異位表達FXN蛋白的方法步驟

㈠ 角蛋白19片段偏高結果是5.59而正常值是3.35而NSE結果正常，CEA結果正常，TSGF正常。

腫瘤標志物可追溯至1848年，本周（本斯 - 瓊斯）的蛋白質，實驗室多發性骨髓瘤診斷的基礎上，。 1964年至1965發現甲胎蛋白（AFP），癌胚抗原（CEA），腫瘤標志物在臨床的應用范圍廣泛。細胞雜交，成立於1975年，制備的單克隆抗體，建立了一系列的特異性腫瘤標志物。在1976年，原癌基因的發現，腫瘤標志物，從分子水平上升到基因水平。但事實並非如此，直到1978年，正式提出概念的腫瘤標志物（腫瘤標志物），在1979年被世界公認的Herberman。腫瘤標志物和腫瘤的診斷，判斷腫瘤預後和治療效果，以及檢測腫瘤的復發和轉移，具有重要的臨床價值。根據其來源和分布，通常分為5組：①原位腫瘤標志物;②異位腫瘤標志物;③胎盤和胎兒的腫瘤標志物;④病毒的腫瘤標志物;⑤基因抗癌基因及其產物的。其中第①至④組的腫瘤基因表型標記，部分⑤組的腫瘤基因標記。當細胞癌變，臨床腫瘤進展和演變，腫瘤標記可以用作一個臨床診斷和鑒別診斷的指標來判斷復發的療效和檢測。這些標記有助於早期診斷，基因突變和表達異常的腫瘤標志物反映了細胞在癌前病變的啟動階段，並有助於早期診斷的臨床監測。現代腫瘤標志物對肺癌，缺乏特異性，但結合臨床診斷為肺癌，預後，治療效果，後續的測試仍然是一個很大的作用。

癌胚抗原

癌胚抗原（CEA）於1965年由加拿大醫生真金鑲首次發現，隨後不斷純化，是目前臨床應用廣泛，可使用所有的生產和分泌的CEA和輸入部分的身體的流體和在各種腫瘤，如結腸，直腸癌，肺癌，胰腺癌，在病人的血清，血漿，和在各種體液中的血液循環，可以是檢測CEA升高。 CEA確定，幫助輔助診斷，預後和療效的測試，但有一個較高的假陽性和假陰性。

CEA是一種糖蛋白復合物，結構，分子量為20×104，在除了含有癌抗原特定行列式，也有各種各樣的非特異性抗原的健康人體一致共同的抗原表位。因此，臨床CEA多克隆抗體（多抗）和CEA的單克隆抗體（mAb），而後者則是更具體的。

法測定多抗肺癌患者SCEA陽性率之間的不同病理類型，其次是小細胞癌，鱗狀細胞癌腺癌更高。這種差異可能是有關的肺癌細胞的分化程度，並且也可能與使用的抗體的特異性。

不同的CEA抗原表位，CEA試劑盒由不同廠家，不同腫瘤和不同類型的肺癌陽性率也有較大的差異。如果它們可以識別不同的CEA抗原表位，該制劑不為更高的特異性不同的腫瘤，或不同類型的，肺癌CEA試劑盒可以進一步提高檢測的陽性率和特異性。

SCEA檢測陽性率與病期肺癌患者有密切的關系，有顯著的差異，科檢測病情變化，3倍以上，比正常的時候發現，將預示著可能全身性轉移。在肺癌手術的患者術後可升高短期SCEA普遍下降約兩個月恢復，如長期下降或繼續上升，應考慮轉移可能。

CEA放射免疫分析法和酶聯免疫吸附試驗檢測方法。

β2微球蛋白

升高β2微球蛋白在各種全身性疾病的血液和固體惡性腫瘤，和為負與CEA有關。 18％至21％的肺癌患者中的陽性率與血清β2-微球蛋白，歐洲，日本53.5％至90％。

同時檢測與CEA，兩者是相輔相成的，更多的患者能夠積極的跡象，而且更有利於預後。肺癌初診或復發的患者SCEA腺癌的陽性率最高，其次是鱗狀細胞癌，小細胞肺癌，腺鱗狀細胞癌，鱗狀細胞癌，腺癌，小細胞肺癌，其次β2-微球蛋白陽性率。 SCEA的測量值？並隨著疾病的進展，與控制的疾病，可以降低或正常β2微球蛋白相反的結果。

的SCEA濃度和肺癌患者的預後密切相關的特異性較高，但陽性率較低，特別是在早期階段的肺癌，尤其是β2微球蛋白陽性率是較高的，但也比較高的假陽性。兩者的結合可以相得益彰，很容易找到更多的腫瘤標志物陽性患者，這將有助於發現病情變化，並確定合理的化療間歇期更有利於早期發現腫瘤的復發，並容易抓住的機會檢查和治療。

鐵

鐵（鐵）是流行在人體內的鐵儲備鐵的儲存和代謝的蛋白質發揮了重要作用。今年以來，隨著肺癌腫瘤標記物科的診斷和預後檢測。然血清鐵蛋白是不特定的腫瘤標志物，在肺部疾病的鑒別診斷意義並不大，但它不會有助於肺癌的早期診斷，但發展到檢測肺部疾病，腫瘤的復發和轉移的潮起潮落仍然有一定的臨床價值。

在肺癌患者，約1/3的患者增加鐵蛋白，仍然未知的原因，一般認為，合成和分泌鐵蛋白的異常的腫瘤細胞的能力也可伴有與腫瘤細胞本身壞死，與化療或放療導致的組織損傷和細胞的破壞，從而在鐵蛋白的釋放增加胞漿內，和肝功能降低間隙有關的損傷鐵蛋白。

鐵蛋白還可以作為胸水和良性或惡性的鑒別診斷的一個很好的指標，胸腔積液及血清鐵蛋白濃度> 500ng/ml，應懷疑有惡變;> 1000ng/ml，幫助惡性確立診斷，其敏感性為76％，特異性94％，陽性診斷准確率91％，陰性診斷准確率為83％。

鐵決心積液，沒有同時測定血清鐵蛋白或胸腔積液，血清鐵蛋白的比例。

四，神經元特異性烯醇化酶

神經元特異性烯醇化酶（NSE），神經元特異性烯醇化酶，神經母細胞瘤的腫瘤標志物，小細胞肺癌是最常見的表現神經內分泌腫瘤的性質，NSE也是使SCLC最敏感和最具體的腫瘤標志物。近年來，NSE作為神經元損傷的敏感性和特異性標志物的中樞神經系統疾病的關系已引起了國內外學者的極大關注。

1，

的NSE生化性質甘油的最終分解酶的催化糖酵解途徑。三個獨立的基因片段編碼不同的亞基，α，β，和γ的免疫學性質的由3種，組合物中的五種形式的同工酶αα，ββ，γγ和αγ，βγ。二聚體是酶分子的活性形式，γ亞基同工酶存在於神經元和神經內分泌細胞的細胞質中，稱為NSE。位於在神經膠質細胞中的α亞基同工酶，相同的結構和免疫學特性的肝烯醇化酶，稱為神經元特異性烯醇化酶（NNE）; NSE和NNE分子量為78kD和87kD。

2，正常價值的確定方法

烯醇化酶兩類，一類酶酶活性測定，含量測定方法。活動的直接分光光度法酶偶聯速率法，生物發光和瓊脂糖凝膠電泳法，測定酶免疫組織化學方法檢測。

NSE的最常用的方法RIA和ELISA，RIA放射性污染，ELISA RIA缺乏和高靈敏度的測定。國內不受限制的ABC-ELISA靈敏度2ng/ml;科學院，軍事醫學科學院，建立了ELISA檢測試劑盒，靈敏度為1ng/ml，操作方便，重復性好。國外學者報道，近日通過時間分辨熒光免疫分析血清NSE，其重現性好，靈敏度，特異性和RIA方法是一致的，相關系數為0.99，女性的正常參考值范圍為2.9?9.6μg/ L，男性和3.4?11.7μg/ L，顯著的性別差異（P <0.001）。 NSE測定值不同的方法有一定差異，在一般情況下，以下10ng/ml的健康成人血清NSE水平是正常的。

3，臨床意義

神經母細胞瘤和小細胞肺癌的NSE標記。神經母細胞瘤是一種常見的兒童癌症，佔1至14歲兒童腫瘤的8％至10％。 NSE作為神經母細胞瘤的標志物，在疾病的早期診斷具有較高的臨床應用價值。神經母細胞瘤患者尿中NSE一定的升高血清NSE水平正常，治療後。測定血清NSE水平監測療效和復發，更有意義的比測定尿中兒茶酚胺代謝產物的預測是一個重要的參考價值。小細胞肺癌（SCLC）是一種高度惡性的神經內分泌腫瘤，肺癌占約25％至30％。它可能會顯示神經內分泌細胞，過度表達的NSE，超過5至10倍，高於其他肺癌和正常對照組的特性。小細胞肺癌患者血清NSE陽性檢出率可高達65％至100％，並已被確認為SCLC高特異性的NSE，腫瘤標志物的敏感性據報道，NSE水平與SCLC轉移;獨立轉移的部位，也具有良好的相關性之間的NSE水平及對治療的反應。

五，細胞角蛋白

細胞角蛋白的細胞體的中間絲，可根據其分子量和雙向二維電泳分等電點，在正常細胞中，腫瘤細胞，在細胞培養中的20種不同的類型，不同的上皮細胞的分化。細胞角蛋白19片段（CYFRA21-1），組織多肽抗原（TPA），組織多肽特異性抗原（TPS）是細胞角蛋白的標記。

