非洲豬瘟血樣檢測方法和步驟

A. 非洲豬瘟的檢測方法有哪些非洲豬瘟疫情防控方法是什麼

熒光定量 PCR 方法，該方法是將光譜技術引入到PCR 反應中，通過熒光信號的強弱變化定量測定特異性擴增產物的量，解決了常規 PCR 方法敏感性低和電泳檢測中溴化乙錠對環境的污染問題。

等溫擴增法，該方法是一種新興的分子生物學檢測方法，等溫擴增方法不需要 PCR 中的變性、退火步驟，即可完成對靶序列的循環擴增，大幅縮短了時間，整個擴增反應時間一般少於 60 min，而常規PCR 方法的反應時間一般需要 2 h 以上。等溫擴增試劑盒適合現場檢測，靈敏度高，能夠大幅提高豬瘟防控的可行性。

要減少場外人員和車輛進入豬場，要對人員和車輛入場前徹底消毒，要對豬群實施全進全出飼養管理，要對新引進生豬實施隔離，要按規定申報檢疫。

非洲豬瘟防控注意事項

養殖場應該堅持全進全出，自繁自育的養殖模式，構建完善的封鎖隔離措施，避免豬和野豬直接接觸。養殖場在生豬調運過程中，盡量不要跨省引進種豬，必須引種時，一定要進行嚴格的產地檢疫、疫情檢測，嚴格執行落地報告制度和隔離觀察制度。

殖場內部如果發現非洲豬瘟可疑疫情，嚴格按照《非洲豬瘟疫情應急預案》進行處置，迅速採取應急措施，預防疫情傳播和蔓延。

B. 非洲豬瘟抽血能查出來嗎

你好，是可以的。唾液的早期可以檢測到,血液的可能要晚幾天才能檢測到,其他的區別不大，需要看選擇哪個廠家的試劑盒。選擇檢出率高的PC r檢測。

C. 非洲豬瘟弱陽性能轉陰性嗎

非洲豬瘟疫病毒在剛被感染或發生時，其表現並不是完整的臨床症狀。並且在疫病發生的早期階段或少數受感染豬只所表現出的症狀容易與其他疾病的症狀相混淆。而非洲豬瘟疫病毒至今仍沒有可靠的預防免疫疫苗及防治葯物，為了有效地防止疫病的傳播，及早發現疫情並成功地進行＇撥牙式＇防控，這就得掌握並藉助於成熟有效的臨床檢測枝術。那麼，根據國外有效的防控檢測經驗及國內自18年8月本國發生疫情的八個多月來的臨床成功防控及檢測實踐經驗的技術推廣，已經允許豬場進行非洲豬瘟疫病毒的自檢自查，而在操作過程中通常會採用血液或唾液兩種樣本進行實驗檢測，為及早地進行成功防控，制止疫病的傳播爭取到最佳的時間。

非洲豬瘟弱陽性能轉陰性嗎唾液檢測呈陽性就可以確定非洲豬瘟了嗎？

非洲豬瘟弱陽性能轉陰性嗎唾液檢測呈陽性就可以確定非洲豬瘟了嗎？

非洲豬瘟弱陽性能轉陰性嗎唾液檢測呈陽性就可以確定非洲豬瘟了嗎？

既然豬場可以通過血液及唾液樣本進行非洲豬瘟疫的檢測來發現病毒，那麼鋒哥就得先跟大家科普下關於通過這兩種樣本對非洲豬瘟疫病毒的檢測技術及實驗方法。1、在對病疫的科學實驗中，採用肌肉接種的方法對豬進行病毒試驗接種，豬在實驗的臨床表現下，最早先於三天即可在實驗豬的血液中檢測到病毒，而隨後才能在唾液及糞便物中檢出。

2、而豬場的豬在實際臨床表現中，往往都是通過豬群之間的嘴鼻直接接觸或間接接觸而感染病毒，這便是自然感染的正常方式。而非洲豬瘟疫病毒在自然感染病毒的情況下，往往比在血液中檢測出病毒早於3~18天，即在自然感染病毒的情況下，血液會在唾液的檢測出病毒3~18天後才可能檢測出來被感病毒。但實際豬場在血液中檢測出非洲豬瘟疫病毒，已經可以斷定為己有很大一部分豬已經受到病毒感染了。所以，豬群中一旦出現不食、厭食、輕微發熱等疑似病症則應立即對病豬進行唾液及肛腸試紙混合檢測，為及時發現非洲豬瘟疫病毒並及時地對豬場的進行防控，減少受疫感面積爭取最有利的時間。

