戊糖實驗測量方法

㈠ 可用甚麼色彩反應鑒別酮糖和戊糖的存在

多羥基酮稱為酮糖，如2羥丙酮、赤蘚酮糖、木酮糖、果糖、景天庚酮糖等都是天然存在的酮糖，酮糖都是α碳上有羥基的酮。醛糖和酮糖具有醇羥基和羰基的性質，都是還原糖，由於酮糖份子內雖然無醛基，但其羰基受相鄰α碳原子上羥基的影響，而顯現出還原活性。二者的鑒別：(1)西利萬諾夫實驗(Seliwanofs
test)，間苯2酚於鹽酸中與酮糖反應呈紅色，而醛糖呈色很淺；(2)弱氧化劑，如溴水可將醛糖氧化成相應的糖酸，而對酮糖則無氧化作用。

㈡ Dische比色法具體是怎樣操作

dische比色法又稱硫酸咔唑法，咔唑比色法

1 材料與儀器

0.1% 咔唑試液(50 mg咔唑溶於50 mL 95%乙醇)，葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)、鼠李糖(Rha)、果糖(Fru)均為化學純，枸杞多糖樣品LbGP3，LbGP4，LbP1，LbP2，LbP3由本課題組提供。722分光光度計。

2 方法與結果

2.1 常用的硫酸-咔唑法
2.1.1 標准曲線繪制：精確稱取乾燥的單糖標准樣品10 mg，定容於25 mL容量瓶中。然後准確量取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mL單糖標准溶液於帶塞試管中，各管加水至1 mL。在冰水浴中向各管加入6 mL濃硫酸，搖勻後，改在85 ℃水浴中保持20 min，取出後冷至室溫，各管加0.2 mL咔唑液，在室溫下保持2 h，測定吸收度(530 nm)，以濃度對吸收度作標准曲線。
2.1.2 測定各單糖在530 nm處的檢測響應：分別准確吸取各種單糖溶液(10 mg/25 mL)0.4 mL，補水至1 mL用2.1.1項下方法測得其吸收值，結果如表1。

表1 咔唑法測定時各單糖在530 nm處的吸收值

Gal Glc Man Xyl Ara Rha Fru GalA GlcA
0.0493 0.1018 0.0503 0.0840 0.0251 0.0140 0.1245 0.2603 0.2498

上述結果表明，用咔唑法測定時，天然多糖化合物中常見的各種中性單糖在530 nm處也均有程度不同的吸收。
2.2 各單糖濃度與咔唑法測定時在530 nm處吸收值的線性關系：以常用咔唑法(參考2.1.1)測定各單糖吸收標准曲線(其中GalA和GlcA標准溶液的配製為精確稱取乾燥的糖醛酸10 mg溶於100 mL容量瓶)，其線性回歸方程及相關系數如下。
Glc Y=0.4631X+0.004939(r=0.9996)
Gal Y=0.2358X+0.004567(r=0.9993)
Man Y=0.1587X+0.002963(r=0.9998)
Xyl Y=0.2559X+0.000884(r=0.9997)
Fru Y=0.1727X+0.001872(r=0.9960)
Rha 吸收值基本保持不變
GalA Y=0.5857X+0.005917(r=0.9998)
GlcA Y=0.4264X+0.000601(r=0.9999)
上述結果可知，各中性單糖在0.04～0.32 mg/mL范圍內、GalA和GlcA在0.01～0.08 mg/mL范圍內各單糖濃度與咔唑法檢測吸收值呈線性。
2.3 定量考察各中性單糖對咔唑法測定糖醛酸含量的影響
2.3.1 分別准確量取GalA和GlcA(10 mg/100 mL)0.4 mL，各加入0.0，0.4，0.6 mL各中性單糖溶液(10 mg/25 mL)，分別補水至1 mL，按咔唑法測其吸收值。
2.3.2 分別准確量取各中性單糖溶液(10 mg/25 mL)0.0，0.4，0.6 mL，分別補水至1 mL，按咔唑法測其吸收值。得數據如表2。
表2 各種中性單糖對糖醛酸影響的定量考察結果