1，CYFRA21-1

尤其是豐富的內容，特別是在肺CYFRA21-1濃度在非小細胞肺癌患者的血清和胸腔積液的敏感性隨病情進展而越高肺癌分期呈正相關，靈敏度也較高，靈敏??度為50％至70％的鱗狀細胞癌，腺癌30％至50％，從20％到50％的小細胞肺癌。 CYFRA21-1與放療，化療和臨床反應良好的相關性之間的有效化療的患者中，血清CYFRA21-1水平將顯著減少，血葯濃度在肺手術後也減少了，而且是密切相關的生存的肺癌患者血清CYFRA21-1水平較高，預後較差，尤其是，可以用於肺鱗癌細胞的生存和復發的獨立預後因素。的CYFRA21-1，支氣管肺泡灌洗液中水平，不能被用來識別惡性肺部疾病的量的。

2，TPA

角蛋白8,18,19片段的一部分，它的表達反映了細胞的增生。 TPA是一個腫瘤細胞的增殖可以識別特定的版本的TPA M3抗原單克隆抗體確定的決定巢。該TPA與肺癌的靈敏度為30％至60％，特異性為65％至90％的患者的血清中檢測到。 TPA的臨床療效和臨床分期密切相關的進展與TNM分期，TPA水平指示的腫瘤無復發，但做的組織類型無關，是不敏感的SCLC。

3在非小細胞肺癌患者血清TPS

TPS檢測的敏感性36％，特異性為90％。 TPS非小細胞肺癌患者的淋巴結轉移和疾病的不斷進步化療的患者，血清中顯著較高。 TPS是預後的重要因素之一，高水平的那些壽命短租者置其屋計劃的患者在治療前，可能表明不敏感的化療和預後不良。

六，鱗狀細胞癌的細胞抗原

鱗狀細胞癌抗原（SCC-Ag）的，從子宮組織中提取的一種糖蛋白，由江東區1977年各種鱗狀細胞癌具有不同的特異性和靈敏度。

肺鱗狀細胞癌，鱗狀細胞癌抗原敏感度為33％至78％，特異性為89％?100％，但其他類型的肺癌的臨床意義。最初的鱗狀細胞癌抗原水平肺鱗狀細胞癌血清SCC-Ag和肺部疾病期間呈正相關，與腫瘤的擴散和轉移，提高III-B，IV肺鱗狀細胞癌患者顯著高於Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ一個患者，患者的生存期密切相關，可作為指標來確定的肺鱗狀細胞癌的預後和疾病進展的檢測。

7

糖類抗原碳水化合物抗原（CA）是一個系列的腫瘤相關抗原，大分子細胞膜上的糖蛋白，主要CA19.9，CA50， CA125。

CA19.9，CA50檢測肺癌的敏感性為44％，51％，67％，特異性為69％。治療前CA19.9和疾病分期呈正相關，但與預後無關，約1/5的患者在治療後CA19.9下降。遠處轉移的肺癌患者中，血清CA50高於無轉移者。

CA125是最重要的卵巢癌胚抗原，CA125水平與TNM分期呈正相關，肺癌患者中，血清CA125高於中晚期患者，其生存期短於正常的可能性增加復發，獨自一人非小細胞肺癌的預後提示。

8個基因診斷肺癌

20世紀的發展，生物醫學的深入了解生命現象的重要特徵之一，逐漸向微觀分子水平上。在21世紀，基因和基因診斷已不再是「神秘的」東西。

1，基因診斷

利用現代分子生物學和分子遺傳學在基因水平上，直接的生活問題和缺陷，存在的基因檢測遺傳結構的表達功能是否異常，這使診斷的疾病（癌症）或人類狀態。

基因診斷的實驗技術和檢測方法：通過免疫組化的蛋白水平，免疫印跡凝膠電泳，PCR，PCR-SSCP，在DNA水平上的序列分析，原位雜交，南現代雜交凝膠電泳，RT-PCR，原位雜交，Northern雜交，在RNA水平等。

分子生物學，基因診斷肺癌肺癌的發生和發展是一個遺傳易感因素占重要地位，涉及一系列基因（癌基因異常變化的復雜的過程和/或腫瘤抑制基因）。在正常細胞對腫瘤細胞的惡性轉化過程的啟動階段，促進階段進度的演變階段，都涉及到激活的癌基因突變，擴增和過度表達;失活的腫瘤抑制基因的功能障礙（主要是損失住方式的缺失，點突變和甲基化），有些茫然的染色體片段，導致細胞動力學的正常發展周期紊亂，細胞增殖失控無限增長的癌症的形成和惡性轉化。分子事件的發展，肺癌的基因進行檢測和分析，特別是對抑癌基因p16，Rb的研究可以建立一個理想的早期診斷肺癌的分子生物學檢測指標。

①癌基因

與肺癌基因myc基因家族（C-myc和N-??myc和L-myc基因），ras基因家族（K-ras基因，H- ras基因，N-ras基因）和Her-2/neu的基因，簡單的突變基因在腫瘤的形成過程中的模板是佔主導地位的癌基因，突變蛋白可以啟動細胞增殖信號，引起細胞無限繁殖。

Myc家族幾乎所有的小細胞肺癌和非小細胞肺癌的發生; ras基因家族基因突變與預後不良相關，密碼子的突變在特定部位的活動。產品p21和細胞生長的G蛋白通過不斷的有絲分裂信號，導致細胞增殖不斷ras基因突變的肺癌患者高於無變異生存期縮短;特異性HER-2/neu基因編碼的酪氨酸激酶跨膜電位P185中p185蛋白表達在非小細胞肺癌，啟動細胞的生長和分化更糟糕的信號，細胞分化，陽性率較高的中p185高表達的基因的侵襲和轉移的肺癌和多重耐葯性的基因（特別是肺腺癌）。

肺癌的癌基因：C-MYB，C-fos基因和bcl-2，C-erbB2的。

②腫瘤抑制基因

與肺癌腫瘤抑制基因p16和Rb，p53基因突變兩個模板，腫瘤會發生。

研究發現，p53基因缺失或點突變的p16基因在人類腫瘤的發生發展，可作為早期火災事件，提供了理論依據肺癌的早期診斷。 RB是首次分離出腫瘤抑制基因，其編碼產物在細胞周期調控中發揮了重要的作用。 P16在大多數腫瘤抑癌基因失活的最新發現和克隆的存在。

分子病理學的角度來看，肺癌的發生發展過程中的第一3P等位基因丟失，那麼9P區基因突變（p16基因在染色體9p21區域明確），最後的p53基因ras基因改變。

非小細胞肺癌，缺失p16，Rb基因缺失的70％?80％的只有22％;小細胞肺癌的Rb缺失突變在95％以上，表明p16基因起著極其重要的發展肺癌的作用，P16，Rb基因不僅可以被用於肺癌的早期診斷檢測指標，也可以作為小細胞肺癌和非小細胞肺癌的分型早期診斷的重要依據。

我們都知道，任何腫瘤的早期診斷不能完全依賴單一的，各種診斷方法必須相輔相成。這兩種腫瘤標志物與肺癌的基因，不能是一個單一的完全證實了腫瘤，必須緊密結合臨床，以作出早期診斷，分型，分級，分期，採取合理適當的治療方法，治療效果，預後，轉移潛在的預測。

㈡ 關於植物雙受精過程的概述

        這次介紹的是整個雙受精過程的簡介，是最最原始的初稿，文字啰嗦，圖不對文，我在我讀研的這幾年內想把整個受精過程參與的因子都盡可能完善，歡迎各位讀者及時補充交流。

        雙受精主要是被子植物（當然裸子植物麻黃屬和買麻藤屬也存在）特有的生殖方式，其過程主要是成熟的花粉粒落在柱頭上水合萌發形成花粉管，花粉管穿過引導組織，穿過隔膜，進入胚珠後花粉管爆炸釋放出兩個精細胞，其中一個精細胞與卵細胞結合，最後發育成胚（2n），另外一個與中央細胞融合發育形成胚乳（3n）。

       植物生殖過程中演化出了許多獨特的生理機制，例如花粉管的頂端生長（tip growth），在植物生長發育和環境中過程中，有很多種頂端生長的例子，如真菌的菌絲，植物的根毛以及毛狀體，目前花粉管的頂端生長是頂端生長生長最快的一種形式之一，所以以花粉管為模型研究頂端生長是一個很好的方式。目前花粉管生長區別於其他細胞生長有兩個最重要的特點，一是花粉管於頂部向頂端生長，二是通過果膠甲基酯酶（PME，如VANGUARD1）對果膠的去酯化作用會使得頂端新形成的細胞壁沉積物之間產生空間上距離。這種去酯化作用產生的羧基使果膠與其他聚合物形成Ca2 +-鹽橋，從而形成果膠凝膠，有助於使壁硬化。在頂端PME會與PMEI（PME的抑制物）相互作用形成復合物來抑制PME的酶活，隨著頂端不斷向前生長，復合物逐漸解散，使得細胞壁硬化。此外花粉管細胞壁還具備許多多糖以及不同的修飾形式，如乙醯化，硼酸二酯交聯，岩藻糖基化木葡聚糖的分泌以及纖維素和胼胝質的局部合成。

        其中分泌蛋白 LRXs（leucine-rich repeat extensins）可能參與了花粉管細胞壁和膜結構的修飾， LRX8, 9, 10, 11這四個蛋白mRNA在花粉中的表達量極其高。 lrx  突變體顯示花粉管處存在纖維素和胼胝質的不正常積累，且四突雄配子體的傳遞率下降了六倍。如果在 lrx  突變體中添加Ca+能部分抑制突變體的表型，暗示著LRX可能通過Ca信號才調控下游過程。此外LRX8以及其他三個LRX可以和小肽RALF4/19（rapid alkalinization factor 4/19)相互作用來調控ANXUR1 (ANX1) 和ANX2使得花粉管的爆炸。其中有一個有趣的問題是，花粉細胞分泌多種水解酶，其可能降解花粉管或周圍雌蕊細胞的細胞壁並產生DAMP(damage-associated molecular patterns)，那麼植物是如何區別這兩者從而保護正常的生殖過程的呢？

