主要由化合物結構的多樣性決定的。許多活性反應基團(reactive groups)使初篩的假陽性大量增加，剔除這些化合物可以提高化合物樣品庫的質量。
化合物樣品主要有人工合成和從天然產物中分離純化兩個來源。
人工合成又可分為常規化學合成和組合化學合成兩種方法。採用常規化學合成的純化合物一直是國外製葯企業建立化合物樣品庫的主要來源。它們通過長年積累的化合物建立化合物樣品庫，通過購買和化合物交流使化合物樣品庫的數量和質量大幅度提高。
組合化學(combinatorial chemistry)的出現為大量增加化合物的數量提供另外一種來源。組合化學的基本原理是採用適當的化學方法，在特定的分子母核上加入不同的基團，在同樣條件下，產生大量的新化合物。這種方法在化合物的結構改造和優化方面已經表現出強大的優勢。但是，由於該方法是基於母核結構的改造，因此產生的大量化合物在結構多樣性方面尚有極大的不足。解決組合化學產物結構多樣性的問題，已經成為化學研究人員的研究課題。
從天然產物中分離出來的化合物，母核結構和活性基團是長期的自然選擇形成的，它們通過高通量篩選所表現出來的生物活性在葯物發現中具有人工合成化合物所不能比擬的優勢。因此，增加樣品庫中具結構多樣性的天然化合物及其衍生物是提高樣品庫質量的一個重要途徑。跨國制葯企業為了增加高通量篩選的陽性率，已經或正在尋求助買我國的天然產物單體。
1.2 自動操作系統
高通量葯物篩選每天要對數千化台物樣品進行檢測，工作枯燥、步驟單一，人工操作容易疲勞、出錯。自動化操作系統採用微孔板作為反應容器，具有固定的分布模式(format)；不同的微孔板通過條形碼加以標記。自動化操作系統通過光電閱讀器對特定的微孔板上的特定位置進行操作，並將操作結果及相關數據存貯在計算機內，使篩選結果准確，實驗過程快速。
自動化操作系統編程過程簡潔明了，可操作性強。自動化操作系統的工作能力取決於系統的組成都分，根據需要可配置加樣、沖洗、溫解、離心等設備以進行相應的工作。
除了實驗步驟的需要以外，自動化的加樣方式是決定篩選速度的重要因素。主要有單孔、8孔、96孔、384孔等幾種方式。單孔一般用於對照樣品以及復篩中零散樣品的轉移。96孔、384孔在酶活性檢測以及需同時開始、同時終止反應的篩選模型中是必需的。
自動化操作系統的一個重要組成部分是堆棧(hotel)。所謂堆棧是指在操作過程中用來放置樣品板、反應板以及對它們進行轉移所需的騰挪空間。因此，高通量篩選的樣品數量取決於堆棧的容量。
由此可見，高通量葯物篩選的自動化操作系統由計算機及其操作軟體、自動化加樣設備、溫孵離心等設備、堆棧4個部分組成。不同的單位可根據主要篩選模型類型、篩選規模選購不同的部分整合成為一個完整的操作系統。
1.3 檢測系統
快速、高靈敏度的檢測技術是高通量葯物篩選的關鍵技術之一。檢測儀器靈敏度的不斷提高，即使對微量樣品的檢測，也可以得到很好的檢測效果。
1.3.1 液閃計數 放射性同位素廣泛用於受體結合測定、細胞毒性、細胞增殖實驗、葯物代謝示蹤以及基因分析中。由於採用了雙光電倍增管及時間分辨偶合迴路(time-resolved coincidence circuit)技術，有效地降低了背景信號的干擾，使測定靈敏度提高，同位素用量少。在96孔板的分析檢測中，背景信號可控制在10cpm左右。
親和閃爍分析(scintil1ation proximity assay，SPA)是一種新的液閃分析法。該方法在細胞表面受體葯物篩選中應用較為普遍。在高通量篩選測定細胞表面受體親合結合作用時，放射配體標記濾過分析技術由於需要進行分離，現已被親合閃爍分析所取代。親合閃爍分析技術通過親合結合，將放射性配基結合到具有受體的閃爍球上，從而產生光子，減少了放射配體標記分析中的游離配基與結合配基的分離過程，使得放射配基分析可完全以自動化的方式進行，適於進行高通量篩選。產生低能量放射粒子的同位素可被用來進行放射性標記，而這種低能量放射粒子在短距離內可被重吸收，以確保只有結合到受體表面的配基才被檢測到。SPA技術被廣泛的應用到激酶、核酸處理酶分析以及受體配體的相互作用分析中。
1.3.2 分光光度法 為了適應高通量葯物篩選，許多公司都生產了具備計算機介面並能對多孔板進行同時檢測的分光光度計。以Molecular Device公司的spectra 190為例，它採用8條光導纖維同時對8孔進行測定。測定波長以2nm為間隔，可以在190nm一850nm間進行選擇。對未知物質，可在該范圍內進行掃描以確定其特徵吸收光譜。因此，大大增加了建立模型的多樣性。檢測數據以不同文件格式輸出，可用隨機軟體或通用數據處理軟體進行處理。方便、快速、准確、自動化程度高。分光光度法高靈敏儀器同自動化操作系統的連接，使得基於紫外、可見光譜的高通量葯物篩選模型成為主要模型種類。
1.3.3 化學發光檢測 化學發光指生色物質在酶促作用下，化學能以光子的形式釋放出來。化學發光根據發光的形式和種類分為輝光型和閃光型發光兩種。輝光型化學發光如以AMPPD、CDPS、ECL、Diagoxigein等為基礎的發光反應。其發光時間較長且穩定。而以發光蛋白、ATP、熒光素酶等為底物的發光反應則是閃光型發光反應，其發光時間較短。由於時間分辨及偶合迴路技術的使用，對於背景的去除更為有效，使得化學發光的檢測靈敏度達到0.1pg數量級。在單孔多點噴射技術中，用於檢測化學發光的光導纖維末端帶有一噴頭，用來加入反應性底物。反應性底物從100個小孔噴出，使反應性底物加入孔中後即可均勻混合。發光反應同時啟動後，可立即進行測定，對於閃光性化學發光的測定更為有利。
1.3.4 激發熒光檢測 新型激發熒光檢測儀在傳統儀器的基礎上，用連續的激發光諧和測定光譜取代固定光譜，使模型的建立更具備靈活性。熒光檢測方法靈敏是因為多數熒光基團都有短暫的半衰期，即使用較弱的激發光源也能獲得大量的光子流。這種特性以及多種可採用的熒光模式，使得熒光檢測技術成為高通量篩選必不可少的應用手段。熒光技術在均相篩選分析中廣為應用。其中，包括熒光共振能量轉移(FRET)，熒光偏振(FP)，時間分辨熒光(TRET)以及熒光相關譜(FCS)等技術。