A530 加入標准中性糖體積(mL) A530 加入標准中性糖體積(mL)
0.0 0.4 0.6 0.0 0.4 0.6
GalA+Glc 0.2738 0.3732 0.3920 GlcA+Glc 0.2438 0.3506 0.4043
Glc 0.0000 0.1017 0.1377 Glc 0.0000 0.1183 0.1741
(GalA+Glc)Glc 0.2738 0.2715 0.2543 (GlcA+Glc)Glc 0.2438 0.2323 0.2302
GalA+Gal 0.2549 0.3059 0.3495 GlcA+Ga1 0.2603 0.3143 0.3406
Gal 0.0000 0.0513 .0914 Gal 0.0000 0.0473 0.1051
(GalA+Gal)Gal 0.2549 0.2546 0.2584 (GlcA+Gal)Gal 0.2603 0.2670 0.2355
GalA+Man 0.2636 0.3152 0.3100 GlcA+Man 0.2403 0.3050 0.3101
Man 0.0000 0.0463 0.0552 Man 0.0000 0.0533 0.0854
(GalA+Man)Man 0.2636 0.2636 0.2548 (GlcA+Man)Man 0.2403 0.2517 0.2247
GalA+Xyl 0.2692 0.3455 0.3837 GlcA+Xyl 0.2600 0.3432 0.3710
Xyl 0.0000 0.0759 0.1275 Xyl 0.0000 0.084 0.1072
(GalA+Xyl)Xyl 0.2692 0.6296 0.2562 (GlcA+Xyl)Xyl 0.2600 0.2592 0.2638
GalA+Rha 0.2218 0.2400 0.2223 GlcA+Rha 0.2204 0.2370 0.2215
Rha 0.0000 0.0090 0.0170 Rha 0.0000 0.0100 0.0120
(GalA+Rha)Rha 0.2218 0.2310 0.2063 (GlcA+Rha)Rha 0.2204 0.2270 0.2095
GalA+Fru 0.2444 0.3721 0.4432 GlcA+Fru 0.2204 0.3585 0.4335
Fru 0.0000 0.1345 0.2191 Fru 0.0000 0.1103 0.2097
(GalA+Fru)Fru 0.2444 0.2376 0.2241 (GlcA+Fru)Fru 0.2204 0.2482 0.2338
GalA+Ara 0.2551 0.2678 0.3125 GlcA+Ara 0.2360 0.2619 0.28885
Ara 0.0000 0.0072 0.0539 Ara 0.0000 0.0254 0.0558
(GalA+Ara)Ara 0.2551 0.2606 0.2586 (GlcA+Ara)Ara 0.2360 0.2365 0.2327

上述實驗結果表明樣品的吸收值隨中性糖的含量增加而增大(Rha除外)，而樣品吸收值與中性糖吸收值之差和糖醛酸的吸收值基本一致。
2.4 改進的硫酸-咔唑法：根據2.3的實驗結果，我們提出一種改進的硫酸-咔唑法測定糖醛酸含量的方法，即樣品的吸收值減去中性糖的吸收值為樣品的吸收值。
2.4.1 標准溶液的配製
溶液1.准確量取GalA(10 mg/100 mL)0.2 mL，加入0.2 mL Gal(10 mg/25 mL)和0.2 mL Glc(10 mg/25 mL)，補水至1 mL。
溶液2.准確量取GalA(10 mg/100 mL)0.4 mL，加入0.2 mL Gal(10 mg/25 mL)和0.2 mL Glc(10 mg/25 mL)，補水至1 mL。
溶液3.准確量取GalA(10 mg/100 mL)0.6 mL，加入0.2 mL Gal(10 mg/25 mL)和0.2 mL Glc(10 mg/25 mL)，補水至1 mL。
中性單糖溶液.量取0.2 mL Gal(10 mg/25 mL)和0.2 mL Glc(10 mg/25 mL)，補水至1 mL。
2.4.2 方法改進前後糖醛酸測定結果的比較：上述中性單糖溶液按咔唑法測定在530 nm處的吸收值為0.0442。
表3所列結果表明，改進的咔唑法所測得的標准溶液中糖醛酸吸收值與實際測定值基本一致，因此這種改進的硫酸-咔唑法在測定各種樣品中糖醛酸的含量時，排除了樣品中中性糖對測定的影響，因而要比常用的硫酸-咔唑法准確。
表3 不同方法的糖醛酸測定結果

溶液1 溶液2 溶液3
咔唑法測定值 0.1497 0.2482 0.3628
改良咔唑法測定值 0.1055 0.2040 0.3186
糖醛酸實際值 0.1092 0.2058 0.3207

註：改進的咔唑法測定值為常用咔唑法測定值與標准配製溶液中中性單糖吸收值(0.0442)之差。
2.5 改進的咔唑法測定糖醛酸實例：從枸杞子中分離得到的多糖樣品LbGP3，LbGP4，LbP1，LbP2和LbP3中的糖醛酸含量測定，具體操作如下：
2.5.1 樣品中中性糖吸收值的測定：要求得樣品中中性糖對檢測的吸收干擾值，首先必須知道其中中性糖的含量和組成比。根據蒽酮-硫酸法〔4〕可測得中性糖的含量。組成比的測定需先將樣品全水解〔5〕，然後再用HPLC或GC測得樣品中各中性單糖的組成比。以此稱取各種相應標准中性單糖配成混合液，然後取1 mL溶液於帶塞試管中，然後按2.1.1所述的標准曲線制備操作，測得其吸收值。
2.5.2 樣品的吸收值測定：按咔唑法(方法同2.1.1)，測得樣品吸收值(註：樣品中中性糖濃度應在其線性范圍內)。
2.5.3 樣品中糖醛酸含量的測定：樣品中糖醛酸的吸收值為樣品吸收值與中性糖吸收值之差，再根據對應標準的回歸方程，計算出該樣品中糖醛酸含量。實驗結果如表4所示。