       此外， ROPs（Rho GTPases from plants）以及其下游的效應因子作為主要調控者調控了細胞極性生長，同樣參與花粉管頂端生長極性的建立。ROPs家族共有11個成員,其中ROP1主要調控了花粉管的的頂端生長，當ROPs結合GTP時，會變成激活構像，當GTP水解成為GDP時，會變成非激活的構像。GDP到GTP的轉化是被GEF(guanine nucleotide exchange factor）催化。激活狀態下的ROP–GTP能夠與一系列的效應因子相互作用，但是僅僅只有一小部分被鑒定出來，因為ROP固有的GTP酶活性會將GTP轉化成GDP，所以與ROP–GTP相互作用的效應因子是非常瞬時的，因此非常難以鑒定。其中ROP–GTP的激活構像持續時間會被GAPs(GTPase-accelerating proteins)縮短從而增加GTP的水解速率，同時ROP-GDP也會與GDIs(GDP-dissociation inhibitors)相互作用，從而使得GDP不會被GEFs催化形成新的GTP。GAPs, GEFs 和 GDIs其活性均可被磷酸化和去磷酸化調節，主要是受 CPKs(Ca2+-dependent protein kinases), MAPKs( mitogen-activated protein kinases)和 RLKs調控。在頂端生長的過程當中RIC4（ROP-interactive CRIB motif–containing protein 4）和RIC起到非常重要的作用，RIC4能夠促進F-肌動蛋白的組裝，而RIC3會刺激Ca2 +濃度瞬變，從而使得F-肌動蛋白的分解。但是目前還不清楚RIC3是否是直接與Ca+通道蛋白相互作用還是與激活了一條新的信號途徑來調控Ca2+。此外，位於ROP-ATP下游的NOX（NADPH oxidase）也起到非常重要的作用，NOX可以產生ROS來調控細胞壁的修飾並且激活新的信號通路，目前認為ROS可以激活一條尚未鑒定出的Ca2+通道，有趣的是NOX還可以被Ca2+ 和 CPKs直接激活，這就可能推測這里存在一條正反饋的機制：ROS誘導的鈣信號反過來調控新的ROS通路，或者可能是以ROS 到 Ca2+ 調控 ROS 再到 Ca2+引發的鈣振盪來調控下游過程。在頂端匯集的細胞質鈣震盪到底是標志著生長周期的開始還是結束呢？這是目前生殖領域比較關心的科學問題之一。但是目前研究發現這種鈣振盪可能需要多個過程協調激活，例如通過離子通道蛋白的Ca2+離子內流或離子泵和離子交換蛋白引起的Ca2+外流，可是在模式植物擬南芥的花粉中至少有潛在的39個基因可以編碼Ca2+通道蛋白，包括 CNGCs(cyclic nucleotide gated channels),GLRs(glutamate-like receptors), MSLs(mechanosensitive-like channels), OSCAs(reced hyperosmolality-inced[Ca2+]i increase channels), 一個Piezo離子通道和膜聯蛋白。目前關於 CNGC18 和 GLRs 的突變體的研究發現這些通道的缺失並不能使得頂端鈣振盪消失，除了Ga2+本身運輸可能會影響頂端Ca2+的聚集之外，還與細胞骨架動態變化相關。此外在擬南芥中至少存在230個花粉特異表達的基因可以與Ca2+結合或者是參與Ca2+的信號通路，例如CBLs(calmolins or calcineurin B–like proteins ),CPKs和CBL-interacting protein kinases，因為CPKs可以磷酸化下游數百個蛋白，所以要理解Ca2+是如何影響頂端生長還是個復雜的問題。在先前的研究中，認為Ca2+的每一次震盪都對一次生長周期至關重要，但是鈣成像實驗顯示，在一次鈣振盪過程中，生長周期已經完成多輪，所以這些觀察結果表明，Ca2+振盪不是生長周期所必需的，Ca2 +振盪可能作為開關間歇地起作用，以重新同步或重啟細胞過程。

第一階段：花粉落在柱頭上，標志著雌雄配子雙方密切的信號交流開始

        當花粉落在柱頭上開始，復雜的信號交流便開始了，首先雌方需要確定花粉是不是合適的（雜種不育或是自交不親和），如果合適才會經過粘附、水合、萌發的步驟形成花粉管。花粉在柱頭上水合的過程是收雌雄雙方的調控的，水合過程中會引起花粉粒內Ca2+的內流，隨後還會引起花粉粒內細胞質的重塑和ROS的累積。目前對於各向同性的花粉粒產生極性生長的花粉管的機制還不是很清楚，可能是細胞質內鈣離子濃度的梯度分布或是RIP1(ROP–interactive partner 1)的定位又或是Exocyst復合體中的SEC3A亞基作用於在花粉管出現的地方。此外，快速水合過程中水進入引起滲透壓的改變為什麼沒有使得花粉粒裂解也是一個重要的問題，例如大腸桿菌能夠通過使用機械敏感性通道釋放滲透物來防止細胞裂解。花粉特異表達的MSL8（mechanosensitive-like channel 8）可能具有相似的功能，水通道蛋白的調控以及鞘脂也在其中發揮作用。

       在乾燥的柱頭，花粉萌發的速度很快，30min即可，但是在體外卻要大於3.5h，這其中花粉上的脂質對於萌發過程至關重要，從柱頭釋放出來來的十氫喹啉衍生物以及油菜素甾醇可以刺激花粉的萌發和花粉管的生長。在對煙草的研究中發現，自噬對於煙草花粉的正常萌發非常重要。在百合中存在chemocyanin鹼性小蛋白，可以在花粉萌發後，指導花粉管導向性生長。除此之外，花粉管的出現還需要突破物理上的阻礙，這就需要有關水解酶的分泌和活躍的信號傳導，其中AtOFT1(OFUCOSYLTRANSFERASE 1)和tod1(turgor regulation defect 1,神經醯胺酶)的突變體顯示穿過柱頭和花柱隔層的能力變弱。

第二階段:花粉管在花柱，引導組織，隔膜的導向性生長

      引導組織具有特化的細胞外基質，是多糖，糖蛋白和糖脂的復雜混合物，被認為可以用來支持花粉管的生長。在有些植物當中花柱，引導組織，隔膜會作為自交不親和發生的地點，但是在擬南芥中主要是為了讓花粉管正常導向完成雙受精。

      目前對於花粉管快速生長依據的原料還不清楚，在煙草中的TTS(TRANSMITTING TRACT–SPECIFIC)蛋白TTS1和TTS2可以在體外刺激花粉管生長，但是TTS在擬南芥的同源物是否能刺激花粉管的生長還未知。GABA 和GABA和d-serine兩個氨基酸分子能夠促進花粉管的生長。外源的GABA能在體外影響花粉管生長，在較低濃度下刺激花粉管生長，在較高濃度下抑制花粉管伸長，柱頭產生的d-serine可能作為花粉管頂端GLRs的激動劑調控Ca2+來促進花粉管在花柱，引導組織和胚珠的生長。花粉管表達的GLR的功能取決於亞細胞定位，而亞細胞定位又由CNIH（CORNICHON HOMOLOG）分子伴侶調節。 但是，d-serine觸發的Ca2+信號傳導的特定功能仍有待確定。據目前的實驗觀察，花粉管粘附在引導組織上對於花粉管的正常生長至關重要，使用體外粘附生物測定法鑒定了百合花粉管粘附所必需的兩個分子。兩者中較大的是果膠而較小的分子是脂質轉移蛋白SCA(stigma/stylar cysteine-rich adhesin)，兩個分子都非常重要，單獨之一並不能重復粘附過程。此外有意思的，如果花粉在體外萌發，最後找到珠孔的能力很弱，但是穿過花柱和引導組織後，找到珠孔的能力大大增加，並且轉錄組數據顯示，穿過花柱和引導組織會使得原先數千個不表達的基因表達。在藍豬耳中，一個胚珠起源的蛋白AMOR(ovular methyl-glucuronosyl arabinogalactan)，能夠使得花粉管穿過體外切割過得花柱來響應胚珠產生的信號。AMOR被鑒定為阿拉伯半乳糖多糖，其末端的4-O-甲基-葡萄糖醛酸殘基是主要的功能部位。

第三部分 珠孔導向

       珠孔導向一般被認為是一個非常理想的模型來理解胞外的信號分子是如何引起胞內的信號轉導途徑。在先前的研究中發現助細胞對於珠孔導向非常重要，進一步深入研究發現位於助細胞上的絲狀器上分泌的小肽信號參與了這個過程。第一個被鑒定出來參與珠孔導向過程的是玉米中的ZmEA1，利用RNAi的技術發現沉默掉ZmEA1後，花粉管不能找到珠孔，並且導致嚴重的育性下降。隨後在藍豬耳里鑒定到一組小肽LUREs能夠吸引花粉管。隨後在擬南芥中也找到了物種特異性的小肽AtLURE1也能參與花粉管的吸引（AtLURE1與LURE1在序列上無相似性，只是功能類似），AtLURE1是一組富含半胱氨酸的防禦素樣的小肽，在對AtLURE1.1–1.5的研究過程中，發現這組小肽特異性的定位在助細胞，蛋白從絲狀器上分泌出來到珠柄。但是五突並沒有產生敗育的表型，隨後通過建樹又找到了兩個與AtLURE1相關的基因並且展現出可以吸引花粉管的功能，並命名為AtLURE1.7，AtLURE1.8。有趣的是七突也沒有明顯的育性下降，暗示著AtLURE1介導的信號通路可能並不是對於植物生殖所必須的。那麼他們的功能又是什麼樣的呢？通過將擬南芥的花粉與另一種與擬南芥親緣關系很近的物種琴葉擬南芥的花粉一起共同授於擬南芥的柱頭上，發現在AtLURE1信號正常的植物中，擬南芥的花粉管被優先吸引，競爭性明顯；而在缺失了AtLURE1信號的 atlure1 突變體植株中，擬南芥的花粉管被優先吸引的能力就顯著降低，這表明AtLURE1的生物學功能主要是促進近緣物種的生殖隔離，為達爾文提出的同種花粉優先的理論提供了分子水平的證明。此外，還有4個在 myb98 突變體中表達下調且無物種特異性的小肽XIUQIUs，在 AtLURE1s 七突的背景下敲除，發現存在20%的育性下降，並且XIUQIUs不僅可以吸引擬南芥的花粉管，還可以吸引其他近緣種如琴葉擬南芥和哈勒氏擬南芥的花粉管。