1.4 資料庫管理系統
高通量葯物篩選的特點是對數以萬計的化合物樣品進行多模型的篩選。與高通量葯物篩選相適應的資料庫管理系統主要承擔4個方面的功能。
樣品庫的管理功能：化合物樣品庫對進行高通量葯物篩選的化合物樣品的各種理化性質進行存儲管理。對每一個新入庫的化合物進行新穎性分析，排除結構雷同的化合物，避免不必要的篩選。由於高度反應性基團增加了假陽性出現的機率，樣品庫對新入庫的化合物進行反應基因檢測以去除這類化合物。
生物活性信息的管理功能：生物活性庫存貯每一化合物經過不同模型檢測後的結果，並根據多個模型的檢測結果對化合物的生物活性進行綜合評價。
對高通量葯物篩選的服務功能：高通量葯物篩選的工作量大，自動化程度高，也涉及到許多繁瑣的工作。高通量葯物篩選資料庫管理系統對與葯物篩選相關的業務往來通訊、檔案管理以及各種樣品標簽的列印進行管理，使高通量葯物篩選的各個環節程序化、標准化。
葯物設計與葯物發現功能：高通量葯物篩選產生大量的化合物結構信息，隨著篩選的進行，生物活性信息也特大幅度提高。高通量葯物篩選資料庫管理系統通過對同一模型不同的呈現陽性反應的化合物結構進行分析，找出其構效關系，從而為葯物設計提供參考。
1.5 篩選模型
是指用於檢測葯物作用的實驗方法。由於高通量篩選要求反應總體積小，而且，反應具有較高特異性和敏感性，因此對於篩選模型也要求較高。這些模型主要集中在受體、酶、通道以及各種細胞反應方面。基因水平的葯物篩選模型，使葯物篩選模型的范圍更為廣泛。
1.5.1 以酶為靶的高通量篩選 以酶為作用靶的高通量篩選方法，絕大多數是直接檢測酶活性。具體方法根據酶的不同而不同，主要有基於放射性的方法和基於比色、熒光的方法兩大類。
基於放射性的方法多是將底物標記，測定放射性產物的生成。Taft等建立了(1,3)β-葡聚糖合酶抑制劑(抗真菌)的高通量篩選方法。將含有酶的菌絲提取物、α-澱粉酶和UDP-14C-葡萄糖加入96孔板的孔中，溫孵、反應。終止反應後，濾去未被合成進入的底物。閃爍計數檢測濾器上保留的(1,3)β-葡聚糖，指示酶活性大小。
也有將酶標記，測定被特異結合的酶的方法。Vollmer等建立了一種以青黴素結合蛋白(PBP)為靶的抗生素的高通量篩選方法。PBP既是糖基轉移酶又是肽轉移酶，該法是篩選其糖基轉移結構域的活性位點上的可結合物。將莫諾黴素(moenomycin)結合於一種小球上，製成混懸液，加入96孔板，然後加入3H標記的PBP(細菌膜粗提物)和受試化合物，孵育、過濾去掉非結合的放射性，閃爍計數測得的放射性指示PBP與莫諾黴素結合的情況及受試化合物對其影響。
另外，基於放射性而無需過濾分離的SPA也有應用。Brown等建立了內源性肽酶的水解活性檢測方法，用以研究其抑制劑。用3H標記的肽底物，通過生物素(biotin)與抗生物素蛋白(avidin)包裹的SPA閃爍球相連。酶解使3H隨肽的斷裂而離開閃爍球。測定3H放射性作用於閃爍球產生的閃爍信號的丟失量，即指示酶活性大小。
基於比色、熒光等的方法有一些報道。Waslidge等建立了脂氧合酶抑制劑的篩選方法。酸性條件下，脂的過氧化物能把Fe2+氧化為Fe3+，然後氧化二甲酚橙(xylenol orange)，產物在可見光區620nm有強烈吸收。在96孔板上測定。Zhang等建立了HIV逆轉錄酶抑制劑(抗病毒葯物)的高通量篩選方法。方法使用了「同質時間分辨熒光」(homogenous time resolved fluorence，HTRF)技術，既實現了非分離操作(同質)，又避免了放射性同位素的使用。該方法基於逆轉錄酶能很容易地將核苷酸類似物(如生物素-11-dUTP)引入新生DNA鏈。在96或384孔板上，將生物素化的引物/模板與抗生蛋白鏈菌素-銪在板孔中混合孵育，加入逆轉錄酶，再加入生物素-dUTP和d-TTP混合物啟動反應。反應60min後，加入鏈親和素-別藻藍蛋白(streptavidin-allophycocyanin)，孵育，用HTRF分析儀讀取數據。該法也可用於多種其他的核酸聚合酶。
1.5.2 以受體為靶的高通量篩選 以受體為作用靶的高通量篩選方法。檢測功能反應的優點是易於區分激動劑和拮抗劑。經典的功能檢測方法通量低，而引入基於重組技術的報告基因檢測方法極大地提高了篩選通量，既高效且節省成本。檢測第二信使或下游機制如磷酸化，傳統方法也比較麻煩，不適於高通量檢測，但將這些機制與報告基因相偶聯則能克服。
1.5.3 以離子通道為靶的高通量篩選 Negri等建立了貝類動物毒素的高通量篩選方法。其作用靶為Na+通道上的蛤蚌毒素(STX)結合位點，用放射性配體(3H-STX)進行競爭性結合試驗考察受試樣品。Yong等用酵母雙雜交的方法高通量篩選干擾N型鈣通道β3亞單位與α1β亞單位相互作用的小分子，尋找新型鈣通道拮抗劑。
1.5.4 以核酸為靶的高通量篩選 Hamasaki等建立了以16S rRNA編碼區結構和HIV-RRE RNA結構為靶的抑制劑的高通量篩選方法。尋找類似氨基糖甙類抗生素而親和力更高或作用於相同核酸的其他位點的新化合物，以及不易被代謝失活的新化合物。方法基於當含芘的氨基甙類似物結合於RNA時，芘的熒光被淬滅的原理。在96孔板上，將芘碳醯巴龍黴素(PCP)，RNA結構配成溶液後加入有受試化合物的板孔中，用熒光讀板器考察熒光恢復的程度。
1.5.5 以細胞功能為基礎的高通量篩選
1.5.5.1 內皮細胞激活 內皮細胞激活是急慢性炎症過程中重要的組成環節。Rice等以E選擇蛋白在細胞表面的表達作為標志，建立了內皮細胞激活抑制劑的高通量篩選方法。建立人臍靜脈內皮細胞培養系統。IL-1刺激下，E選擇蛋白在內皮細胞表面的表達用ELISA方法定量。方法包括細胞固定、加液、加受試化合物等操作，能保持細胞完整，不昂貴，可重復，篩選速度可達每星期1000種化合物。適用化合物范圍很寬，並且方法用細胞作為檢測對象，使能夠較早地發現細胞對化合物的攝取及化合物的細胞毒性。