表4 常用的與改進的咔唑法測定糖醛酸含量結果的比較

糖醛酸含量(%)
多糖樣品 常用咔唑法 改進咔唑法
LbGP3 5.3 3.4
LbGP4 10.4 6.4
LbP1 8.8 5.9
LbP2 8.1 6.7
LbP3 8.7 5.7

從表4結果可以看出常用咔唑法測定糖醛酸的含量其值偏高。
3 討論

在咔唑法所規定的測定波長下，中性戊糖和中性己糖均有吸收，影響糖醛酸含量測定的准確性。為此我們對7種不同的中性糖分別進行了考察，測得其濃度與吸收值的線性范圍。實驗結果表明Xyl，Man，Glc，Gal，Fru分別找到了各自的線性范圍，Rha隨著濃度的改變其吸收值基本保持不變，Ara較難判斷。各種單糖線性范圍的測得，不僅證實了中性糖的存在對咔唑法測定糖醛酸的結果產生干擾，而且為提出一種比常用咔唑法准確性高的糖醛酸測定方法提供了實驗依據。
用咔唑法測定各種中性單糖對糖醛酸影響的定量考察實驗表明，糖醛酸和各中性單糖在其各自的線性范圍內取樣，樣品的吸收值與中性糖吸收值之差與不含中性糖的糖醛酸實際測得吸收值基本一致。

㈢ 鑒別糖的普通方法是什麼實驗

鑒別糖的普通方法是Molisch實驗。

用來鑒別糖與非糖的有兩個反應：Molisch反應和蒽酮反應。Molisch反應以奧地利植物學家Hans Molisch命名，是用α-萘酚和濃硫酸與糖反應，生成紫紅色。