        在整個珠孔導向的過程中，RLK也發揮著非常重要的功能。 prk6 （pollen receptor kinase 6）突變體在半體外的環境下不能響應AtLURE1.2的信號，PRK共有8個成員，其在番茄中的直系同源的基因已經知道可以通過自分泌和雌性表達的配體來調控花粉管的延伸。 prk6prk3 雙突珠孔附近花粉管生長異常， prk6prk3prk1 花粉管穿過柱頭異常緩慢。此外，還有其他組發現了MDIS1–MIK組成的受體復合物，MDIS1, MIK1和MIK2的胞外域可以與AtLURE1.2互作，但是 MDS1 MIK1 MIK2 的突變體表現出細微的花粉管引導缺陷，但沒有像在prk突變管中觀察到的花粉管延伸的缺陷。那到底誰才是AtLURE1s的受體的呢？接著有報道通過生化和結構的方法，驗證了AtLURE1s與PRK6的互作，但是了重復不出AtLURE1s與MDIS1–MIK的互作，因此很有可能AtLURE1s-PRK6小肽受體復合物介導了擬南芥進緣物種的生殖隔離。還有兩個RLCK LIP1(LOST IN POLLEN TUBE GUIDANCE)和LIP2也被報道能夠響應AtLURE1的信號。但是目前XIUQIUs的受體還沒有發現。

          PRK6可以與ROP–GEF相互作用，暗示著AtLURE1s-PRK6會激活了下游ROP和Ca2+，兩個鉀轉運蛋白chx21和chx23也對珠孔導向的過程非常重要。此外，在珠孔的的過程中值得關注的是，通過情況下，胚珠僅僅吸引一根花粉管，但是如果受精失敗，則會吸引第二根花粉管，暗示著植物里存在某種機制在受精成功後能夠抑制花粉管再次進入受精成功的胚珠，可能與乙烯信號導致的助細胞退化相關。

第四部分 花粉管的接收

        一旦進入胚珠，花粉管會緩慢通過絲狀器最終在助細胞處停止生長爆炸，花粉管的接收是種間雜交的一個重要的合子前障礙，在種間雜交中花粉管不能停止生長並釋放精細胞。

         FER(FERONIA)一個雌方表達的CrRLK1L的成員，其突變體花粉管過度生長，不能正常產生種子。其中FER和LRE（(LORELEI，GPI-anchored membrane protein）的協同作用對於花粉管的接收非常重要，在未受精的胚珠當中，LRE可以起到分子伴侶的作用一起和FER從內質網運送至助細胞的絲狀器上。定位到絲狀器上後，FER和LRE便成為ROP信號復合體的成員，調控ROS的產生，這對於花粉管的接收非常重要，並且FER的胞外域可以與LRE互作，有趣的是，異位在花粉管表達的LRE能夠互補雌方 lre 突變體花粉管接收缺陷的表型，暗示著LRE在花粉管到達助細胞後在信號傳遞中的關鍵作用，且不同於其作為分子伴侶在細胞內作用。當花粉管與助細胞相互存在信號交流後，助細胞內細胞質的Ca2+濃度的改變以及Ca2+的振盪是依賴於FER和LRE。近期發現EN14(GPI-anchored membrane protein)也定位於助細胞的絲狀器上並且可以與FER相互作用。近期，CrRLK1L家族的另外兩個成員HERK1和ANJEA可能與FER形成異源復合物來調控花粉管的接收。NTA是Mildew Resistance Locus O家族的一個跨膜蛋白，FER對於在花粉管到達時NTA在絲狀器上的重新定位是必須，暗示著NTA作用於FER的下游。EVN和TUN分別編碼UDP-糖基轉移酶超家族蛋白和多萜醇激酶，暗示著在助細胞的表達的N-糖基化蛋白能夠在花粉管的接收中起作用。 amc (abstinence by mutual consent)突變體僅僅在雌雄雙方都缺失時才會出現花粉管不能正確接收的表型，這表明花粉管的接收需要雄配子體和雌配子體之間的相互作用，並且兩種配子體共享一套信號傳遞的機制。在對於雄方的研究中發現三個MYB類的轉錄因子MYB97, MYB101和MYB120，這三個轉錄因子在花粉管穿過柱頭後受誘導表達，單突或是雙突都沒有表型，在 myb 三突中，約70%的胚珠都出現花粉管纏繞在雌配子體上，並且無法釋放出精細胞。這三個MYB類的轉錄因子和FER的關系目前還不清楚，並且FER的配體還沒有找到。 

       在助細胞正確接收花粉管後，花粉管將會爆炸釋放出兩個精細胞。玉米中在助細胞表達的類防禦素蛋白ZmES4可以與在花粉管內表達的鉀離子通道KZM1相互作用並且誘導花粉管爆炸。在水稻中，定位於花粉管頂端的RURP(Ruptured Pollen tube)與鉀離子通道HAK1相互作用來調控鉀離子的穩態和花粉管細胞壁完整性。在擬南芥中，一個編碼Ca2+泵的蛋白ACA9如果在花粉管內缺失，則會導致爆炸失敗，但是 aca9 的花粉管能夠正常到達目的地。此外ANX1 ANX2 還有 BUDDHA』S PAPER SEAL 1 (BUPS1) BUPS2組成的受體復合物是維持花粉管細胞壁完整性的重要因子，這四個蛋白都屬於CrRLK1L家族，在花粉管生長時，花粉管內分泌小肽RALF4和RALF19能夠與該受體復合物結合，維持花粉管細胞壁的完整性，當花粉管生長至一定階段時，胚珠分泌的小肽RALF34可以更高的親和力競爭結合該受體復合物，使得花粉管爆炸。此外LLG2(LORELEI-LIKE-GPI ANCHORED PROTEIN）和LLG3可以作為BUPS1/2ANX1/2受體復合物的共受體存在，且在RALF4/19小肽存在的情況下，可以顯著加強LLG2/3與BUPS1/2、ANX1/2受體胞外域之間的相互作用。MARIS屬於RLCK8家族的成員，該突變體也展示花粉管提前爆炸的表型，暗示其也位於RALF4/19-BUPS1/2ANX1/2-LLG2/3的信號通路之中。

第五部分 精卵融合

      隨著花粉管的爆炸，一對物理上聯系的精細胞被釋放出來。但是在正式的精卵融合之前，通過活體成像的實驗，發現精卵細胞在正式融合之前，會存在幾分鍾的停滯，這幾分鍾被認為是雌雄配子信號大量進行交流的時刻確保精卵融合正確進行。基於先前的研究，認為目前在擬南芥配子融合過程總共分為三步，首先是卵細胞分泌的小肽會使精細胞激活，激活後的精細胞會與卵細胞黏附，最後實現融合。

      GEX2(GAMETE EXPRESSED 2)是精細胞特異表達的單次跨膜蛋白，其有一個filamin-repeat的結構域，並且在其他的物種中存在同源基因， gex2  突變體精細胞與卵細胞和中央細胞不能進行正常的粘附過程。突變體雄配子傳遞率較野生型下降1.9倍。目前GEX2在雌方的配體還沒有發現。 hap2(hapless 2) 突變體精細胞不能與卵細胞和中央細胞融合，主要介導了融合的過程。HAP2的同源基因在除了真菌的真核生物中廣泛存在，暗示著該蛋白可能在真核生物有性生殖早期就起到融合的功能。此外，結構的數據顯示，在精卵融合過程中，HAP2功能類似於II類病毒融合蛋白，需要形成蛋白三聚體，將一個兩親性螺旋插入雌方膜中來與卵和中央細胞融合。由於在雄配子發育過程，營養細胞會將生殖細胞吞噬，所以精細胞會有雙層膜的結構，所以外層的膜應該在精細胞膜膜融合之前裂解。此外由於兩個精細胞之前還存在一個連接區域，這個區域應該在融合過程會裂解。EC1(egg cell-specific expressed genes)是一組定位於卵細胞的分泌型小肽，共有五個成員EC1.1-EC1.5,EC1小肽定位於卵細胞囊泡狀的結構中，並且會從其中分泌到卵細胞外，引起精細胞中HAP2定位的改變完成對精細胞激活。利用EC1-RNAi的材料也發現精細胞的粘附過程也受阻，同時兩個精細胞不分離，暗示了EC1功能的多樣性。但是目前為止，EC1分泌的時間還不確定，此外EC1位於精細胞上的受體還未鑒定。近期還鑒定到兩個精細胞定位的四次跨膜蛋白DMP8(DOMAIN OF UNKNOWN FUNCTION 679 membrane protein)和DMP9,並且主要是在融合過程中發揮作用，被認為可能主要起到保證HAP2正確發揮功能。

       在融合過程，一個精細胞和卵細胞融合，一個與中央細胞融合，多精融合的概率也是非常低，暗示同樣存在一種機制來確保精卵的正確融合。在動物中，該過程涉及快速的膜去極化，隨後使得精子與合子隔離開。在植物當中，精卵融合的過程在雌雄配子中都會存在細胞質Ca2+濃度增加的現象，但是這是膜去極化的原因還是結果以及是否是真的用來阻止多精融合的過程，現在還不確定。