1.5.5.2 細胞凋亡 Erusalimsky等建立了新型細胞凋亡調節物的高通量篩選方法。細胞預先用3H 胸苷標記，與凋亡誘導物孵育後，連續經過兩種玻璃濾器。一個是中性的，捕獲完整的染色質和高分子量DNA。另一個裝有DEAE活性基團，捕獲低分子量DNA碎片。通過對濾器上放射性的測量，可以對DNA的破碎情況定量。
1.5.5.3 抗腫瘤活性 Lu等建立了用高通量「生物活性指紋」篩選抗肺癌葯物的方法，考察受試分子(類維生素A及類維生素A相關分子)對許多不同細胞系的效應特點。檢測指標包括：(1)肺癌細胞生長抑制檢測。選擇了約50種腫瘤和非腫瘤細胞，包括了大量不同的組織和(或)腫瘤來源。細胞暴露於受試化合物5d後，用標准比色法測定存活細胞百分率。20%生長抑制率指示有活性。(2)集落形成抑制檢測，用以區分細胞生長抑製作用和細胞殺傷作用。6孔板上加NCI-H292非小細胞肺癌細胞，暴露於受試物一定時間。然後對細胞進行清洗，植於無受試物的培養介質共7d。用結晶紫對細胞染色，考察集落形成情況。(3)凋亡檢測，用ELISA方法測量細胞DNA破碎。(4)轉錄調控檢測，用以考察受試化合物是否有類維生素A受體介導的轉錄抑製作用。方法是將HeLa TK-細胞用73Col-CAT報告基因連同受體的表達載體轉染，與受試物一起培養，用ELISA方法檢測CAT活性。
1.5.5.4 G2檢查點(G2 checkpoint) Roberge等建立了G2期檢查點抑制劑的高通量篩選方法。將MCF-7m p53細胞培養，種在96孔聚苯乙烯組織培養板上。照射使細胞進入G2靜止期，加入受試化合物用ELISA方法檢測核仁蛋白(nucleolin)的磷酸化形式，從而得到從G2期釋放進入M期的細胞數量，即抑制G2檢查點程度。
1.5.5.5 信號轉導通路 Su等建立了TGFβ3通路作用物的高通量篩選方法。構建融合報告基因，轉染細胞，選擇蟲熒光素酶表達能被TGFβ高誘導的克隆。將細胞植於96孔板，與受試化合物孵育後，稀釋並加入Steady-Glo底物測蟲熒光素酶活力，與對照比較，計算相對酶活性增加值。
1.5.5.6 細菌蛋白分泌 Alksne等建立了以抑制細菌蛋白分泌為作用方式的新型抗生素的高通量篩選方法。該方法基於SecA-lacZ融合報告基因。SecA是一種自我調控翻譯的蛋白，當細菌蛋白分泌被干擾時，該報告基因被誘導。
1.5.5.7 細菌生長 Chung等建立了抑制分枝桿菌生長化合物的高通量篩選方法。選擇了一種腐生性分枝桿菌代替結核分枝桿菌，因其具有生長迅速以及非感染性的特點。通過測定細胞攝入放射性標記的尿嘧啶，考察受試化合物對分枝桿菌活力的作用。用96孔板的形式，1d內可以測試數千個樣品。
2．生葯活性成分的高通量篩選
樣品是高通量葯物篩選的物質基礎，樣品庫來源的化學多樣性是決定高通量篩選技術能否成功的關鍵因素之一。前面我們談到，化合物樣品主要有常規化學合成、組合化學合成和從天然產物中分離純化幾個來源。而從天然產物中分離出來的化合物，由於其母核結構和活性基團是長期的自然選擇形成的，它們具有人工合成化合物所不能比擬的優勢。
我國擁有非常豐富的葯材資源，幾十年來，我們應用葯理學手段，對我國的傳統葯物進行了大規模的研究和篩選，取得了巨大成就。但是，僅僅依靠傳統的葯理實驗方法，既耗時，勞動強度又大，還需要使用大量實驗動物，顯然不能適應大量樣品的同時篩選。雖然經過努力，已從生葯中分離、提取、純化出大量化合物，但由於研究手段的落後，使大量分離出的化合物得不到充分的利用，造成了化合物資源的極大浪費。
因此，將高通量篩選技術應用於生葯的活性成分研究，既是對高通量篩選技術的不斷完善，又是將這一技術應用於中葯現代化研究的有益嘗試。
如何對生葯的活性成分進行高通量篩選呢？其原理、方法和人工合成化合物的高通量篩選基本一致，區別主要在於篩選前需要從生葯中將化合物提取出來並進行適當的分離和化學多樣性的評價。相同的就不再贅述，這里主要談一下提取、分離和多樣性評價的問題。
2.1 提取 由於高通量篩選需要大量的樣品來源，所以常規的提取方法顯然不能滿足這一要求。尋找一個快速、高效、連續、自動化的提取方法顯得迫在眉睫。加速溶劑提取技術是一個新的提取技術，在准備好樣品和對提取方法（或程序）進行設定後，自動進樣和自動收集裝置就可以連續對最多24個不同樣品自動完成樣品的提取和提取液的收集，簡單方便。應用這一技術，可以得到大量的生葯的提取物。
2.2 分離及化學多樣性評價 我們都知道，生葯的化學成分相當復雜，通過提取得到的提取物往往是大量單體組成的混合物，所以篩選前需要對生葯的提取物進行適當的分離。在眾多的分離手段中，制備型HPLC應該是最為理想的，它具有快速、高效、自動化等諸多優點。
分離完成後還需要對分離的物質進行化學多樣性的評價，以提高高通量篩選的效率。以前，這種評價多是基於物種的地理分布、生物學分類、化學分類以及基源等關系，隨著科技的進步，多種現代化手段開始應用於化學多樣性的評價。其中，色譜-電噴霧質譜聯用（HPLC-ESI-MS）技術在這方面做出了有力的嘗試。首先，它做出成分的離子信號（m/z）對保留時間的平面圖，然後對這些數據進行統計學的相似度評估從而對樣品的多樣性進行定量的評價。接著，三維的HPLC數據被轉換為CDF文件格式並傳輸到UNIX工作站。數據文件中的每一個離子（包括保留時間、質量、離子強度等數據）被定位在一個二維圖譜中，保留時間和質量分佔一個軸，離子強度數據儲存在位點中。濾除雜訊以後，離子的中心時間和中心質量被計算出來。根據對LCMS的數據處理，混合物間的相似度被定量地計算出來。這種數據處理基於以下的一種關系，這種關系表徵了樣品1中的離子i和樣品2中的離子j的「化學空間」距離。
其中，ti表示離子i的色譜保留時間，mi表示離子i的質荷比（m/z），wt是保留時間的權重系數，wm是質量的權重系數。dij是離子i和離子j的歐幾里的距離，n1和n2分別是樣品1和樣品2中確認的離子數。sij是離子i和離子j之間的相似度（0-1），相似度值為1表明是相同樣品，相反，相似度值接近0則表明樣品具有很高的化學多樣性。通過這種方法，可以很好的解決樣品化學多樣性的評價問題。