綜上所述，根據在實驗技術及臨床表現對受感非洲豬瘟疫病毒的豬的病毒檢測分析，在豬場的實際操作中，利用豬唾液來檢測到病毒呈陽性不但可以斷定為豬已經感染到了非洲豬瘟疫病毒，而且還為豬場及時發現病毒，及早進行非洲豬瘟疫的有效防控，爭取到了最有利的黃金時間。

感染非洲豬瘟病毒到現在有2年多了，一聽說到豬，就會想到非洲豬瘟，養豬人對其談瘟色變，對我們的養豬行業影響巨大，豬

D. 測非洲豬瘟為啥要用抗凝管

在非洲豬瘟檢測時，豬抗凝全血樣品在經過水浴滅活後有時會產生凝膠，影響實驗的開展。從保存時間及保存溫度兩個方面對380份豬抗凝全血樣品的檢測過程進行分析，發現樣品保存於零度及以下環境和水浴滅活過程會對凝膠的產生有顯著影響。

E. 2022-07-06

一、動物樣品採集、保存和運輸（豬、禽）

1.采樣單需填寫畜牧場的名稱、地址、聯系人、電話。動物的品種、日齡、數量。免疫情況，臨床表現、發病死亡情況以及治療用葯情況等。

2.非洲豬瘟采血需采全血，抗凝血。不採血清。

3.采樣後無法送檢，需加緩沖液保存。

4.牛、羊選擇頸靜脈采血，於頸靜脈溝上三分之一和中三分之一交界處。

5.豬採用前腔靜脈采血，豬頭向上提拉與地面呈30度以上，頸部氣管兩側，最凹處進針。

6.禽翅靜脈采血，在翅下靜脈處消毒，手持采血針，從無血管處向翅靜脈叢刺入，有血液迴流即可。

7.血液傾斜放置2小時，一般血清就可析出。或使用4000轉每分鍾離心機離心10分鍾，可得所有血清，血清放-20℃凍存，全血放4℃冰箱保存

8.組織樣品採集，要採集病變的器官組織，或病變和健康組織交界處。先採集實質器官，後采污染的器官組織。

9.牛羊O-P液採集，待牛羊綁定後，用消毒過的探杯，隨吞咽動作送入食道，輕輕來回抽動2-3次，然後取出探杯，即可採集到O-P液。

10.樣品採集穿防護用具步驟：戴口罩---戴帽子---穿防護服---戴防護眼鏡---穿鞋套或者膠鞋---戴手套

11.樣品採集脫防護用具步驟：摘下防護眼鏡---脫掉防護服---摘下手套---脫掉帽子---脫掉膠鞋或鞋套---摘下口罩

12.實驗過程中所產生的廢棄物應作無害化處理。實驗室內部先進行消毒液浸泡消毒，再使用高壓滅菌鍋，預處理後，移交給專業的無害無害化處理公司處理。

13.客戶寄送樣品，需留樣15天。

二、樣品的接收、制備、留樣

1.樣品運輸需密封、低溫（24h內4℃快運、24h以上冷凍），細菌檢測樣品不能冷凍。

2.樣品登記時登記信息應盡可能詳細，方便檢測出問題時溯源。需檢測的項目也應盡可能的詳細告知，形成書面報告，方便溯源。

3.血樣送檢時未放置填充物，可能導致樣品溶血。寄送時血清未析出就用2個冰袋將血樣包裹，會導致血樣溫度過低冷凍溶血。

4.新鮮組織不加冰袋會導致腐敗。固定組織寄送時加冰，會導致細胞收縮，無法觀察細胞狀態。

5.樣品制備：觀察組織找到合適的部位，找到目標兵敗你位置取樣，3個地方，每個地方一分為二，一份檢測，一份留樣

6.血液樣品：採集後，經離心機離心後，取血清，一分為二，血清量少時貼邊吸出，對應編號。

7.廢棄物及垃圾，經高壓蒸汽121℃30分鍾消毒過，交給無害化公司，做好記錄。

8.實驗結束後，對實驗桌、操作台等進行清理與消毒。使用酒精及紫外線燈。

9.各樣品按各自要求儲存存放，出報告15天後可以處理掉。細菌檢測的新鮮組織，不進行留樣備份。

10.留樣的作用：實驗有問題時、客戶對結果有異議時可以進行復查。

三、禽病檢測

1.病毒僅在活細胞內增值。

2.滅活疫苗在體內無法增值，���產生表面蛋白抗體。弱毒疫苗在體內可以增值，產生表面蛋白抗體和非結構蛋白和內部蛋白抗體，

3.血清學檢測技術：凝集實驗、沉澱實驗、中和實驗、免疫標記技術。

4.凝集試驗原理：顆粒型抗原或可溶性抗原，與相應的抗體結合後，在適量電解質存在的情況下，可以凝結成凝集塊。

5.禽流感病毒可凝集紅細胞，但有抗體存在的情況下，可與禽流感病毒結合，抑制這種反應，未血凝與血凝抑制實驗。

6可溶性抗原與相應抗體結合後，在適量電解質作用下，可形成肉眼可見的沉澱物，為沉澱實.驗。

7.病毒抗原與相應中和抗體結合後，使病毒失去吸附細胞的作用，使其失去感染力，稱為中和實驗

8.使用酶等示蹤物，對抗原和抗體標記後，進行反應，藉助於熒光顯微鏡、酶標儀等儀器，檢查結果稱為免疫標記技術

9.間接ELISA法優點為可用一種酶標二抗檢測各種抗原相應的一抗，缺點是交叉反應高，反應本底高