㈣ 蒽酮比色法的蒽酮比色法測糖試驗

一實驗目的掌握蒽酮比色法測糖的原理和方法
二實驗原理蒽酮可以與游離的已糖或多糖中的已糖基、戊糖 基及已糖醛酸起反應，反應後溶液呈藍綠色，在620nm處有最大吸收。
三實驗器材及試劑
馬鈴薯乾粉
可調試移液器或移液管
可見分光光度計（723型）
電子分析天平
水浴鍋
電爐子
蒽酮試劑：取2g蒽酮溶解到80%H2SO4中，以80%H2SO4定容到1000ml，當日配製使用。
標准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）：100mg葡萄糖溶解到蒸餾水中，定容到1000ml備用。
四、操作
1.製作標准曲線
取7支乾燥潔凈的試管，按表1順序加入試劑，進行測定。
以吸光度值為縱坐標，各標准溶液濃度（mg/ml ）為橫坐標作圖得標准曲線。
表1 蒽酮比色法定糖——標准曲線的製作
沸水浴中准確煮沸10min，取出用流水冷卻，室溫放10min,於620nm處比色
葡萄糖濃度（mg/ml）
2.樣品含量的測定
樣品液的製作：
精確稱取馬鈴薯乾粉0.1g置於錐形瓶中—→加入30ml沸水—→沸水浴30min（不時搖動）—→取出，
3000rpm離心10min（或過濾）—→反復洗滌殘渣2次—→合並濾液—→冷卻至室溫—→定容到50ml的錐形瓶中—→再從中取出1ml，再定容到10ml的容量瓶中
樣品液的測定：
（1）取4支試管，按照表2加樣（加蒽酮時需要冰水浴5min冷卻）
表2 蒽酮比色法定糖——樣品的測定
（2）加樣冷卻完成後置沸水中煮沸10min，取出流水冷卻放置10min，620nm處比色測量各管OD值。
（3）以1號試管作為調零管，2、3、4號管的OD值取平均後從標准曲線上查出樣品液相應的含糖量。
3．結果計算：
C×V
w = ————×100%
m，
式中w：糖的質量分數（%）
C：從標准曲線中查出的糖質量分數（mg/ml）
V：樣品稀釋後的體積（ml）
m：樣品的質量（ml）
原理
植物在個體發育的各個時期，代謝活動也發生相應的變化，碳水化合物的代謝也不例外，其含量也隨之發生變化。了解可溶性糖含量的變化，在生理上和實踐上都有重要的意義。這里介紹的是蒽酮比色法，糖在硫酸的作用下生成糖醛，糖醛再與蒽酮作用，形成一種綠色的絡合物，顏色的深淺與糖含量有關。方法簡便，但沒有志一性，對於絕大部分的碳水化合物都能與蒽酮反應，產生顏色。
儀器葯品
721型分光光度計 分析天平
研缽 恆溫水浴鍋
燒杯 容量瓶
三角燒瓶 大試管
移液管 漏斗
乙醚 草酸鈉
飽和醋酸鉛
葡萄糖標准溶液：稱取已在80℃烘箱中烘至恆重的葡萄糖100mg，配製成500ml溶液，即得每ml含糖為200μg的標准溶液。
蒽酮試劑：稱取1g經過純化的蒽酮，溶解於1000ml稀硫酸中即得。硫酸溶液由760ml濃硫酸（比重1.84)稀釋成1000ml而成。
操作步驟
1．可溶性糖的提取
稱取重約5g的新鮮植物葉子，於研缽中乙醚少許，仔細研磨成均勻的漿狀物，倒入燒杯中，用70℃熱水洗滌研缽，洗液並入燒杯中，再加蒸鎦水30─40ml。將燒杯放在水浴鍋中加熱，保持溫度70─80℃約半小時，冷卻後1滴1滴地加入飽和中性醋酸鉛，以除去蛋白質，直至加入醋酸鉛時不再形成白色沉澱為止。然後將此混合物連同殘渣一並洗入100ml容量瓶中，加水至刻度，充分振盪。以乾燥漏斗將濾液過濾於一乾燥的三角燒瓶中，瓶中事先放有少量（約0.2─0.4g）草酸鈉粉末，以除去濾液中過量的醋酸鉛，使生成草酸鉛沉澱，再行過濾，所得的透明濾液即為可溶性糖提取液。
2．顯色及比色
吸取上述糖提取液1ml，放入一干潔的試管中，加蒽酮試劑5ml混合之，於沸水浴中煮沸10分鍾，取出冷卻，然後於分光光度計上進行測定，波長為625nm，測得吸光度。從標准曲線上查得濾液中的糖含量（或經直線回歸公式計算），然後再行計算樣品中含糖百分數。
3．繪制標准曲線
取標准葡萄糖溶液將其釋成一系列不同濃度的溶液，濃度分別為每ml含糖0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μg。按上述方法分別測得其吸光度，然後繪制A026－糖濃度曲線，或進行直線回歸求得直線方程。
4．計算樣品中含糖百分數(% )
設V為植物樣品稀釋後的體積(ml)
C為提取液的含糖量(μg/ml)
W為植物組織鮮重(g)
則得計算式如下： %=C×V/（W×1000000）×100%

㈤ 還原糖的測定方法有哪幾種

總糖:主要指具有還原性的葡萄糖，果糖，戊糖，乳糖和在測定條件下能水解為還原性的單糖的蔗糖(水解後為1分子葡萄糖和1分子果糖)，麥芽糖(水解後為2分子葡萄糖)以及可能部分水解的澱粉(水解後為2分子葡萄糖)。 還原糖:在糖類中，分子中含有游離醛基或酮基的單糖和含有游離醛基的二糖都是還原糖。還原性糖包括所有單糖(除二羥丙酮)、乳糖、麥芽糖等。非還原性糖有蔗糖、澱粉、纖維素等，但它們都可以通過水解生成相應的還原性單糖。 分光光度計:分光光度法則是通過測定被測物質在特定波長處或一定波長范圍內光的吸收度，對該物質進行定性和定量分析。常用的波長范圍為:(1)200,400nm的紫外光區(2)400,760nm的可見光區,(3)2.5,25μm(按波數計為4000cm<-1>,400cm<-1>)的紅外光區。所用儀器為紫外分光光度計、可見光分光光度計(或比色計)、紅外分光光度計或原子吸收分光光度計。為保證測量的精密度和准確度，所有儀器應按照國家計量檢定規程或本附錄規定，定期進行校正檢定。分光光度計採用一個可以產生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產生特定波長的光源，光源透過測試的樣品後，部分光源被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。單色光輻射穿過被測物質溶液時，被該物質吸收的量與該物質的濃度和液層的厚度(光路長度)成正比。糖含量的檢測方法