       至此被子植物已經從單倍體跨越到了二倍體，如果以上的步驟都順利完成的話，那麼他就有可能長成我們隨處可見的花花草草。

主要參考文獻（簡單先列出文章名字）：

1.A Fruitful Journey: Pollen Tube Navigation from Germination to Fertilization

2.Cysteine-rich peptides: signals for pollen tube guidance, species isolation and beyond

3.Ligands Switch Model for Pollen-Tube Integrity and Burst

4.How CrRLK1L Receptor Complexes Perceive RALF Signals

5.Twice the fun, double the trouble: gamete interactions in flowering plants

㈢ 如何誘導建立耐葯腫瘤細胞株

腫瘤細胞對化療葯物產生耐葯性是造成化療失敗的主要原因，體內外研究發現腫瘤耐葯的分子機制很復雜，包括靶基因突變、靶基因擴增、DNA損傷修復能力差異、葯物進入腫瘤細胞內濃度減少等。本文主要從腫瘤細胞內在的分子異常如原癌基因表達異常、DNA損傷修復基因表達異常及多葯耐葯有關基因表達異常等幾個方面綜述了腫瘤耐葯的一些分子機制進展。 1原癌基因表達異常 許多原癌基因參與調節細胞的增殖與凋亡，這些基因的改變導致分子調節缺陷使細胞惡變，並對生理刺激作出凋亡的反應能力降低，而誘導腫瘤細胞凋亡是化療葯物作用的重要機制。因此抑制癌細胞凋亡的原癌基因表達異常參與了腫瘤細胞的抗葯性，這主要包括P53 、Rb、Bcl 2三種原癌基因。 1.1P53 原癌基因野生型P53 (wtP53 )基因是一種抗癌基因，其產物是核內轉錄因子，作用是參與基因穩定。當細胞受損時wtP53 蛋白表達增高，誘導與DNA修復有關的基因GADD45表達，增加細胞DNA修復能力，同時通過誘導凋亡促進受損細胞死亡。近年認為P53 蛋白也能活化P21 waf 1基因表達，從而抑制細胞周期蛋白激酶復合物如Cyclin D/cdk4、Cyclin D/cdk6及Cyclin E/cdk2的活性，並增加Rb蛋白的去磷酸化，從而抑制損傷細胞由G 1進入S期，活化的P53 蛋白水平增高能降低細胞發生凋亡反應的閾值，當受損細胞不能修復DNA時則進入凋亡［1］。P53 基因突變消除了許多依賴P53的反應，增加了染色體不穩定性，從而使腫瘤細胞在有DNA損傷的情況下進入細胞周期，抗葯性的腫瘤細胞被篩選出來，並且產生有利於基因擴增的條件，使嘌呤、嘧啶生物合成特異性的酶基因擴增，產生對抗代謝類葯物如氨甲蝶呤的耐葯性。另一方面，P53 基因突變的腫瘤細胞株對凋亡的敏感性下降從而產生耐受化療葯物的特性，研究發現P53 突變的腫瘤細胞導入外源野生型P53 基因後增強化療葯物5-Fu的細胞殺傷作用，這些結果表明wtP53 突變參與了腫瘤細胞對化療葯物的抗性［2］。 1.2Rb原癌基因 Rb基因產物是一種核內蛋白，起反式作用因子的作用。Rb蛋白能與一種細胞生長調節因子E2F形成復合物，抑制E2F誘導S期基因如DNA聚合酶、胸腺嘧啶合成酶、二氫葉酸還原酶等基因的表達，從而抑制細胞的增殖。細胞周期蛋白Cyclin D家族通過使Rb蛋白磷酸化，抑制其與E2F形成復合物，增加自由E2F因子釋放，參與了Rb蛋白網路控制細胞由G1期向S期轉變的過程。因此，當Rb基因突變或Cyclin D 1蛋白表達增高，則使E2F因子活性增強從而使E2F誘導的S期基因表達增高，使腫瘤細胞對化療葯物氨甲蝶呤敏感性下降［3］。 1.3Bcl2原癌基因家族Bcl2基因是在人濾泡淋巴瘤細胞14、18號染色體異位時發現的，但Bcl2蛋白本身並無促進細胞周期進行和使細胞分裂的作用。研究發現Bcl2作為一種抗凋亡基因能專一性抑制許多刺激導致的細胞凋亡，作用機理可能與抑制野生型P53蛋白活性、抑制C myc誘導的凋亡、與bax蛋白形成異聚體抑制其活性有關。在人前列腺癌、結腸癌等腫瘤中發現有Bcl2蛋白過表達，並發現過表達Bcl2的腺癌對化療葯物阿糖胞苷等有抗葯性［4］，Bcl2基因家族中的Bcl XL也能與Bax蛋白形成復合物，抑制其誘導凋亡的活性。在白血病高度耐葯株P388 中發現，Bcl XL水平顯著增高，並與腫瘤細胞耐葯性相關［5］。2DNA損傷修復能力異常許多化療葯物如氮芥、順鉑等通過損傷DNA如使DNA鏈間交聯達到殺傷腫瘤目的，當腫瘤細胞修復DNA損傷的能力增強，則使腫瘤對化療葯物產生抗性。近來發現另一類化療葯物，能選擇性抑制拓撲酶使DNA鏈斷裂，不同的抑制物能與拓撲酶以共價復合物形式穩定在DNA不同位點，通常是DNA核基質附著區和c myc基因活化轉錄區，使DNA鏈斷裂導致細胞死亡。當腫瘤細胞拓撲酶發生改變如拓撲酶Ⅱ轉錄水平和活性降低或者腫瘤細胞拓撲酶Ⅰ突變，使腫瘤細胞對化療葯物拓撲酶抑制物產生耐葯性［6］ 。另一方面，研究發現O 甲基鳥嘌呤 DNA甲基轉移酶MGMT能清除O 6 乙基鳥嘌呤並與N1O6 乙醇鳥嘌呤反應形成一種不可逆的復合物，從而抑制了N 3C N 1G鏈間交合物的形成，缺少MGMT的腫瘤細胞株對化療物苄氯亞硝基脲CENUs高度敏感，而轉染人MGMT進入缺乏此酶的細胞株後發現鏈間交聯形成減少並對CENUs產生抗性。在腦腫瘤中，低水平MGMT的表達與卡氮芥鹼基治療效果轉好有關［7，8］ 。體外發現DNA錯配修復與識別錯配位點的蛋白hMSH2(人Muts同源物2)、GTBP(G T結合蛋白二異聚體)和結合此異二聚體的hMLH1蛋白(人Mutl同源物)有關。hMSH2或hMLH 1缺失導致腫瘤的發生及對順鉑產生低水平耐受［9］ 。另外損傷識別蛋白DPR s與鉑抗性有關，DPRs是一類含遷移基因HMG的蛋白，選擇性地與順鉑 GG和 AG鏈間雙聚物結合後，喪失其轉錄因子的正常功能，從而影響特異基因的轉錄使腫瘤細胞產生鉑抗性。酵母菌編碼HMG蛋白的IXR1基因活性缺失，可對順鉑產生兩倍抗性［10］ 。紫外線損傷識別蛋白UVDRP與紫外線誘導的6，4 光合物高度特異性結合，這種DPR蛋白在順鉑耐性腫瘤細胞株中表達活性增加［11］。近年來有文獻報道DNA聚合酶α、β在苯丙氨酸、氮芥和鉑耐性細胞株中表達大大增高。體內用順鉑治療後，腫瘤細胞的DNA聚合酶α、β和DNA連接酶活性大大增加［12］，使腫瘤細胞在有DNA鏈損傷的情況下仍能進行復制，在細胞G2期清除鏈間交聯、DNA鏈間雙聚體，並抑制P53誘導的凋亡，從而產生鉑耐性。在對鉑化療無反應的惡性卵巢癌患者的腫瘤組織中發現與核酸有關的切除修復基因P33 和P31 基因表達遠高於鉑化療有效的患者。在白血病患者的研究中發現P33 過表達與其對氮芥的耐葯性有關［13］ 。因此DNA修復有關的酶活性增高是腫瘤對化療葯物產生抗性一個重要原因，篩選與DNA修復有關的選擇性抑制劑能增加化療效果。 3多葯耐葯有關基因表達異常 腫瘤細胞對多種化療葯物產生交叉抗葯性的造成腫瘤化療失敗的一個重要原因。研究發現這種耐葯方式即在人腫瘤中和培養的腫瘤細胞株中出現多葯耐葯的產生機制與多種因素如多葯耐葯基因、谷胱甘肽轉移酶、蛋白激酶C等有關。多葯耐葯基因MDR定位於第7號染色體，這個基因蛋白編碼區由27個外顯子組成，其編碼的170KD的P糖蛋白，屬於腺苷三磷酸結合蛋白超家族成員。P 糖蛋白在耐葯細胞膜上過度表達，可將細胞內的化療葯物泵出胞外，細胞內化療葯物達不到有效殺傷劑量而致耐葯性產生。非經典型多葯耐葯如人HL60抗阿黴素等抗性細胞株，其內質網膜上表達一種110KD蛋白，因從肺癌細胞中分離到該蛋白基因故命名為肺抗性蛋白LRP 56，cDNA序列同源性分析中發現這種蛋白屬於胞質穹窿蛋白，這種胞內穹窿蛋白是一種與核胞漿運輸有關的細胞器。因此，LRP 56的作用途徑可能是：一方面通過降低葯物的核質分布比率以降低葯物的有效濃度，另一方面通過囊泡轉運和胞吐機制將胞質內葯物排出細胞外，降低葯物的絕對濃度。許多人腫瘤細胞株和實體瘤中均有LRP 56蛋白表達，在人結腸直腸癌中LRP 56有高表達［14］ ，血液系統腫瘤及實體瘤的LRP 56表達水平也與化療敏感性有關。此外，在P糖蛋白表達陰性的脹瘤細胞株中發現多葯耐葯相關蛋白MRP，MRP編碼mRNA7.8～8.2 kb,定位於染色體16 p13.1,MRP產物為190KD的膜結合糖蛋白，克隆及轉化實驗發現MRP基因能使腫瘤細胞對多種葯物產生抗性［15］。體內外的實驗證實，谷胱甘肽轉移酶GST能催化谷胱甘肽與葯物形成復合物而解毒，腫瘤細胞的GST活性增高從而產生耐葯性。研究發現GST家族中GST π水平在人腫瘤組織如胃癌、結腸癌、肺癌表達增高，許多腫瘤細胞株對化療葯物苯丙氨酸芥、環磷醯胺的抗葯性與GST π表達水平的增高。利用反義技術阻斷腫瘤細胞GST π表達，可明顯增強其對各種化療葯物的敏感性［16］ 。另一種葯物代謝機制與親核物質如氮硫等和葡萄糖醛酸結合有關，這是由葡萄糖醛酸轉移酶UDPGTS這一類大家族催化。在鼠白血病細胞株P338 就發現UDPGTS水平增高並滅活有代謝毒性的daunorubicinol，並對其產生抗葯性［17］。蛋白激酶C是一種Ca2+ /磷脂依賴的同功酶，由單一多肽鏈組成，包含鈣依賴性的巰基蛋白酶分解的兩個不同部位和含有ATP及底物蛋白結合區域的親水性催化部位/活性中心。在體外建立的耐葯細胞株與相應的敏感株相比，蛋白激酶C活性明顯增高。研究表明蛋白激酶Cα對腫瘤多葯耐的形成起重要作用，但各種腫瘤組織的蛋白激酶C存在異質性。蛋白激酶C可能通過磷酸化耐葯基因編碼的膜蛋白調節其轉運功能或通過核內的基因轉錄參與腫瘤的多葯耐葯形成。因此，有必要對蛋白激酶C在多葯耐葯發生、發展中的作用做進一步研究［18］。綜上所述，腫瘤細胞對化療葯物產生抗性的機制是復雜的。針對腫瘤細胞原癌基因表達異常，人們利用基因治療的方法將正常的基因導入細胞增加其對化療敏感性，而許多化合物如鈣離子通道阻滯劑具有逆轉腫瘤細胞多葯耐葯的作用。因此臨床化療應聯合不同作用機理的葯物、不同的治療方法才能達到良好的臨床療效。