10.競爭ELISA法的優點是特異性好，缺點是線性關系不好，進檢測誘食表位抗體。

四、非洲豬瘟核酸檢測原理、操作和全流程質控要點

1.科學流程：臨床判斷---采樣---運輸---制樣---核酸提取---體系配置---核酸擴增---結果分析---解決方案

2.非瘟特點：所有豬都易感，出血熱。特急型、急性、亞急性和無明顯症狀

3.非瘟抗原特點:潛伏期長，直接接觸、基因組大、基因型多，I型和II型都多發，變異毒株多，流行范圍廣。

4.熒光PCR檢測原理：核酸是遺傳物質，核酸的結構是核酸檢測的理論基礎。特點是雙螺旋結構、半保留復制、鹼基互補配對。

5.PCR檢測技術：普通PCR（定性）、熒光PCR（相對定量）、數字PCR（絕對定量）。

6.聚合酶鏈式反應五要素：DNA聚合酶，Buffer（緩沖液），dNTPs引物、模板

7.核酸檢測注意事項：人、機、料、法、環、測

8.所有有可能產生氣溶膠的都需要使用生物安全櫃，不能使用通風櫥。房間有正負壓通風最佳，沒有也可。做實驗時，不要開啟通風。

9.核酸檢測操作五字訣：溫、混、純、准、穩

19.注意事項：分區、壓力氣流控制、緩沖走廊、緩沖間、傳遞窗、人流、物流。

五、血清學檢測原理、操作和異常問題分析

1.酶聯免疫吸附實驗，廣泛用於檢測各種微量蛋白含量。

2.原理：待檢物與固相載體表面，發生抗原抗體結合實驗，洗板洗去結合物，假如顯色劑，即可根據顏色深淺，進行定性或定量的分析。

3.測抗原方法：雙抗體夾心法、雙位點一步法、競爭法

4.測抗體方法：間接法、雙抗原夾心法、競爭法、捕獲法

5.試劑盒組成：抗原包被板、樣品稀釋液、20X濃縮洗滌液、陰性對照、陽性對照、酶標抗體、顯色液A液、B液、終止液、封板膜

6.操作：加樣---孵育---洗滌---顯色---讀數

7.病毒的血凝特性：病毒能使紅細胞發生凝集的特性稱為病毒的血凝特性。本質是病毒通過血凝素纖突與紅細胞表面的相應受體發生特異性結合的過程

8.HA實驗結果判斷：完全凝集：紅細胞呈傘狀分布於孔底。不完全凝集：介於兩者之間。完全不凝集：紅細胞呈明顯紐扣狀孔底。

9.血凝效價：能使紅細胞完全發生凝集的病毒的最大稀釋倍數稱為病毒的血凝價

10.血凝抑制原理：病毒表面的血凝素纖突遇到抗體相結合後，無法與紅細胞表面的相應受體結合，所以不發生紅細胞凝集反應。

六、葯敏實驗

1.目的：疫病檢測與診斷，指導臨床科學用葯，防止抗生素亂用。

2.高壓滅菌鍋121℃ 15-20分鍾。含糖多的話116℃。

3.培養基：給細菌生長繁殖的，由不同營養物質組合配置的營養基質，用於細菌的分離鑒定、純化培養、傳代、菌種保存等。

4.瓊脂凝固臨界溫度42℃，固培養基製作完成後可放置50℃水浴鍋中。

5.溶血能力：α：2mm、β：4-5mm、γ：無溶血環

6.細菌的分離鑒定：培養基選擇---樣本處理---平板劃線與培養---菌落形態觀察---革蘭染色鏡檢---生化鑒定---PCR或測序---結果判定。

7.葯敏實驗方法：製片擴散法、稀釋法、抗生素濃度梯度法、自動化儀器檢測。

8.操作流程：抗生素選擇---培養基選擇及制備---菌懸液制備---平板塗布---貼葯敏片與培養---結果觀察及判定

9.質控菌株：對培養基、葯敏片進行質控、驗證操作技術是否合格。

10.組織不得直接做葯敏實驗。

F. 非洲豬瘟抽血一般抽多少毫升血液

非洲豬瘟抽檢比例一般都是1:20，嗯，這個比例應該還是算可以的。
非洲豬瘟現場采樣規程采樣所需材料清單 一般材料⑴ 標簽和記號筆; ⑵ 數據記錄表、筆、寫字板; ⑶ 盛放針頭和刀片的銳器盒; ⑷ 高壓滅菌袋; ⑸ 用於環境采樣的拭子和盛放拭子

G. 非洲豬瘟檢測曲線怎麼看

非洲豬瘟簡稱ASFV，很多人尤其是養豬專業戶提起非洲豬瘟就臉色大變，非洲豬瘟發病快、發病急、傳染快，非洲豬瘟會導致養殖戶錢財損失，非洲豬瘟是一種動物疫病，我們可以利用非洲豬瘟檢測儀來檢測，提前做好防範預防措施。非洲豬瘟檢測儀是用於運行病毒檢測實驗，並對實驗數據進行分析；儀器既可在實驗室內操作，又可用於野外科學實驗，配合相應試劑，對取自待檢測樣本的分析物或其他分析物中的目標核酸進行快速、准確的定性檢測。

非洲豬瘟檢測

免疫電泳試驗抗原於待檢血清間出現白色沉澱線者為陽性直接免疫熒光試驗：在熒光顯微鏡下觀察細胞，若細胞漿內有明亮的熒光團，則為陽性。間接酶聯免疫蝕斑試驗：直接用肉眼觀察蝕斑，若顏色為棕色，則表示為陽性酶聯免疫吸附試驗：對照成立後，若待檢樣品的吸收值大於0.3，則可以判定為陽性。