Ⅳ 如何建立好葯物含量的高效液相色譜分析方法

1，首先必須去進行配製葯物溶液前處理的工作。找出該葯物的溶解性，探索出該葯物的有效溶劑，使該葯物能在該溶劑中充分溶解，這是葯物溶液配製的前處理必然途徑，也是進行高效液相色譜含量分析的首要條件。

2，然後就是根據該葯物配製溶液的前處理方法，配製好適當濃度的葯物溶液，利用該葯物溶液，在紫外-可見分光光度計上進行紫外掃描，找到該葯物的最大吸收波長，確立適合的高效液相色譜分析的檢測波長。因為它是進行高效液相色譜含量分析的基本條件

3，再是色譜柱的選擇：根據葯物的極性來選擇合適極性的色譜柱類型

4，再是流動相的確立。配製一系列的流動相，考察合適的流動相。

5，再是准確度考察。通過精密度、重復性和重現性的考察來衡量儀器的准確度

6，接著是線性關系考察。配製不同濃度的一系列溶液，進行其溶液的色譜掃描。根據所得的不同濃度下的葯物峰面積作為縱坐標（Y軸）、以溶液濃度為橫坐標（X軸）進行線性回歸，得到其線性圖，考察其線性程度，即線性相關系數R=？。考察的目的就是：為了我們在做含量分析時，選擇一個合適的濃度進行檢測，不至於你配製的待測溶液濃度范圍不在線性范圍之內，造成測量結果的錯誤。