㈣ 生物反應器的應用

1.改良乳汁品質；
2.生產葯用蛋白。
3.外源基因在動物體內的位點整合問題；
4.乳蛋白基因表達組織特異性問題；
5.目的蛋白的翻譯後修飾問題；
6.轉基因表達產物的分離和純化問題；
7.轉基因的技術與方法問題；
8.倫理道德問題。
膀胱生物反應器
膀胱反應器有著和乳腺反應器一樣的優點：收集產物蛋白比較容易，不必對動物造成傷害。此外，該系統可從動物一出生就收集產物，不論動物的性別和是否正處於生殖期。膀胱生物反應器最顯著的優勢在於從尿中提取蛋白質比在乳汁中提取簡便、高效。
膀胱生物反應器多用Uroplakin啟動子啟動人生長激素（hGH）的表達，產生 hGH特異性的高豐度RNA，這些RNA與蛋白分泌量高度相關。Uroplakin基因在多種哺乳動物體內有很高的保守性，如鼠、兔、牛、羊和人等。
生長激素 Kerr等[12]將pUPII-LacI用質粒的Kpn i進行消化，用T4DNA多聚酶切去3'端，然後用BamHI消化，分離出3.6kb的5'端小鼠UPII基因片段，此片段含有膀胱反應器特異性表達所需的大部分序列。將此片段與位於無啟動子的pOGH質粒純化SaI和BamHI位點間的hGH結構基因的5'端連接，得到pUPII-hGH質粒，能表達該質粒的組織分布有限。將得到的pUPII- hGH質粒用HindIII和EcoRI消化，得出一段5.7kb的UPII-hGH融合基因可用於顯微注射，在膀胱上皮細胞中合成hGH，收集轉基因動物尿液，從中提取重組蛋白。但在這一途徑中轉基因動物會因hGH的作用逐漸肥胖，並導致雌性動物不育症。乳腺生物反應器也能表達hGH。用同源重組方法將hGH基因導入210kb的人α-乳球蛋白位置依賴性YAC載體，將重組的YAC dNA顯微注入大鼠胚胎，轉基因大鼠的乳汁中含有高水平的hGH，含量可達0.25～8.9mg/ml[13]。
翻譯與修飾
轉基因動物分泌的蛋白，特別是糖鏈成分的結構與人體蛋白有差異。因此研究分泌蛋白的修飾就顯得很重要。在乳腺生物反應器中，蛋白質翻譯前修飾的主要方式是在多個位點對乳腺中的蛋白前體進行信號肽剪切和對糖鏈進行修飾。例如，從山羊乳液中得到的長效組織型纖溶酶原激活劑與人體內和相比較，含有少量的異種（外源）低聚糖，同時，唾液酸、N-乙醯葡萄糖胺和半乳糖含量明顯減少，關且出現缺少蛋白質C127的N-乙醯半乳糖胺。此外，從豬乳液中得到的C蛋白中是沒有的；從羊乳液中得到的重組α1-抗胰蛋白酶多聚肽也反映了唾液酸酸化程度的差異；在山羊乳腺中觀察到了重組抗凝血酶Ⅲ上低聚甘露糖與特異天冬醯胺的位點特異性聚合等等。研究小鼠乳液中的重組γ-干擾素可對翻譯前修飾有更好的理解，γ-干擾素有大量的位點特異性變化，在N端連接位點進行復雜的唾液酸酸化和連接核心岩藻多聚糖，其次是低聚甘露糖。與從小鼠細胞中取得的蛋白質相比，分泌的重組蛋白沒有GalNAc、NeuGC和Gal∞l 、3Gal-βl、 4GlcNAc殘基。這些蛋白特異性的糖基化類型可與細胞上的受體結合並清除病人體內的重組蛋白，因此可能會影響療效，最終的結果尚有待驗證。
同源組織表達蛋白質的優點是可對表達產物進行調控並校正珠蛋白鏈的翻譯過程，避免無效的翻譯前修飾，使產物蛋白盡可能與人體天然蛋白相似，降低人體內的排斥反應，提高葯物蛋白療效。目前，蛋白分離技術飛速發展，大大提高了蛋白質分離的可行性和分離效率。第二種技術路線中目前以乳腺生物反應器較為多見，因為乳汁易得到，且乳汁中的特異蛋白含量較大，對蛋白水解酶的降解作用也比較穩定。乳汁是一種混合物，含3%～6%的總蛋白，3%～5%的脂類，對蛋白提純技術要求比較高。另一方面，葯用蛋白是在動物乳腺中產生。因此只有含轉基因型人雌性動物在泌乳期才能生產葯用蛋白，可用的動物數目有限，且生產期較短。膀胱生物反應器的優點在於含有轉基因型的兩性動物都可用，產後收集時間長，提取產物蛋白濃度雙乳液中的含量低得多，盡管收集的尿液多且時間長，生產單位數量的葯用蛋白在乳腺和膀胱生物反應器中的成本是差不多的
問題與展望
在轉基因動物生物反應器的應用中，有些問題尚待解決。比如，由於轉基因動物的基因是鑲嵌整合型的，因此它的下一代並不都轉基因型。但是在綿羊，豬和山羊中觀察到只要轉基因型從起始個體傳給了下一代，這種轉基因型就可以穩定地遺傳好幾代。而其他一些因素，如外源基因的整合率低，胚胎移植的受孕率低等都使有效的轉基因動物大大減少。同時，由於對調控表達水平的程序，指導進行精確的組織特異性和發育調控表達的程序，以及調控和編碼內含子序列間可能的相互作用的認識尚不充分[14]，容易引起異位點表達；由於現在的技術還不能控制整合的位點，因此存在對內源基因進行插入誘變的可能性，轉基因型的表達會受整合的不同位點的影響。這些因素使得在家畜長成前，要用小鼠對新基因構型進行常規試驗。
轉基因動物生產的葯用蛋白可用於預防和治療疾病，其轉運系統及口服用葯引起的耐受性等問題都在作進一步研究。以轉基因家畜生產珍貴的葯用蛋白具有重大的經濟價值和社會效益，這項生物技術最終將會得到廣泛應用。