H. DG55155Tl設置方法

團體標准T/CVMA 5—2018
非洲豬瘟病毒實時熒光PCR檢測方法
Real-time PCR assay for detection ofAfrican swine fever virus
中國獸醫協會發布
前言
本標准按 GB/T 1.1-2009給出的規則起草。
本標准由中國獸醫協會提出並歸口。
本標准起草單位： 中國動物疫病預防控制中心、中國獸醫葯品監察所、中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所、中國農業科學院蘭州獸醫研究所、北京海關。
本標准主要起草人： 倪建強、王傳彬、王琴、仇華吉、殷宏、楊林、辛盛鵬、劉艷華、劉洋、宋曉暉、趙啟祖、羅玉子、劉志傑、張乾義、喬彩霞、夏應菊、楊吉飛、徐璐、顧小雪、亢文華、李碩、畢一鳴。
1、范圍
本標准規定了非洲豬瘟病毒實時熒光PCR檢測方法的試劑、儀器和耗材、操作步驟、結果判定、實驗室生物安全等技術要求。
本標准適用於豬脾臟、淋巴結、血液等組織和血粉中非洲豬瘟病毒核酸的檢測。
2、規范性引用文件
下列文件對於本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用於本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用於本文件。
GB 19489 實驗室 生物安全通用要求
NY/T 541 獸醫診斷樣品採集、保存與運輸技術規范
3、試劑
3.1 DNA提取試劑
DNA提取試劑的配製見附錄A，或選取商品化的病毒DNA提取試劑盒並參照說明書進行DNA提取。
3.2 2 × PCR緩沖液
2 × PCR緩沖液的配製見附錄A。
3.3 引物探針
3.3.1 採用針對非洲豬瘟病毒VP72基因（核苷酸序列見附錄B）的引物及探針：
上游引物ASF-CADC-rPCRF：5'-1528-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-1548-3'
下游引物ASF-CADC-rPCRR：5'-1660-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-1679-3'
熒光探針ASF-CADC-Probe：5'-1638-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB--3'
3.3.2 可以使用世界動物衛生組織（OIE）在陸生動物診斷技術和疫苗手冊（Manual of Diagnostic Tests andVaccines for Terrestrial Animals）第2.8.1章African Swine Fever中提供的引物和探針，並按照手冊中規定的檢測程序和判定標准操作：
上游引物ASF-OIE-rPCRF：5'-1627-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-1651-3'
下游引物ASF-OIE-rPCRR：
5'-1857-GATACCACAAGATCRGCCGT-1876-3'
熒光探針ASF-OIE-Probe：
5'-1761-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-1785-3'
3.3.3 使用國家農業行政主管部門批準的其他引物、探針，應對檢測程序和判定標准作相應調整。
3.4 陰性及陽性對照
陰性及陽性對照的制備方法見附錄C。
3.5 其他試劑
消毒液、5U/μLTaq DNA聚合酶、無菌無核酸酶水、0.01mol/L PBS（pH7.2）。
消毒液配製見附錄A， 0.01mol/L PBS配製見附錄A。
4、儀器和耗材
分析天平（感量0.1mg）、高速台式冷凍離心機（最高離心速度不低於12 000r/min）、冰盒、實時熒光PCR儀及配套反應管（板）、組織研磨器、-20℃冰箱、可調移液器（2 μL，20 μL，200μL，1 000 μL）、1.5mL離心管（無核酸酶）。
5、操作步驟
5.1 樣品採集及運輸