㈥ 定性測定糖的方法有哪些

糖的測定方法
一般有四種方法：
1、 直接滴定法。

原理為 糖還原天藍色的氫氧化銅為紅色的氧化亞銅。缺點：水樣中的還原性物質能對糖的測定造成影響。

2、 高錳酸鉀滴定法。

所用原理同直接滴定法。缺點：水樣中的還原性物質能對糖的測定造成影響，過程較為復雜，誤差大。

3、硫酸苯酚法。

糖在濃硫酸作用下，脫水形成的糠醛和羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物，在10-100mg范圍內其顏色深淺與糖的含量成正比，且在485nm波長下有最大吸收峰，故可用比色法在此波長下測定。苯酚法可用於甲基化的糖、戊糖和多聚糖的測定，方法簡單，靈敏度高，實驗時基本不受蛋白質存在的影響，並且產生的顏色穩定160min以上。

缺點：如果水樣呈橙紅色（大部分水樣為黃色），會對比色法造成較大的干擾。

4、蒽酮法

糖在濃硫酸作用下，可經脫水反應生成糠醛和羥甲基糠醛，生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反應生成藍綠色糠醛衍生物，在一定范圍內，顏色的深淺與糖的含量成正比，故可用於糖的測定。

缺點：，不同的糖類與蒽酮試劑的顯色深度不同，果糖顯色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖較淺，五碳糖顯色更淺。

綜合比較；採用蒽酮法能將最為准確地測定尾水中糖的含量。

（一） 直接滴定法

Ⅰ、原理

v 一定量的鹼性酒石酸銅甲、乙液等量混合，立即生成天藍色的氫氧化銅沉澱，這種沉澱很快與酒石酸鈉反應，生成深藍色的可溶性酒石酸鉀鈉銅絡合物。在加熱條件下，以次甲基藍作為指示劑，用標液滴定，樣液中的還原糖與酒石酸鉀鈉銅反應，生成紅色的氧化亞銅沉澱，待二價銅全部被還原後，稍過量的還原糖把次甲基藍還原，溶液由藍色變為無色，即為滴定終點。根據樣液消耗量可計算出還原糖含量。
樣品經除去蛋白質後，在加熱條件下，以次甲基藍做指示劑，滴定標定過的鹼性酒石酸銅溶液（用還原糖標准溶液標定鹼性酒石酸銅溶液），根據樣品溶液消耗體積計算還原糖量。

Ⅱ、儀器和試劑
1．儀器
酸式滴定管，可調電爐（帶石棉板），250ml容量瓶。
2．試劑

1. 鹽酸。

2. 鹼性酒石酸銅甲液：稱取15g硫酸銅（CuSO4·5H2O）及0.05g次甲基藍，溶於水中並稀釋至1000mL。

3. 鹼性酒石酸銅乙液：稱取50g酒石酸鉀鈉與75g氫氧化鈉，溶於水中，再加入4g亞鐵氰化鉀，完全溶解後，用水稀釋至1000 ml，貯存於橡膠塞玻璃瓶內。

4. 乙酸鋅溶液：稱取21.9 g乙酸鋅，加3ml冰乙酸，加水溶解並稀釋至100ml。

5. 亞鐵氰化鉀溶液：稱取10.6g亞鐵氰化鉀，用水溶解並稀釋至100ml。

6. 葡萄糖標准溶液：准確稱取1.0000g經過96℃±2℃乾燥2h的純葡萄糖，加水溶解後加入5ml鹽酸，並以水稀釋至1000L。此溶液相當於1mg/ml葡萄糖（註：加鹽酸的目的是防腐，標准溶液也可用飽和苯甲酸溶液配製）。

7. 果糖標准溶液：按⑹操作，配製每毫升標准溶液相當於1mg的果糖。

8. 乳糖標准溶液：按⑹操作，配製每毫升標准溶液相當於1mg的乳糖。

9. 轉化糖標准溶液：准確稱取1.0526g純蔗糖，用100ml水溶解，置於具塞三角瓶中加5ml鹽酸（1+1），在68℃~70℃水浴中加熱15min，放置至室溫定容至1000ml，每ml標准溶液相當於1.0mg轉化糖。

Ⅲ、實驗步驟
1．樣品處理
⑴ 乳類、乳製品及含蛋白質的食品：稱取約2.50～5.00g固體樣品（吸取25～50ml液體樣品），置於250 ml容量瓶中，加50 ml水，搖勻。邊搖邊慢慢加入5ml乙酸鋅溶液及5ml亞鐵氫化鉀溶液，加水至刻度，混勻。靜置30 min，用乾燥濾紙過濾，棄去初濾液，濾液備用。（注意：乙酸鋅可去除蛋白質、鞣質、樹脂等，使它們形成沉澱，經過濾除去。如果鈣離子過多時，易與葡萄糖、果糖生成絡合物，使滴定速度緩慢；從而結果偏低，可向樣品中加入草酸粉，與鈣結合，形成沉澱並過濾。）