㈤ 8個月寶寶喝琥珀蛋白補鐵口服液一天喝多少毫升

怎麼護理新生兒 第1門課 哺喂母奶或配方奶小叮嚀新生兒在餵食完後，拍打嗝的動作相當重要，可以有效地降低新生寶寶吐奶與溢奶的發生率。「吸吮」是寶寶具備的基本能力之一，通過吸吮，寶寶即可獲取成長所需的營養。 無論是哺喂母乳或是配方奶的新手父母，都應該有基本的哺喂觀念，才能讓你的寶貝吃得順利又健康。Tips哺喂母乳：約每2個小時哺喂1次。哺喂配方奶：約每4個小時哺喂1次。4種姿勢正確喂母乳媽媽在哺喂母乳時，可嘗試不同的姿勢讓寶寶吸奶。 1.坐姿(搖籃抱法)姿勢提醒：以舒適的姿勢坐在床上，或找一個有椅背及扶手的椅子靠著椅背坐下。 2.斜倚姿勢提醒：以舒適的姿勢斜倚床上，腿部及背部墊枕頭，使寶寶的頭部躺在手臂上。 3.橄欖球抱姿姿勢提醒：此姿勢適用於雙胞胎、嬰兒含乳有問題、乳腺管阻塞或是剖宮產的媽媽。媽媽的手臂環繞在寶寶身體的下方，用手掌及腕部拖住寶寶身體的下方，用另一隻手掌及腕部拖住嬰兒頭部，以整雙手臂支撐嬰兒的身體。 4.側躺(晚上哺乳或剖腹產後最好的姿勢)姿勢提醒：媽媽側卧，與寶寶面對面，媽媽的腹部接觸寶寶的腹部，寶寶頭部靠近媽媽的乳房。 5步驟正確沖泡配方奶在餵食寶寶配方奶時，建議新手父母遵循以下5步驟，會讓寶寶吃得衛生又安心。 1.准備器具消毒器及有蓋的大鍋、奶瓶、奶嘴、奶蓋，宜准備6~8支奶瓶、洗奶瓶用毛刷(1支)、鑷子(夾奶瓶、奶嘴用)。 2.消毒方法先用肥皂清洗雙手，用干凈的消毒鍋加8分滿的水，准備加熱。耐熱的玻璃奶瓶、鑷子等器具於冷水時放入鍋內煮10分鍾，再將較不耐熱的器具包括奶嘴、奶蓋、奶圈等用紗布包著一起放入煮5~10分鍾。再將消毒好的奶瓶放置於干凈的地方晾乾，以備使用。 3.溫開水沖泡奶粉在奶瓶里倒入需要的溫開水(煮沸過的熱開水冷卻至40℃左右)。不要用滾燙開水沖泡奶粉，易結成凝塊，引起寶寶消化不良。 4.溶入奶粉用湯匙舀起奶粉，舀起的奶粉需鬆鬆的，不可緊壓，再用「D形罐口」刮平，對准奶瓶口倒入。 5.套上奶嘴並檢查溫度及流速手不要碰到奶嘴，把它裝上去並試試牛奶滴出的情形。在手內側滴一滴，確定適當的溫度。 第2門課 睡覺1個月大以內的新生兒，平均每天有15~20小時的睡眠時間，是成年人的2倍多。寶寶的睡眠周期循環相當頻繁，約每2個小時會有短暫的清醒，一個晚上約有7、8個周期，淺睡和深睡交替進行。 Tips&#57348;新生兒每天約清醒2~3小時，之後又進入睡眠狀態。寶寶夜夜難眠8項原因「夜啼」有時是寶寶身體不適的表現，以下為你提供8項檢視新生兒夜晚哭鬧的原因，排除這些原因，寶寶就可以一覺到天明。 1.肚子餓新生兒的胃部容量較小，進食變得較為頻繁，有些新生兒在半夜還需要再喂一次奶，當爸媽忘了餵食自然會哭鬧不止。 2.尿布濕了新生兒每天大概需要換掉10片尿片，半夜寶寶哭鬧不安，可能就是尿布濕了。尿液跟糞便中含有尿素和尿酸等刺激性物質，容易使寶寶的小屁屁不舒服，換尿片不僅可以預防尿布疹，也可以減少寶寶半夜哭鬧。 3.脹氣奶嘴孔的大小不同、母親餵奶的技巧不好、拍氣的方式不對等都會令寶寶出現一陣哭鬧一陣停止哭泣的脹氣症狀。這時，父母親可以用手掌按摩小寶寶的腹部，來舒解寶寶因脹氣帶來的不適，若情況仍無法改善，則需要到醫院請醫生開葯消除脹氣。 4.皮膚癢、痛注意寶寶是否有被刺傷、被蚊蟲叮咬等未被注意到的傷口，甚至連嚴重紅腫的尿布疹及異位性皮膚炎，都會使寶寶突然造成身體上的不適而影響睡眠，這時，爸媽們最好詳細檢查寶寶的身體狀況，了解使寶寶不適的原因。 5.白天睡太飽很多寶寶白天睡得十分香甜，半夜無法入眠。所以白天盡量不要讓寶寶睡太久，以免晚上哭鬧不休。 6.需要安全感寶寶太冷或太熱、奶嘴掉了、心愛的玩具沒在手邊或心理上感覺需要爸媽的關愛時，都會以哭鬧來表達自己的意見。所以寶寶的睡眠環境溫度要適當，不要蓋過量的被子，爸媽們適時地給予寶寶擁抱與安撫，讓寶寶更有安全感，自然會減少哭鬧。 7.維持睡眠環境安寧父母的脾氣與生活習慣、家庭氣氛、居家環境都會影響寶寶的睡眠，盡量維持一個安靜、祥和的氛圍，讓寶寶帶著好心情入睡。 8.寶寶生病了 (1).腸絞痛 由於嬰幼兒在未滿4個月之前，腸壁的神經發育尚未成熟，造成腸胃道蠕動不規則，蠕動過快，糾結在一起而導致痙攣疼痛。發作時間通常在傍晚4點到8點，以及半夜零時前後。 (2).胃腸道疾病 家長應留意寶寶的排便狀況，是否好幾天沒排便 。(如糞便嵌塞、肛裂、腸胃炎、消化不良或腹股溝疝氣。 (3).感染性疾病 寶寶若發燒，則可能是新生兒感染的跡象。常見的感染器官為呼吸道、腸胃道、泌尿道與腦神經系統

㈥ 蛋白質N端和C端的測定方法是什麼基本原理是什麼

(1)N-末端測定
A.二硝基氟苯法(FDNB,DNFB)：1945年Sanger提出此方法，是他的重要貢獻之一。
DNP-氨基酸用有機溶劑抽提後，通過層析位置可鑒定它是何種氨基酸。Sanger用此方法測定了胰島素的N末端分別為甘氨酸及苯丙氨酸。
B.氰酸鹽法：1963年Stank及Smyth介紹了一種測定N末端的新方法,步驟如下：
由於乙內醯脲氨基酸不帶電荷，因此可用離子交換層析法將它與游離氨基酸分開，分離所得的乙內醯脲氨基酸再被鹽酸水解，重新生成游離的氨基酸，鑒別此氨基酸即可了解N-末端是何種氨基酸。
C.二甲基氨基萘磺醯氯法：1956年Hartley等報告了一種測定N-末端的靈敏方法，採用1-二甲基氨基萘-5-磺醯氯,簡稱丹磺醯氯。它與游離氨基末端作用，方法類似於Sanger的DNFB法，產物是磺醯胺衍生物。
丹磺醯鏈酸具有強烈的黃色熒光。此法優點為靈敏性較高(比FDNB法提高100倍，樣品量小於1毫微克分子)及丹磺醯氨基酸穩定性較高(對酸水解穩定性較DNP氨基酸高)，可用紙電泳或聚醯胺薄膜層析鑒定。
(2)C-末端分析
A.肼解法：這是測定C-末端最常用的方法。將多肽溶於無水肼中，100℃下進行反應，結果羧基末端氨基酸以游離氨基酸狀釋放，而其餘肽鏈部分與肼生成氨基酸肼。
這樣羧基末端氨基酸可以採用抽提或離子交換層析的方法將其分出而進行分析。如果羧基末端氨基酸側鏈是帶有醯胺如天冬醯胺和谷氨醯胺，則肼解時不能產生游離的羧基末端氨基酸。此外肼解時注意避免任何少量的水解，以免釋出的氨基酸混淆末端分析。
B.羧肽酶水解法：羧肽酶可以專一性地水解羧基末端氨基酸。根據酶解的專一性不同，可區分為羧肽酶A、B和C。應用羧肽酶測定末端時，需要事先進行酶的動力學實驗，以便選擇合適的酶濃度及反應時間，使釋放出的氨基酸主要是C末端氨基酸。

㈦ 三維和空間基因組學時代（上篇）

十多年前，高通量染色質構象捕獲(Hi-C)技術的出現開啟了三維基因組學的新紀元。從那時起，解析三維基因組的組織結構的方法與日俱增，使得人們越來越了解DNA是如何包裝在細胞核中的，以及基因組的時空組織是如何協調其重要功能的。最近，隨著新一代空間基因組學技術的出現，人們已經開始揭示基因組序列和三維基因組結構是如何在不同組織環境中的細胞之間變化的。在本文中，我們系統總結了用於解析基因組拓撲結構的技術和工具在過去十年中的發展情況，並討論了新技術的發展如何推動三維和空間基因組學領域的發展。

與目前已被廣泛接受[2]的「空間轉錄組學」[1]術語不同，「空間基因組學」這一術語只是最近才被提出的，且定義也不太明確。與空間轉錄組學相類似，術語「空間基因組學」可用於指示研究基因組序列如何在健康和疾病組織或器官的不同區域間的變化，例如使用多區域測序來研究腫瘤內的遺傳異質性[3]。另一方面，自2009年高通量染色質構象捕獲(Hi-C)技術問世以來[4]，空間基因組學領域的許多研究主要集中在繪制細胞核內基因組的3D組織結構圖譜[5,6]。為了避免概念的混淆，我們提議使用術語「三維基因組學」來表示對細胞核中遺傳物質的空間排列以及相對於核界標（nuclear landmarks），如核纖層和核體的研究，而術語「空間基因組學」則表示研究基因組序列或基因組在細胞核中的空間定位如何在多細胞生物體的組織或器官中的特定位置從一個細胞到另一個細胞(以及在不同細胞類型)之間的變化（Figure 1A、B)。在本文中，我們簡要回顧了研究三維基因組學的關鍵方法，這些方法使得人們能夠在細胞群體和單細胞水平研究三維基因組的組織結構，然後重點介紹了正在點燃空間基因組學領域的新興技術，這些技術允許我們跨組織研究多細胞間的(3D)基因組組織結構的變化。關於推進三維基因組學領域的相關方法進行更詳細的比較，我們參考了幾篇優秀的近期綜述[6–11]。並且，在本文中，我們也不討論已被廣泛用於研究基因組變異的多區域測序方法，該方法在腫瘤中可達到空間解析度。