樣品採集及運輸按照NY/T541的規定執行，採集豬的脾臟、淋巴結、血液等組織材料或血粉用於檢測，樣品應在冷藏條件下盡快運輸至實驗室，避免反復凍融。采樣時應穿戴個人生物安全防護裝備，實施現場消毒和廢棄物處理。
5.2 樣品處理
檢測前樣品應在二級生物安全櫃中處理。取0.1g～0.2g組織或血粉，經研磨破碎後加1mL的0.01mol/L PBS（pH7.2）製成勻漿，經12 000 r/min離心2Min取上清；全血、血清樣品直接取1mL，置於1.5 mL離心管內蓋緊管帽。將上述處理的樣品置於60℃條件下滅活30min。
5.3 樣品保存
採集或處理好的樣品在2℃～8℃條件下保存應不超過24 h；如需長期保存，應放置-70℃冰箱，但應避免反復凍融（凍融不超過3次）。
5.4 病毒DNA提取
5.4.1 DNA提取應在樣本制備區內採用以下方法進行，若使用其他等效的病毒DNA提取試劑，則按照試劑說明書操作。
5.4.2 待檢樣品、陽性對照和陰性對照的份數總和用n表示，取n個滅菌1.5 mL離心管，逐管編號。
5.4.3 每管加入200μL DNA提取液1，然後分別加入待測樣品、陰性對照和陽性對照各200μL，1份樣品換用1個吸頭，混勻器上震盪混勻5s。於4℃～25℃條件下，13 000 r/min離心10 min。DNA提取液1見附錄A。
5.4.4 盡可能吸取上清、棄去，吸頭不要碰到沉澱，再加入10 μL DNA提取液2，混勻器上震盪混勻5 s。於4℃～25℃條件下，2 000 r/min離心10s。DNA提取液2見附錄A。
5.4.5 100℃干浴或沸水浴10 min。
5.4.6 加入90μL無DNA酶的滅菌去離子水，13 000 r/min離心10 min，上清即為提取的DNA，-20℃保存備用。無DNA酶的滅菌去離子水見附錄A。
5.5 實時熒光PCR操作
5.5.1 在反應混合物配製區、樣品制備區和檢測區分別進行5.5.2～5.5.4。
5.5.2 每個檢測反應體系需使用20μL實時熒光PCR反應液。根據5.4.2中設定的n值，按附錄D配製反應液，充分混勻後分裝，每個PCR反應管20μL。轉移PCR反應管至 樣品制備區 。
5.5.3 在上述5.5.2的反應管中分別加入5.4中提取的DNA溶液5μL，使每管總體積達到25 μL，記錄反應管對應的樣品編號。蓋緊管蓋後，瞬時離心。
5.5.4 將5.5.3加樣後的反應管放入實時熒光PCR檢測儀內，記錄反應管擺放順序。選定5-羧基熒光素（FAM）作為報告基團，小溝結合物（MGB）為淬滅基團，反應參數設置如下： 預變性95℃/3 min；95℃/15 s，52℃/10 s，60℃/35 s，45個循環； 在每次循環的60℃退火延伸時收集熒光。試驗結束後，根據收集的Ct值和熒光曲線判定結果。
6、結果判定
6.1 結果分析條件設定
實時熒光PCR檢測閾值設定原則：閾值線超過陰性對照擴增曲線的最高點，且相交於陽性對照擴增曲線進入指數增長期的拐點，或根據儀器雜訊情況進行調整。每個樣品反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數即為Ct值。
6.2 結果描述及判定
當陽性對照Ct值≤28.0且出現典型擴增曲線，陰性對照無Ct值無擴增曲線時，實驗成立，實例參考附錄E。 當被檢樣品出現典型的擴增曲線且Ct值≤38.0時，判為非洲豬瘟病毒核酸陽性 ； 被檢樣品無Ct值，判為非洲豬瘟病毒核酸陰性；對於Ct值＞38.0的樣品且出現典型的擴增曲線，應重檢，重檢仍出現上述結果的判為陽性，否則判為陰性。
7、實驗室生物安全要求
7.1 本方法涉及非洲豬瘟感染性樣品的實驗操作應在（動物）生物安全三級試驗室中進行，實驗室生物安全管理要求見GB 19489。國家農業行政主管部門另有規定的，按其規定執行。
7.2 使用過的實驗器材和液體廢棄物應先經過消毒液浸泡處理，再經高溫高壓處理後廢棄。剩餘樣品等固體廢棄物應在生物安全櫃中密封包裝，經表面消毒後移出，再經高溫高壓處理後廢棄。
一
附錄 A (規范性附錄) 試劑的配製
A.1 DNA提取液1
PEG8000晶體20.74g，NaCL17.53g，加去離子水定容到100 mL。