⑵ 酒精性飲料：吸取100ml樣品，置於蒸發皿中，用1 mol/L氫氧化鈉溶液中和至中性，在水浴上蒸發至原體積1/4後，移入250ml容量瓶中，加水至刻度。

⑶ 含多量澱粉的食品：稱取10.00～20.00g樣品，置於250ml容量瓶中，加200ml水，在45℃水浴中加熱1h，並時時振搖（注意：此步驟是使還原糖溶於水中，切忌溫度過高，因為澱粉在高溫條件下可糊化、水解，影響檢測結果。）。冷後加水至刻度，混勻，靜置，沉澱。吸取200ml上清液於另一250ml容量瓶中，慢慢加入5ml乙酸鋅溶液及5ml亞鐵氫化鉀溶液，加水至刻度，混勻，沉澱，靜置30 min，用乾燥濾紙過濾，棄去初濾液，濾液備用。

⑷ 汽水等含有二氧化碳的飲料：吸取100ml樣品置於蒸發皿中，在水浴上除去二氧化碳後，移入250ml容量瓶中，並用水洗滌蒸發皿，洗液並入容量瓶中，再加水至刻度，混勻後備用。（注意：樣品中稀釋的還原糖最終濃度應接近於葡萄糖標准液的濃度。）

2. 標定鹼性酒石酸銅溶液：吸取5.0ml鹼性酒石酸銅甲液及5.0ml乙液，置於150ml錐形瓶中（注意：甲液與乙液混合可生成氧化亞銅沉澱，應將甲液加入乙液，使開始生成的氧化亞銅沉澱重溶），加水10 ml，加入玻璃珠2粒，從滴定管滴加約9 ml葡萄糖標准溶液或其他還原糖標准溶液，直至溶液蘭色剛好褪去為終點，記錄消耗的葡萄糖標准溶液或其他還原糖標准溶液總體積，平行操作三份，取其平均值，計算每10 ml（甲、乙液各5 ml）鹼性酒石酸銅溶液相當於葡萄糖的質量或其他還原糖的質量（mg）。（注意：還原的次甲基藍易被空氣中的氧氧化，恢復成原來的藍色，所以滴定過程中必須保持溶液成沸騰狀態，並且避免滴定時間過長。）

3. 樣品溶液預測：吸取5.0 ml鹼性酒石酸銅甲液及5.0 ml乙液，置於150 ml錐形瓶中，加水10 ml，加入玻璃珠2粒，控制在2 min內加熱至沸，趁沸以先快後慢的速度，從滴定管中滴加樣品溶液，並保持溶液沸騰狀態，待溶液顏色變淺時，以每兩秒1滴的速度滴定，直至溶液藍色褪去，出現亮黃色為終點。如果樣品液顏色較深，滴定終點則為蘭色褪去出現明亮顏色（如亮紅），記錄消耗樣液的總體積。（注意：如果滴定液的顏色變淺後復又變深，說明滴定過量，需重新滴定。） 當試樣溶液中還原糖濃度過高時應適當稀釋，再進行正式測定，使每次滴定消耗試樣溶液的體積控制在與標定鹼性酒石酸酮溶液時所消耗的還原糖標准溶液的體積相近，約在10ml左右。當濃度過低時則採取直接加入10ml樣品溶液，免去加水10ml，再用還原糖標准溶液滴定至終點，記錄消耗的體積與標定時消耗的還原糖標准溶液體積之差相當於10ml試樣溶液中所含還原糖的量。

4. 樣品溶液測定：吸取5.0 ml鹼性酒石酸銅甲液及5.0 ml乙液，置於150 ml錐形瓶中，加水10 ml，加入玻璃珠2粒，在2 min內加熱至沸，快速從滴定管中滴加比預測體積少1 ml的樣品溶液，然後趁沸繼續以每兩秒1滴的速度滴定直至終點。記錄消耗樣液的總體積，同法平行操作兩至三份，得出平均消耗體積。

5. 計算
樣品中還原糖的含量（以某種還原糖計）按下式計算。
X=〔A/(m×V/250×1000)〕×100
式中：X--樣品中還原糖的含量(以某種還原糖計)，單位 g/100g；
A—鹼性酒石酸銅溶液（甲、乙液各半）相當於某種還原糖的質量，單位 mg；
m--樣品質量，單位 g；
V--測定時平均消耗樣品溶液的體積，單位 ml；
計算結果保留小數點後一位。