7，再是最低檢測濃度和檢測限的考察。目的是為了考察這種方法的實用性，是否符合痕量分析的要求。

8，再是回收率考察。目的是考察方法的准確性。

9，再是穩定性考察。目的是考察試驗方法的時間性，指導我們在分析檢測時，建立合適的溶液配製到進樣的時間段，保證實驗結果的准確性。

10，最後是專屬性考察。

Ⅵ 葯物化學課程中通過哪些研究內容去發現一個安全有效的葯物

葯物化學是一門經驗學科，只有隨著我們葯物合成和葯物臨床應用的不斷積累，這門學科的內容才會越來越豐富，現在出現的構效關系，或者定量構效關系就是經驗積累的結果，計算機的大量應用也為學科的飛速發展奠定了基礎，通過快速的計算分析，我們可以預測分子結構的修飾與受體之間的親和力，可以預測哪些基團的加入會影響葯物的半衰期，葯物的毒性，當然所有這一切只是在大量經驗的數據上通過參數分析得出的，究竟怎麼樣還很難說，還得通過離體的細胞實驗去驗證葯物的有效性，通過動物實驗驗證葯物的毒性。

Ⅶ 論述從環境中篩選目標菌中的方法，一種就可以，詳細點

5.6 菌種篩選方法

所有的微生物育種工作都離不開菌種篩選。尤其是在誘變育種工作中，篩選是最為艱難的也是最為重要的步驟。經誘變處理後，突變細胞只佔存活細胞的百分之幾，而能使生產狀況提高的細胞又只是突變細胞中的少數。要在大量的細胞中尋找真正需要的細胞，就象是大海撈針，工作量很大。簡潔而有效的篩選方法無疑是育種工作成功的關鍵。 為了花費最少的工作量，在最短的時間內取得最大的篩選成效，就要求採用效率較高的科學篩選方案和手段。因為誘變育種中的篩選工作最復雜，所以，本節主要討論誘變育種的篩選方法，這些方法也為其它育種方法的篩選提供了借鑒。

5.6.1菌種篩選方案 在實際工作中，為了提高篩選效率，往往將篩選工作分為初篩和復篩兩步進行。初篩的目的是刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產性狀類似的菌株盡量保留下來，使優良菌種不致於漏網。因此，初篩工作以量為主，測定的精確性還在其次。初篩的手段應盡可能快速、簡單。復篩的目的是確認符合生產要求的菌株，所以，復篩步驟以質為主，應精確測定每個菌株的生產指標。

5.6.2 菌種篩選的手段 篩選的手段必需配合不同篩選階段的要求，對於初篩，要力求快速、簡便，對於復篩，應該做到精確，測得的數據要能夠反映將來的生產水平。

5.6.2.1 從菌體形態變異分析 有時，有些菌體的形態變異與產量的變異存在著一定的相關性，這就能很容易地將變異菌株篩選出來。盡管相當多的突變菌株並不存在這種相關性，但是在篩選工作中應盡可能捕捉、利用這些直接的形態特徵性變化。當然，這種鑒別方法只能用於初篩。有人曾統計過3,484個產維生素B2的阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)的變異菌落，發現高產菌株的菌落形態有以下特點：菌落直徑呈中等大小（8-10毫米），凡過大或過小者均為低產菌株；色澤深黃色，凡淺黃或白色者皆屬低產菌株。又如，在灰黃黴素產生菌蕁麻青黴(Penicillium urticae)的育種中，曾發現菌落的棕紅色變深者往往產量有所提高，而在赤黴素生產菌藤倉赤霉（Gibberella fujikuroi）中，卻發現菌落的紫色加深者產量反而下降。

5.6.2.2 平皿快速檢測法 平皿快速檢測法是利用菌體在特定固體培養基平板上的生理生化反應，將肉眼觀察不到的產量性狀轉化成可見的"形態"變化。具體的有紙片培養顯色法、變色圈法、透明圈法、生長圈法和抑制圈法等，見圖5.6.1。這些方法較粗放，一般只能定性或半定量用，常只用於初篩，但它們可以大大提高篩選的效率。它的缺點是由於培養平皿上種種條件與搖瓶培養，尤其是發酵罐深層液體培養時的條件有很大的差別，有時會造成兩者的結果不一致。 圖 5.6.1 平皿快速檢測法示意圖 平皿快速檢測法操作時應將培養的菌體充分分散，形成單菌落，以避免多菌落混雜一起，引起"形態"大小測定的偏差。

1) 紙片培養顯色法 將飽浸含某種指示劑的固體培養基的濾紙片擱於培養皿中，用牛津杯架空，下放小團浸有3%甘油的脫脂棉以保濕，將待篩選的菌懸液稀釋後接種到濾紙上，保溫培養形成分散的單菌落，菌落周圍將會產生對應的顏色變化。從指示劑變色圈與菌落直徑之比可以了解菌株的相對產量性狀。指示劑可以是酸鹼指示劑也可以是能與特定產物反應產生顏色的化合物。