A.2 DNA提取液2
1mol/LTris.Hcl 2 mL，2 mol/L KCL5 mL，0.5 mol/L EDTA 0.5 mL，NP-40 1 mL，加去離子水定容到100 mL。
即KCL14.912g，Tris鹼12.114g，1.2068 mL濃HCl，EDTA14.612g，NaOH 6g, 加去離子水定容到100 mL。
A.3 2×PCR緩沖液
滅菌去離子水 70 mL
三羥甲基氨基甲烷（Tri s） 0.79 g
氯化鉀 1.865 g
曲拉通X-100 0.5 mL
dATP (100mmol/L) 2.5 mL
dTTP (100mmol/L) 2.5 mL
dGTP (100mmol/L) 2.5 mL
dCTP (100mmol/L) 2.5 mL
六水氯化鎂 0.61 g
鹽酸 調pH至9.0
滅菌去離子水 加至100 mL
A.4 消毒液
8‰氫氧化鈉或3‰福爾馬林或3%鄰苯基苯酚或碘化合物等其他消毒試劑均可。
A.5 磷酸鹽緩沖液（PBS）的配方
A.5.1 A液
0.2mol/L磷酸二氫鈉水溶液：NaH2PO4·H2O 27.6 g，溶於蒸餾水中，最後定容至1 000 mL。
A.5.2 B液
0.2mol/L磷酸氫二鈉水溶液：Na2HPO4·7H2O 53.6 g（或Na2HPO4·12H2O 71.6 g或Na2HPO4·2H2O 35.6 g），加蒸餾水溶解，最後定容至1 000 mL。
A.5.3 0.01 mol/L、pH 7.2 磷酸鹽緩沖液（PBS）的配製
取A液14 mL、B液36 mL，加NaCl 8.5 g，用蒸餾水定容至1 000 mL。經過濾除菌後，無菌條件下分裝。
A.6 無DNA酶的滅菌去離子水
無DNA酶的滅菌去離子水是用1 %DEPC處理後的去離子水，電阻應該大於18.2mΩ。
二
附錄B （資料性附錄）非洲豬瘟病毒VP72基因參考序列
1ATGGCATCAG GAGGAGCTTT TTGTCTTATT GCTAACGATG GGAAGGCCGA CAAGATTATA
61TTGGCCCAAG ACTTGCTGAA TAGCAGGATC TCTAACATTA AAAATGTGAA CAAAAGTTAT
121GGGAAACCCG ATCCCGAACC CACTTTGAGT CAAATCGAAG AAACACATTT GGTGCATTTT
181AATGCGCATT TTAAGCCTTA TGTTCCAGTA GGGTTTGAAT ACAATAAAGT ACGCCCGCAT
241ACGGGTACCC CCACCTTGGG AAACAAGCTT ACCTTTGGTA TTCCCCAGTA CGGAGACTTT
301TTCCATGATA TGGTGGGCCA TCATATATTG GGTGCATGTC ATTCATCCTG GCAGGATGCT
361CCGATTCAGG GCACGTCCCA GATGGGGGCC CATGGGCAGC TTCAAACGTT TCCTCGCAAC
421GGATATGACT GGGACAACCA AACACCCTTA GAGGGCGCCG TTTACACGCT TGTAGATCCT
481TTTGGAAGAC CCATTGTACC CGGCACAAAG AATGCGTACC GAAACTTGGT TTACTACTGC
541GAATACCCCG GAGAACGACT TTATGAAAAC GTAAGATTCG ATGTAAATGG AAATTCCCTA
601GACGAATATA GTTCGGATGT CACAACGCTT GTGCGCAAAT TTTGCATCCC AGGGGATAAA
661ATGACTGGAT ATAAGCACTT GGTTGGCCAG GAGGTATCGG TGGAGGGAAC CAGTGGCCCT
721CTCCTATGCA ACATTCATGA TTTGCACAAG CCGCACCAAA GCAAACCTAT TCTTACCGAT
781GAAAATGATA CGCAGCGAAC GTGTAGCCAT ACCAACCCGA AATTTCTTTC ACAGCATTTT