注意：

滴定結束，錐形瓶離開熱源後，由於空氣中氧的氧化，使溶液又重新變藍，此時不應再滴定。

（二）高錳酸鉀滴定法

v 原理 將樣液與一定量過量的鹼性酒石酸銅溶液反應，還原糖將二價銅還原為氧化亞銅，經過濾，得到氧化亞銅沉澱，加入過量的酸性硫酸鐵溶液將其氧化溶解，而三價鐵鹽被定量地還原為亞鐵鹽，用高錳酸鉀標准溶液滴定所生成的亞鐵鹽，根據高錳酸鉀溶液消耗量可計算出氧化亞銅的量，再從檢索表中查出氧化亞銅量相當的還原糖量，即可計算出樣品中還原糖含量。

（三）硫酸苯酚法

Ⅰ、原理

糖在濃硫酸作用下，脫水形成的糠醛和羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物，在10-100mg范圍內其顏色深淺與糖的含量成正比，且在485nm波長下有最大吸收峰，故可用比色法在此波長下測定。苯酚法可用於甲基化的糖、戊糖和多聚糖的測定，方法簡單，靈敏度高，實驗時基本不受蛋白質存在的影響，並且產生的顏色穩定160min以上。

多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，並迅速脫水生成糖醛衍生物，然後與苯酚生成橙黃色化合物。再以比色法測定。

Ⅱ、試劑

1． 濃硫酸：分析純，95.5%

2． 80%苯酚：80克苯酚（分析純重蒸餾試劑）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光長期儲存。

3． 6%苯酚：臨用前以80%苯酚配製。（每次測定均需現配）

4． 標准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）,或分析純葡萄糖。

5． 15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中長期儲存。

6． 5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中長期儲存。

7． 6mol/L 氫氧化鈉：120克分析純氫氧化鈉溶於500ml水。

8． 6mol/L 鹽酸

Ⅲ、操作。

1．製作標准曲線：准確稱取標准葡聚糖（或葡萄糖）20mg於500ml容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸餾水補至2.0ml，然後加入6%苯酚1.0ml及濃硫酸5.0ml,搖勻冷卻，室溫放置20分鍾以後於490nm測光密度，以2.0ml水按同樣顯色操作為空白，橫坐標為多糖微克數，縱坐標為光密度值，得標准曲線。

2．樣品含量測定：

①取樣品1克（濕樣）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少許5％TCA溶液研磨，倒上清液於10毫升離心管中，再加少許5％TCA溶液研磨，倒上清液，重復3次。最後一次將殘渣一起到入離心管。注意：總的溶液不要超出10毫升。（既不要超出離心管的容量）。

②離心，轉速3000轉/分鍾，共三次。第一次15分鍾，取上清液。後兩次各5分鍾取上清液到25毫升錐形比色管中。最後濾液保持18毫升左右。（測肝胰腺樣品時，每次取上清液時應過濾。因為其脂肪含量大容易夾帶殘渣。）

③水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 鹽酸之後搖勻，在96℃水浴鍋中水浴2小時。

④定容取樣。水浴後，用流水冷卻後加入2毫升6mol/L 氫氧化鈉搖勻。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2 ml的樣品液，以蒸餾補至2.0ml，然後加入6%苯酚1.0ml及濃硫酸5.0ml,搖勻冷卻室溫放置20分鍾以後於490nm測光密度。每次測定取雙樣對照。以標准曲線計算多糖含量。

Ⅳ、注意

（1）此法簡單、快速、靈敏、重復性好，對每種糖僅製作一條標准曲線，顏色持久。

（2）製作標准線宜用相應的標准多糖，如用葡萄糖，應以校正系數0.9校正μg數。

（3）對雜多糖，分析結果可根據各單糖的組成比及主要組分單糖的標准曲線的校正系數加以校正計算。

（4）測定時根據光密度值確定取樣的量。光密度值最好在0.1——0.3之間。比如：小於0.1之下可以考慮取樣品時取2克，仍取0.2ml樣品液，如大於0.3可以減半取0.1ml的樣品液測定。

（四）蒽酮法

Ⅰ、實驗原理

糖在濃硫酸作用下，可經脫水反應生成糠醛和羥甲基糠醛，生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反應生成藍綠色糠醛衍生物，在一定范圍內，顏色的深淺與糖的含量成正比，故可用於糖的測定。

該法的特點是幾乎可以測定所有的碳水化合物，不但可以測定戊糖和己糖，而且可以測所有的寡糖類和多糖類，其中包括澱粉、纖維素等（因反應液中的濃硫酸可以把多糖水解成單糖而發生反應。所以，用蒽酮法測出的碳水化合物含量，實際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。在沒有必要細致劃分各種碳水化合物的情況下，用蒽酮法可以一次測出總量。此外，不同的糖類與蒽酮試劑的顯色深度不同，果糖顯色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖較淺，五碳糖顯色更淺。故測定糖的混合物時，常因不同糖類的比例不同造成誤差，但測定單一糖類時，則可避免此種誤差。