2) 變色圈法 將指示劑直接摻入固體培養基中，進行待篩選菌懸液的單菌落培養，或噴灑在已培養成分散單菌落的固體培養基表面，在菌落周圍形成變色圈。如在含澱粉的平皿中塗布一定濃度的產澱粉酶菌株的菌懸液，使其呈單菌落，然後噴上稀碘液，發生顯色反應。變色圈越大，說明菌落產酶的能力越強。而從變色圈的顏色又可粗略判斷水解產物的情況。

3) 透明圈法 在固體培養基中滲入溶解性差、可被特定菌利用的營養成分，造成渾濁、不透明的培養基背景。將待篩選在菌落周圍就會形成透明圈，透明圈的大小反映了菌落利用此物質的能力。 在培養基中摻入可溶性澱粉、酪素或CaCO3可以分別用於檢測菌株產澱粉酶、產蛋白酶或產酸能力的大小。

4) 生長圈法 利用一些有特別營養要求的微生物作為工具菌，若待分離的菌在缺乏上述營養物的條件下，能合成該營養物，或能分泌酶將該營養物的前體轉化成營養物，那麼，在這些菌的周圍就會有工具菌生長，形成環繞菌落生長的生長圈。 該法常用來選育氨基酸、核苷酸和維生素的生產菌。工具菌往往都是對應的營養缺陷型菌株。

5) 抑制圈法 待篩選的菌株能分泌產生某些能抑制工具菌生長的物質，或能分泌某種酶並將無毒的物質水解成對工具菌有毒的物質，從而在該菌落周圍形成工具菌不能生長的抑菌圈。例如：將培養後的單菌落連同周圍的小塊瓊脂用穿孔器取出，以避免其它因素干擾，移入無培養基平皿，繼續培養4-5天，使抑制物積累，此時的抑制物難以滲透到其它地方，再將其移入塗布有工具菌的平板，每個瓊脂塊中心間隔距離為2厘米，培養過夜後，即會出現抑菌圈。抑菌圈的大小反映了瓊脂塊中積累的抑制物的濃度高低。該法常用於抗生素產生菌的篩選，工具菌常是抗生素敏感菌。由於抗生素分泌處於微生物生長後期，取出瓊脂塊可以避免各菌落所產生抗生素的相互干擾。典型的例子是春雷黴素生產菌的篩選，見圖5.6.2。

5.6.2.3 搖瓶培養法 搖瓶培養法是將待測菌株的單菌落分別接種到三角瓶培養液中，振盪培養，然後，再對培養液進行分析測定。搖瓶與發酵罐的條件較為接近，所測得的數據就更有實際意義。但是搖瓶培養法需要較多的勞力、設備和時間，所以，搖瓶培養法常用於復篩。但若某些突變性狀無法用簡便的形態觀察或平皿快速檢測法等方法檢測時，搖瓶培養法也可用於初篩。 初篩的搖瓶培養一般是一個菌株只做一次發酵測定，從大量菌株中選出10-20%較好的菌株，淘汰80-90%的菌株；而復篩中搖瓶培養一般是一個菌株培養3瓶，選出3-5個較好的菌株，再做進一步比較，選出最佳的菌株。

5.6.3 特殊變異菌的篩選方法 上述一般的篩選菌株方法的處理量仍是很大的，為了從存活的每毫升106左右細胞的菌懸液中篩選出幾株高產菌株，要進行大量的稀釋分離、搖瓶和測定工作。雖然平皿快速檢測法作為初篩手段可減少搖瓶和測定的工作量，但稀釋分離的工作仍然非常繁重。而且有些高產變異的頻率很低，在幾百個單細胞中並不一定能篩選到，所以，建立特殊的篩選方法是極其重要的。例如營養缺陷型和抗性突變菌株的篩選有它們的特殊性，營養缺陷型或抗性突變的性狀就象一個高效分離的"篩子"，以它為篩選的條件，可以大大加快篩選的進程並有效地防止漏篩。在現代的育種中，常有意以它們作為遺傳標記選擇親本或在DNA中設置含這些遺傳標記的片段，使菌種篩選工作更具方向性和預見性。本節還將簡單介紹其它一些特殊變異株的篩選方法。

5.6.3.1營養缺陷型突變株的篩選 經誘變處理後的菌懸液在篩選前一般應先進行誘變後培養，以促使變異細胞發生分離，防止出現表型延遲現象，篩選出不純的菌株。營養缺陷型的篩選一般包括濃縮、進一步檢出和鑒別營養缺陷型等步驟。

1) 濃縮營養缺陷型菌株 誘變後的細胞群體中大部分存活菌是野生型，而營養缺陷型占的比例相當小，這對分離是很不利的，所以，應該淘汰大量的野生型，以達到濃縮營養缺陷型的目的。常用的濃縮方法有抗生素法、菌絲過濾法、差別殺菌法和飢餓法等。

2)進一步檢出所需缺陷型 濃縮後的菌液中營養缺陷型的比例較大，但並非全部都是。並且營養缺陷型中也有不同的類型，還需要進一步檢出所需要的營養缺陷型。這樣就需要採用逐個檢出法、夾層培養法和限量補給法等方法進一步檢出所需要的營養缺陷型。

3)營養缺陷型的鑒定 獲得的營養缺陷型菌株還應進一步確認其生長的所需物。菌株較少時，可用生長譜法， 若菌株較多時，常採用組合補充培養基法

5.6.3.2 抗性突變菌株的篩選 抗性突變株的篩選相對比較容易，只要有10-6頻率的突變體存在，就容易篩選出來。抗性突變株的篩選常用的有一次性篩選法和階梯性篩選法兩種手段。