841CCCGAGAACT CTCACAATAT CCAAACAGCA GGTAAACAAG ATATTACTCC TATCACGGAC
901GCAACGTATC TGGACATAAG ACGTAATGTT CATTACAGCT GTAATGGACC TCAAACCCCT
961AAATACTATC AGCCCCCTCT TGCGCTCTGG ATTAAGTTGC GCTTTTGGTT TAATGAGAAC
1021GTGAACCTTG CTATTCCCTC AGTATCCATT CCCTTCGGCG AGCGCTTTAT CACCATAAAG
1081CTTGCATCGC AAAAGGATTT GGTGAATGAA TTTCCTGGAC TTTTTGTACG CCAGTCACGT
1141TTTATAGCTG GACGCCCCAG TAGACGCAAT ATACGCTTTA AACCATGGTT TATCCCAGGA
1201GTCATTAATG AAATCTCGCT CACGAATAAT GAACTTTACA TCAATAACCT GTTTGTAACC
1261CCTGAAATAC ACAACCTTTT TGTAAAACGC GTTCGCTTTT CGCTGATACG TGTCCATAAA
1321ACGCAGGTGA CCCACACCAA CAATAACCAC CACGATGAAA AACTAATGTC TGCTCTTAAA
1381TGGCCCATTG AATATATGTT TATAGGATTA AAACCTACCT GGAACATCTC CGATCAAAAT
1441CCTCATCAAC ACCGAGATTG GCACAAGTTC GGACATGTTG TTAACGCCAT TATGCAGCCC
1501ACTCACCACG CAGAGATAAG CTTTCAGGAT AGAGATACAG CTCTTCCAGA CGCATGTTCA
1561TCTATATCTG ATATTAGCCC CGTTACGTAT CCGATCACAT TACCTATTAT TAAAAACATT
1621TCCGTAACTG CTCATGGTAT CAATCTTATC GATAAATTTC CATCAAAGTT CTGCAGCTCT
1681TACATACCCT TCCACTACGG AGGCAATGCG ATTAAAACCC CCGATGATCC GGGTGCGATG
1741ATGATTACCT TTGCTTTGAA GCCACGGGAG GAATACCAAC CCAGTGGTCA TATTAACGTA
1801TCCAGAGCAA GAGAATTTTA TATTAGTTGG GACACGGATT ACGTGGGGTC TATCACTACG
1861GCTGATCTTG TGGTATCGGC ATCTGCT
三
附錄C （規范性附錄）非洲豬瘟病毒核酸陽性及陰性對照
C.1陽性對照
陽性對照制備方法：人工合成非洲豬瘟病毒VP72基因片段，序列參見附錄B，將VP72基因連接於pMD20-T載體製成陽性質粒pMD20-T-VP72，使用非洲豬瘟病毒陰性豬的組織研磨液將質粒稀釋至濃度為10 000copies/L，保存於-20℃備用。
C.2 陰性對照
陰性對照為非洲豬瘟病毒陰性豬的組織研磨液。
四
附錄D （規范性附錄）實時熒光PCR反應液配方
實時熒光PCR反應液配方見表D.1。
表D.1 實時熒光PCR反應液配方
組 分
1個檢測體系的加入量
2×PCR 緩沖液a
12.5μL
dNTP（2.5 mmol/L）
1.0 μL
上游引物（10 μmol/L）
1.0 μL
下游引物（10 μmol/L）
1.0μL
探針（10 μmol/L）
1.0 μL
Taq 酶b（5U/μL）
0.5μL
去離子水
3μL
總體積
20μL
2×PCR 緩沖液a: 參見附錄A.1配方。
Taq 酶b：具有5』→3』外切活性。
五
附錄 E （資料性附錄）非洲豬瘟病毒實時熒光PCR擴增實例參考
圖D.1給出了非洲豬瘟病毒實時熒光PCR擴增實例。
圖E.1 非洲豬瘟病毒核酸實時熒光PCR典型擴增曲線示意圖
(資料來源：中國獸醫協會）