實際上，大多數早期的三維基因組學研究都採用了基於成像的方法[12,13]。因此，二十多年前開發的第一種解析三維基因組互作關系的方法 -- 染色質構象捕獲(3C)技術[14]，在整個研究領域產生了巨大的連鎖反應。3C技術及其後續的高通量測序版本-Hi-C[4]技術，是基於3C衍生的多種測序方法大家族中的兩個主要成員[6,7,9]，這些技術都是利用近端連接探測空間上相互接近的DNA序列之間的染色質互作。使用這些方法解析多種細胞類型和模式生物的三維基因組結構，人們發現基因組會普遍組織成多種不同層級的結構單元，包括A/B區室(compartments)和子區室[4,15]，拓撲相關結構域(TADs) [16]，和染色質互作環(loops)[15]。然而，包括Hi-C在內的大多數基於3C的方法（Box 1），由於使用了鄰近連接、甲醛交聯和限制性連接酶等而具有若干固有的連接偏差[17–21]。為了克服這些缺點，研究人員進一步開發了各種替代技術，包括基因組結構映射(GAM) [22]，通過標記擴展對交互進行拆分-混池識別(SPRITE) [23]，通過基於液滴和條形碼鏈接測序進行染色質相互作用分析(ChIA-Drop) [24]，DNA腺嘌呤甲基轉移酶(Dam)C [25]，以及化學交聯輔助鄰近連接捕獲技術(CAP-C) [110]等。

在這些技術中，GAM通過在交聯核的冷凍切片中檢測DNA位點的共測序頻率來構建Hi-C樣鄰接矩陣，以規避鄰近連接帶來的偏差[22]。SPRITE通過連續幾輪的拆分-混池添加條形碼對交聯的染色質復合物進行分割，在此期間，同一復合物中交聯的染色質片段會混合到一起，並用同一系列的條形碼進行標記[23]。類似地，ChIA-Drop依賴於使用微流體裝置，通過液滴封裝物理分離交聯和DNase I消化的染色質復合物[26]。這樣可以對不同液滴中的染色質復合物添加獨特的條形碼，並對共交聯的染色質片段進行擴增測序[24]。相比之下，DamC代表了第一種基於3C技術且無需交聯和連接的替代方法。DamC是DamID技術的一種改進，DamID是一種涉及將大腸桿菌Dam甲基化酶與感興趣目的蛋白進行融合的方法，在表達時會導致空間上與融合蛋白接近的GATC序列中的腺嘌呤A進行甲基化，從而能夠通過測序進行鑒定[27]。在DamC中，與反向四環素受體融合的Dam被條件性的(經多西環素處理後)招募整合到不同基因組位點的四環素操作子陣列中，之後通過測序檢測DNA的甲基化來揭示染色質間的互作[25]。由於DamC是在非固定細胞中進行的，因此使用該技術證明了TADs和特定染色質環等結構不是因為細胞固定而產生的人工假象，同樣可以在非固定的細胞內檢測到[25]。最近，CAP-C [110]試圖規避由蛋白質與DNA交聯(在大多數基於3C的方法中發生在甲醛交聯期間)時所引入的潛在偏差。這種偏差包括DNA結合蛋白在掩蔽限制性酶切位點和阻礙鄰近連接中可能具有的潛在阻礙作用，其反過來會降低測序的解析度和雜訊。為此，CAP-C使用多功能化學平台和紫外線照射，通過直接交聯DNA-DNA捕獲染色質構象，以亞千鹼基解析度和低背景雜訊生成基因組互作連接圖[110]。此外，當在沒有溫和的甲醛預混合的情況下，CAP-C還能夠檢測天然的染色質構象[110]。除了檢測成對位點之間的互作連接外，GAM，SPRITE，ChIA-Drop和其他幾種3C方法[7,9]還可以檢測揭示更高階染色質結構的多重互作連接，特別是當應用於單細胞時，如單細胞SPRITE (scSPRITE) [28]等。

除了對DNA-DNA互作連接進行測序的方法之外，人們還開發了其他幾種檢測方法，它們可以根據核界標(nuclear landmarks)解析基因組的組織結構（Box 2）。例如，RNA和DNA (RD)-SPRITE允許同時捕獲RNA-DNA、RNA-RNA和DNA-DNA之間的互作連接，從而能夠檢測由特定RNAs組成的核體相關的染色質互作中心，如核仁和核斑點[29]。同樣地，根據轉錄組-基因組關聯圖譜的數據，如RNA-基因組互作圖譜(MARGI) [30]，也可以用於鑒定這些與核體相關的基因組區域[31]。此外，另一種識別與核界標相關區域的方法是利用組成這些結構的蛋白質。其中，實現這一目標的最古老且可能最廣為人知的策略是DamID，該方法需要異位表達Dam融合蛋白，正如前文所述[27]。例如，DamID技術可以用於揭示與核纖層互作較強的基因組區域，也就是所謂的核膜相關結構域(LADs)[32]，並且該技術最近也被提升到了單細胞水平，即scDamID[33]。此外，DamID還被定製到了scDAM&T-seq技術中[34]，這是一種多模態的方法，可以同時在同一個細胞中檢測蛋白質-DNA互作和RNA的表達，因此可以在單細胞水平上探索3D基因組結構和基因表達之間的相互作用關系[34,35]。除了檢測互作頻率之外，人們還開發了酪胺酸信號擴增測序(TSA-seq)的方法來估計基因組位點與特定核體之間的細胞學距離[36]。在TSA-seq中，人們使用辣根過氧化物酶偶聯的抗體靶向感興趣的蛋白質，該抗體在酪胺底物存在的情況下會產生自由基梯度，這種自由基梯度以一種幾乎均勻的方式標記周圍的基因組區域，可以達到距離靶位點數百納米至一微米的距離[36]。對標記後的DNA進行測序後，我們可以基於DNA熒光原位雜交(FISH)測量的物理距離將標准化後的讀數頻率轉換為與靶蛋白結合的3D距離，並且可以同時使用多個探針靶向具有不同TSA-seq值的基因組區域[36]。通過TSA-seq測序，人們發現基因組並非隨機地排列在核斑點周圍，而是在這些核體周圍形成高度保守的基因表達梯度[37]。最後，為了克服DamID和TSA-seq技術對融合蛋白表達和大量細胞的需求，研究人員最近還設計了另一種方法，名為「使用CUT&RUN技術解析基因組組織」(GO-CaRT)[38]。GO-CaRT是基於CTU&RUN技術的基礎而建立的[39]，這是一種表觀基因組學分析策略，通過使用與微球菌核酸酶連接的抗體原位切割相關的染色質，來解析體內與核體相關基因組區域的相互作用。將GO-CaRT應用於各種細胞類型，包括來自不同腦區和物種的神經前體細胞，結果發現了與先前由DamID鑒定出的LADs之間的差異，並發現它們在不同細胞類型之間的可變性高於之前所理解的[38]。此外，應用GO-CaRT技術解析人類前腦樣本，人們還揭示了在所謂的核斑點相關結構域中存在轉錄活性的LAD亞結構域和精神分裂症遺傳風險位點聚類域[38]。除了這三種主要的方法之外，通過在技術流程中加入免疫共沉澱步驟，研究人員還開發了SPRITE[40]和其他幾種3C方法[7,9]，現在人們還能夠選擇性地捕獲與感興趣的特定蛋白質相關或依賴於該蛋白質的染色質互作。

盡管前文描述的技術主要探究了與選定的核界標相關聯的基因組區域的特徵，但這些技術並不能評估細胞核其餘部分中的空間染色質結構的組織特徵。因此，為了研究染色質穿過整個細胞核的輻射性，研究人員開發了一種通過測序定位基因組位點(GPSeq)的技術[41]。GPSeq在形態學上保留的交聯核中，使用一段時間的限制性消化過程，對連續同心層中的染色質進行逐步標記。將層特異性的條形碼連接到酶切的限制性位點後，對基因組DNA進行測序，並將基因組序列劃分到合適大小的區域(通常為20–100 kb)。然後使用一種簡單的數學計算方法，它比較了在不同的消化時間點上每個基因組區域內給定限制性酶切位點的消化概率[41]。通過將GPSeq獲得的徑向圖譜與其他方法獲得的多種全基因組染色質特徵相疊加，如ATAC-seq [42]和ChIP-seq [43]，人們發現許多線性基因組和表觀基因組相關特徵，包括各種表觀遺傳標記、轉錄因子結合基序和復制時間區--沿著核半徑進行空間組織[41,44]。在許多核RNA相關聯的染色質區域，人們也發現了這種類似放射狀組織結構的存在，表明徑向梯度分布是三維基因組結構的重要設計原則[45]。值得注意的是，在計算機三維基因組建模中，通過Hi-C染色質互作圖譜和GPSeq生成的徑向圖進行整合計算可以得到顯著改善的建模結果[41]。除了這種方法之外，越來越多的計算方法集成了多模態組學數據集來模擬三維基因組結構，如核基因組的空間位置推斷(SPIN) [46]，可用於探索三維基因組結構如何在遺傳上相同的細胞之間的變化。此外，目前許多基於測序的檢測方法已被改進提升至單細胞水平，包括單細胞高通量染色體構象捕獲技術(scHi-C) [47,48]，Dip-C [49]，scSPRITE [28]，以及scDAM-ID [33]，通過這些技術我們可以研究不同細胞類型之間的三維基因組動態變化特徵。由於對這些方法的描述超出了本綜述的范圍，我們建議讀者可以參考最近發表的幾篇介紹三維基因組學單細胞方法的優秀綜述[50,51]。