1) 一次性篩選法 一次性篩選法就是指在對出發菌株完全致死的環境中，一次性篩選出少量抗性變異株。 噬菌體抗性菌株常用此方法篩選。將對噬菌體敏感的出發菌株經變異處理後的菌懸液大量接入含有噬菌體的培養液中，為了保證敏感菌不能存活，可使噬菌體數大於菌體細胞數。此時出發菌株全部死亡，只有變異產生的抗噬菌體突變株能在這樣的環境中不被裂解而繼續生長繁殖。通過平板分離即可得到純的抗性變異株。 耐高溫菌株在工業發酵中的應用意義在於它可以節約冷卻水的用量，尤其是在夏季，並能減少染菌的機會。耐高溫菌株所產生酶的熱穩定性較高，適用於一些特殊的工藝過程。耐高溫菌株也常採用此法篩選。將處理過的菌懸液在一定高溫下處理一段時間後再分離。對此溫度敏感的細胞被大量殺死，殘存的細胞則對高溫有較好的耐受性。 耐高濃度酒精的酵母菌的酒精發酵能力較高，也適宜提高發酵醪濃度，提高醪液酒精濃度。而耐高滲透壓的酵母菌株具有積累甘油的性能，可用於甘油發酵。耐高酒精度、高滲透壓的菌株也可分別在高濃度酒精或加蔗糖等造成的高滲環境下一次性篩選獲得。

2)階梯性篩選法 葯物抗性即抗葯性突變株可在培養基中加入一定量的葯物或對菌體生長有抑製作用的代謝物結構類似物來一次性篩選，大量細胞中少數抗性菌在這種培養基平板上能長出菌落。但是在相當多的情況下，無法知道微生物究竟能耐受多少高濃度的葯物，這時，葯物抗性突變株的篩選需要應用階梯性篩選法。 因為葯物抗性常受多位點基因的控制，所以葯物的抗性變異也是逐步發展的，時間上是漸進的，先是可以抗較低濃度的葯物，而對高濃度葯物敏感，經"馴化"或誘變處理後，可能成為抗較高濃度葯物的突變株。階梯篩選法由梯度平板或紙片擴散在培養皿的空間中造成葯物的濃度梯度，可以篩選到耐葯濃度不等的抗性變異菌株，使暫時耐葯性不高，但有發展前途的菌株不致於被遺漏，所以說，階梯性篩選法較適合於葯物抗性菌株的篩選，特別是在暫時無法確定微生物可以接受的葯物濃度情況下

5.6.3.3 組成酶變異株的篩選

許多水解酶是誘導酶，只有在含有底物或底物類似物的培養環境中，微生物才會合成這些酶類，所以，誘導酶的生產不僅需要誘導物，而且受到誘導物的種類、數量以及分解產物的影響。能迅速利用的碳源（如葡萄糖）往往會引起酶合成的減少，誘導物有時又比較昂貴。這些都可能造成這些水解酶工業生產的波動以及生產成本提高。如果控制這些酶合成的調節基因發生了變異，誘導酶就可能轉變成組成酶，它的合成與細胞的其它組織蛋白一樣，不再需要誘導物的存在。由誘導型的出發菌株誘變篩選出組成型變異株對於水解酶的工業生產具有重要的現實意義。具體的篩選方法有恆化器法、循環培養法和誘導抑制物法。

1) 恆化器法 恆化器常被用於微生物的"馴化"。在培養基中添加不能起誘導作用的低濃度底物，接入處理後的菌懸液進行培養，此時出發菌株由於不能被誘導，無法合成有關的誘導酶而不能分解該底物，從而生長速率極慢，而群體中少數組成型變異株則可合成有關的酶，分解利用該底物，生長速率較快。為了提高組成酶變異株的優勢，即它在群體中的比例，可以應用恆化器培養技術。隨著恆化器培養中不斷加入新鮮基質而逐漸增大組成酶變異株的優勢，這樣就能夠比較容易地做進一步的純化分離。

2) 循環培養法 利用不含誘導物的培養環境和含有誘導物的培養環境進行交替循環培養待分離的菌懸液，從而使組成酶變異株得到富集。當接種到不含誘導物而含有其它可利用碳源的培養基中時，兩種類型菌株同樣能較好地生長，但在此環境中組成型突變株已能合成有關的水解酶，而誘導型菌株就不能合成。 進而將它們轉接入含誘導物的培養基中時，變異株能迅速利用誘導底物進行生長繁殖，而誘導型出發菌株需經歷一個誘導合成酶的階段，兩類菌株的生長就不同步了，隨著循環交替培養的繼續，組成酶變異株所佔的比例將逐漸增大。

3) 誘導抑制劑法 有些化合物能阻止某些誘導酶的合成，如α-硝基苯基-β-岩藻糖苷對大腸桿菌的β-半乳糖苷酶的誘導合成有抑製作用，稱為誘導抑制劑。當在誘導物和誘導抑制劑同時存在的培養環境中培養待分離菌群時，誘導型菌株不能產生誘導酶，無法正常生長，只有組成型變異株能夠利用底物進行生長繁殖。

5.6.3.4高分子廢棄物分解菌的篩選 隨著石油化工和塑料工業的發展，各種高分子包裝廢棄物日益增多，這些"白色污染"在自然界很難被消化而進入物質循環。設法選育能分解利用這些高分子材料的微生物對於環境保護至關重要。這些高分子材料大多是不溶於水的，直接分離具有分解功能的微生物很困難。為此，有人設計了階段式篩選法，首先尋找能在與聚乙二醇結構相似的含兩個醚鍵的三甘醇上生長的微生物，接著，誘變篩選能分解聚乙二醇的變異株；或者篩選能以乙二醇、丙二醇為碳源的菌株，繼而誘變篩選出能利用聚乙二醇等物質的變異株。這種由簡單的聚合物單體入手逐級篩選高分子廢棄物分解菌也許是一條有效的篩選思路。