I. 豬場懷疑發生非洲豬瘟有什麼好的措施

懷疑是非洲豬瘟首先通過檢測確診，可以採取疑似病豬的唾液、鼻拭子，血樣建議采尾根血送檢。有條件的養殖場可以建立自己的實驗室，采購肇慶大華農生物葯品有限公司的非洲豬瘟熒光PCR檢測試劑盒，有專業的人士指點及培訓。如果對我的回答滿意的話，請採納

J. 非洲豬瘟檢測為什麼不給檢測單

首先，這本來屬於外來病，傳入國內，為了防止蔓延，控制疫病，檢測抗原，是為了凈化和消滅該病。

另外，這類病屬於烈性病，抗體產生需要周期，相對而言，在疾病早期抗原檢測優於抗體檢測。
鼻腔拭子—對比耳尖血拭子可提前3-21天發現，為拔牙提供窗口期，但病毒載量較少，有時檢測不出來

耳尖血拭子—病毒載量大，發病後比較容易檢出，相對准確

保准確方案：選取幾頭豬鼻腔拭子+耳尖血拭子雙采，提升准確度+提早發現

省錢方案：只採血拭子，發現較晚

環境試子—不做豬場環境非洲豬瘟病毒（ASFV）檢測，復養就是賭博。

一、鼻試子采樣

（一）、准備材料：

泡沫箱、冰袋，用於保存樣本送檢；棉簽，用於採集唾液樣本；封口袋，輔助保存棉簽採集的鼻拭子樣本；一次性手套；記號筆：用於樣本編號。

（二）、鼻拭子采樣方法：

醫用棉簽用生理鹽水打濕，插入豬鼻腔3—5cm，轉3圈。采樣時，注意戴一次性手套，每采一頭豬新更換一次手套，同時進入不同的棟舍要及時更換水鞋和衣服，防止交叉感染。每個棉簽放入單獨自封袋或者輸精瓶中密封，在輸精管上記上標號（數字）並記錄每個輸精管對應的豬，以便將檢測結果與豬一一對應。

（三）、采樣范圍：

發病場:（已經發病有症狀或復養場）發病豬每圈選1-2頭或發病豬30%取樣。

發病棟舍內其餘疑似健康豬（沒有症狀）每圈選取1頭或30%取樣。其餘舍門口風口選2-3頭

疑似場：（周圍有疫情壓力，本豬場沒有任何症狀），每舍門口、風口位置選2-3圈，每圈2頭或10-20%取樣。

陰性場：（周圍沒有疫情壓力，本場豬沒有任何症狀），每舍門口、風口位置選2-3圈，每圈1頭或6-10%取樣。