Ⅱ、試劑：

蒽酮試劑，0.20 g蒽酮溶入100 mL 95%濃硫酸中，冰箱保存；

Ⅲ、方法：

樣品2.0 mL加5.0 mL蒽酮試劑，混勻，然後水浴煮沸10 min，取出冷卻至室溫，在620 nm處測定其吸光度，根據標准曲線計算水樣中糖的濃度。（標線以葡萄糖為標樣）

㈦ 植物組織中糖的測定方法有很多種,舉例說明他們的原理和優缺點

有許多不同的分析技術用於糖的分離和測定,包括化學分析、比色分析、紙色譜、薄層色譜、氣相色譜和高效液相色譜等。本文總結了近十年植物組織中糖類化合物的研究進展，為其含量測定提供理論依據。

1 分光光度分析法

分光光度法是基於長鏈多糖在水溶液中離解後可與染料等陽離子相互結合發生反應，從而引起染料吸收光譜的變化進行測定。這種方法具有較好的選擇性，可以用於實際樣品的測定，通常有兩種常見方法。

1.1 蒽酮 - 硫酸比色法

糖在濃硫酸作用下，可經脫水反應生成糖醛或羥甲基糠醛，生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反應生成藍綠色糠醛衍生物，在一定范圍內，顏色的深淺與糖的含量成正比，故可用於糖的定量。糖類與蒽酮反應生成的有色物質，在可見光區的吸收峰為 630 nm，可在此波長下進行比色。該法的特點是幾乎可以測定所有的碳水化合物，不但可以測定戊糖和己糖而且可以測寡糖和多糖，在沒有必要細致劃分各種碳水化合物的情況下，用蒽酮法可以一次測出總量。蒽酮比色法是一種快速而簡便的定糖方法，但測定結果誤差較大，只能測定樣品中可溶性糖總量。陳鴻英等人用蒽酮硫酸法測定淫羊藿多糖的含量，得到的結果較穩定。

1.2 苯酚 - 硫酸比色法

植物體內的糖主要是指能溶於水及乙醇的單糖和寡聚糖。苯酚法測定糖的原理是在濃硫酸作用下，糖脫水生成的糠醛或羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物，在10mg～100 mg 范圍內其顏色深淺與糖的含量成正比，且在485 nm 波長下有最大吸收峰，故可用比色法在此波長下測定。苯酚法可用於甲基化的糖、戊糖和多聚糖的測定，方法簡單，試劑便宜，靈敏度高，實驗時基本不受蛋白質存在的影響，並且產生的顏色可穩定 160 min 以上。

2 氣相色譜法

氣相色譜法是以氣體作為流動相的一種色譜分析方法氣相色譜法測定糖類，具有選擇性好、樣品用量少、解析度高、快速准確、靈敏等優點。曾昭睿採用三 - 端烯丙基 - 不對稱二苯並 14- 冠 - 4- 二羥基冠醚做固定相分離了鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的乙酸酯衍生物。吳建元等人利用氣相色譜法分析茯苓多糖的單糖組成結果 6 種標准單糖的衍生物實現了良好的分離並具有良好的峰形。胡磊等人用 1 一甲基咪唑為溶劑和催化劑、鹽酸羥胺和乙酸酐為肟化和乙醯化試劑，對植物樣品中糖與糖醇進行乙醯化衍生化利用氣相色譜分離和質譜鑒定的分析方法。

3 高效毛細管電泳法

除了少數帶有羧基和磺酸基的糖類化合物，絕大多數糖類化合物不帶電荷，極性很大且沒有發色基團。所以用一般的高效毛細管電泳系統無法得到分離和檢測。為了使糖類化合物能產生電遷移而得以相互分離，可採用的方法有：（1）衍生化使之帶上發色、熒光基團或電荷；（2）與硼酸鹽等絡合；（3）與緩沖液中的添加劑形成包合配合物；（4）高 pH緩沖條件下使之電離；（5）加入表面活性劑使形成膠束。20世紀 90 年代以來毛細管電泳因具備分離快速，所需樣品量少和自動化程度高的特點，已廣泛應用於糖化合物的分析。

4 高效液相色譜法

HPLC 用於糖的定性和定量分析具有快速、靈敏、樣品處理簡單等優點。從大量的文獻報道和綜述中可以看出，由於糖的特殊結構及它本身不含強紫外和熒光吸收的官能團，到目前為止還沒有建立一個統一的方法來分析所有的單糖和低聚糖。分析糖的色譜柱有化合鍵合烷基柱、陰陽離子交換柱、氨基鍵合硅膠柱和硅膠柱等。

文獻來源：孫艷濤，由欣. 植物組織中糖化合物測定方法的研究進展.科教文匯(上旬刊). 2011,10(上旬刊) ：134-135.網頁鏈接