5.6.3.5無泡沫菌株及高凝聚性菌株的篩選 有些菌在發酵過程中會產生大量的泡沫，從而造成發酵液滿溢，增大了染菌的機會，使發酵體系反應不均勻，也有可能引起某些發酵產物的生物活性喪失，如蛋白酶變性失活。為了避免泡沫的產生，常常需通過犧牲發酵液的裝量或加入大量的消泡劑來消除泡沫的不利影響。發酵過程產生泡沫是菌體代謝、培養基和發酵工藝等方面的原因造成的，而菌種是產生泡沫的關鍵，選育無泡沫或少泡沫菌株可以從根本上解決泡沫問題。 有人用氣泡上浮法篩選出了無泡沫的酒精酵母。將變異處理後的菌懸液接種入生長培養基中，培養器皿的底部放置無菌壓縮空氣噴口，培養過程中不斷通入無菌空氣，形成鼓泡，易產生泡沫的酵母菌會隨泡沫而除去，留下的是不易產生泡沫的變異菌株；也有人用苯胺藍染色法進行篩選，將經過變異處理的菌懸液經培養後塗布在含葡萄糖3%、酵母膏0.5%、苯胺藍0.005%的平板上培養4天，出發菌株呈淺藍色，變異菌株因細胞壁成分和結構改變造成與染料結合力改變，少泡沫的變異菌株呈深藍色。 啤酒發酵和單細胞蛋白培養都希望由凝聚性較好的酵母菌株擔任發酵菌種，以便於啤酒的澄清和保持良好的風味，以及單細胞蛋白的收集。採用上述的泡沫上浮法也可以除去不易凝聚的細胞，通過改變鼓泡速度的調節，可以獲得具不同凝聚性的菌株。

Ⅷ 請教！血葯濃度的一般監測方法

一、需要進行TDM的葯物
盡管分析技術發展很快，但並不是所有的葯物都需要監測血葯濃度。如血葯濃度和療效相關性不好的葯物、安全范圍寬的葯物、以及療效顯而易見的葯物。只有符合下列條件的葯物才需要進行TDM。
1．血葯濃度與葯效關系密切的葯物。
2．治療指數低、毒性反應強的葯物（地高辛、茶鹼、抗心律失常葯、氨基甙類抗生素、抗癲癇葯、甲氨蝶呤、鋰鹽等）。
3．有效治療濃度范圍已經確定的葯物。
4．具有非線性動力學特性的葯物。這些葯物在用到某一劑量量，體內葯物代謝酶或轉運載體發生了飽和，出現了一級和零級動力學的混合過程，此時劑量稍有增加，血葯濃度便急驟上升，t1/2明顯延長，而產生中毒症狀，此類葯物如苯妥英、普奈洛爾等。
5．葯物的毒性反應與疾病的症狀難以區分時，是因為給葯劑量不足，還是因為過量中毒，如地高辛等。
6．用於防治一些慢性疾病發作的葯物（如茶鹼、抗癲癇葯、抗心率失常葯），不容易很快判斷療效，通過測定穩態血葯濃度可適當調整劑量。
7．治療如果失敗會帶來嚴重後果。
8．患有心、肝、腎和胃腸道等臟器疾患，可明顯影響葯物的吸收、分布、代謝和排泄的體內過程時，血葯濃度變動大，需要進行監測。
9．在個別情況下確定病人是否按醫囑服葯。
10．提供治療上的醫學法律依據。
二、血葯濃度的一般監測方法
1.高效液相色譜法；
2.氣相色譜法；
3.微生物法（用於抗生素）。
三、一般三甲醫院可以做這樣的監測。

Ⅸ 葯物篩選的活性實驗

葯物篩選是現代葯物開發流程中檢驗和獲取具有特定生理活性化合物的一個步驟，系指通過規范化的實驗手段從大量化合物或者新化合物中選擇對某一特定作用靶點具有較高活性的化合物的過程。葯物篩選的過程從本質上講就是對化合物進行葯理活性實驗的過程，隨著葯物開發技術的發展，對新化合物的生理活性實驗從早期的驗證性實驗，逐漸轉變為篩選性實驗，即所謂的葯物篩選。
作為篩選，需要對不同化合物的生理活性做橫向比較，因此葯物篩選的實驗方案需具有標准化和定量化的特點。隨著組合化學和計算化學的發展，人們開始有能力在短時間內大規模合成和分離多種化合物，因而在現代新葯開發流程中葯物篩選逐漸成為發現先導化合物的主要途徑之一。

Ⅹ 抗腫瘤葯物怎樣選擇試驗濃度

[1]尋找與該新葯結構類似的化合物的抗癌活性篩選資料作為參考.
[2]做量效關系試驗,選擇至少六個以上濃度,一開始拉得大些,可從微克(微摩爾)到納克(納摩爾).在此基礎上縮小濃度間距.多做幾次,求出IC50.
[3]一般在十微克(十微摩爾)以下才有開發價值.
[4]要注意多選幾種腫瘤細胞株試試,最好也包括非肉瘤細胞株.有抗癌選擇性是最好的結果.
[5]也要注意設陽性葯對照,以排除方法學的問題,並可比較新化合物的作用強度.一般可選5-氟尿嘧啶等.