實驗室分光度計使用步驟方法

『壹』 怎樣用分光光度計測定菌體濃度詳細一點，回答好的追加20分

風光光度計不同的話，使用方法也不同
首先，你需要一個對照，就是你培養菌液時所用的干凈的培養
然後，將菌液和培養基分別放到兩個比色皿中，一般的比色皿是3mL的
將對照的比色皿放到第一個樣品池中，其餘的比色皿按順序放好
最後，就是調節分光光度計，就跟電腦操作差不多，先設定波長，然後對對照進行校對歸0，然後就可以測量其它的樣品，有的分光光度計是需要用手拉樣品池，通過外面的那個好像叫做欄珊，有的是自動的。
差不多就這樣，如果你想問分光光度計怎麼用的話，實驗室里應該有說明書，而且那上面的按鈕就跟電腦上差不多，不難！

『貳』 紫外可見分光光度計可以測量哪些物質求詳細步驟

能測得很多，甚至有本很經典的著作，就是專門講分光光度計的原理和應用的，這本書里可以查到目前幾乎所有能用分光光度計來測量的物質的測量方法和工作波長。
分光光度計是實驗室的基礎儀器，測定的方法和原理本身很簡單。就是說化學物質對波，也就是光有一定的吸收，並且對不同波長的波的吸收程度不同。一般情況下會對某個特定波長（或者波長范圍）的吸收達到峰值，那麼對該物質的測定就在該波長下進行，因為這個時候吸光敏感，測量的靈敏度高。光波被吸收的量與物質濃度成正比，那麼就可以根據光波被吸收的量計算出被測物濃度。
知道原理後，測定的方法就是對某種被測物進行適當的前處理，把該物質中的某代表元素轉化為能夠用分光光度法測定的形態，然後選擇適當的波長（可以查標准方法，也可以自己掃描工作波長）進行測定。一般是要自己先用標准序列做出標准曲線或者工作曲線，明確吸光度與濃度的比例關系，然後再測定樣品。根據不同的前處理及其他情況，注意選擇合適的參比。

『叄』 誰能告訴我怎麼用分光光度計測活性炭的亞甲基藍值亞藍溶液配好了，活性炭攪拌吸附也做好了，怎麼測

這個標準的敘述是有點令人費解，關鍵之處沒有說的很清楚（也許還有上下文，你沒全部打出來）。

用滴定管加入適量的亞甲基藍試驗液，所謂適量，你開始時是不知道的（你做的多了，以後就心中有數了）。需要多次試驗，越來越接近所謂的適量。假定這樣最終得到的試液與硫酸銅標准濾色液的吸光度相同，則你最後一次試驗中所加入的亞甲藍試驗液的消耗量就是吸附值。

標准硫酸銅在這里就起著一個標准色度的作用（其實也可以用相同吸光度的亞甲藍標准溶液代替，但亞甲藍試劑本身純度不象硫酸銅那麼高，並且不夠穩定，容易發生氧化而變色，作為標准色度溶液不合適，每次需要新配）。亞甲基藍吸附值就是用這個標准確定的。

當活性炭量一定的時候，並且它的吸附值一定的時候，它對亞甲藍的吸附量是一定的，你加入的亞甲藍越少，吸附後殘留亞甲藍的濃度越低，顏色越淡。如果它產生的吸光度比標准硫酸銅低的話，說明你加的亞甲藍還不夠，到了相同吸光度到時候，說明你加的正好。反過來說，要使殘留液的吸光度和標准硫酸銅相同的話，對於某個0.100g活性炭樣品，你加的亞甲藍越多，就說明這個樣品的吸附能力越強（吸附值越高）。

你用的應是較老式的分光光度計，調零（不透光）只要把樣品室艙門打開（此時光路不通光電管不接受光）就可以了。調滿度（全透光）樣品室中放入裝有蒸餾水的相同比色皿時進行。

還有一點補充一下，第一次做的時候，你對什麼叫適量一無所知，你隨便加一定量例如20ml，按照方法操作後得到樣品液，去測一下它的吸光度，和標准硫酸銅比較一下，如果低了，下次就多加點亞甲藍，低得多就加的多。如果高了，下次就減半。還高再減半，如此下去有個3-4次就心中有數了。

為什麼我配的亞甲基藍標准溶液（未經活性炭吸附的）上了分光光度計就超過滿度了？

怎麼可能超滿度？你講的滿度是吸光度A，還是透光率T，如果前面調好的話，兩個都不可能超滿度。除非儀器壞了，儀器壞了，調滿度T，根本調不了。另外這個原溶液是不測定的，測定的是經過吸附脫色的樣品液，以及硫酸銅標准液。

如仍有不明，請追問。

『肆』 紫外可見分光光度計的用法

752紫外可見分光光度計
儀器的工作原理
分光光度計的基本原理是溶液中的物質在光的照射激發下，產生了對光的

吸收效應，物質對光的吸收是具有選擇性的。各種不同的物質都具有其各自的

吸收光譜，因此當某單色光通過溶液時，其能量就會被吸收而減弱，光能量減

弱的程度和物質的濃度有一定的比例關系，也即符合於比色原理—一比耳定律。
τ=I/Io
log I/Io=KCL
A= KCL
從以上公式可以看出，當入射光、吸收系數和溶液的光徑長度不變時．透過
的光是根據溶液的濃度而變化的，752紫外可見分光光度計的基本原理是根
據上述物理光學現象而設計的。
儀器的安裝、使用
安裝

1 儀器在安裝使用前應對儀器的安全性進行檢查，電源電壓是否正常，接

地線是否牢固可靠，在得到確認後方和接通電源使用。

2 儀器經過運輸和搬運等原因，會影響波長准確度，應進行儀器調校後使用。

使用：儀器使用前需開機預熱30min。

本儀器鍵盤共有4個鍵，分別為； 1 A /τ/C/F

1SD

2 ▽／0％

3∆／100％

4 A /τ/C/F鍵：每按此鍵來切換A、τ 、C、F之間的值。

A——吸光度（Absorbance）

T——透射比（Trans）

C——濃度（conc）

F——斜率（Factor）

(2)F值 通過按鍵輸入（後面介紹如何設置）

5SD鍵：該鍵具有2個功能

a)用於RS232串列口和計算機傳輸數據（單向傳輸數據，儀器發向計算

機）。

b)當處於F狀態時，具有確認的功能，即確認當前的F值，並自動轉到C，

計算當前的C值（C=F*A）。

6 ▽／0％鍵：該鍵具有2個功能

a）調零；只有在τ狀態時有效，打開樣品室蓋，按鍵後應顯示0.000。

b）下降鍵：只有在F狀態時有效，按本鍵F值會自動減1，如果按住本

鍵不放，目動減1會加快速度；如果F值為0後，再按鍵它會自動變為1999。

而按鍵開始自動減1。

7 ∆／100％鍵；該鍵具有2個功能

a）只有在A、τ狀態時有效，關閉樣品室蓋，按鍵後應顯示0.000、100.0。

b）上升鍵：只有在F狀態時有效，按本鍵F值會自動加1，如果按住本

鍵不放，自動加1會加快速度，如果F值為1999後，再按鍵它會自動

變為0，再往鍵開始自動加l。

例如：設置斜率為1500。

方法一

T）按 A／τ／C／F鍵切換到 F狀態。

b）如果當前F值為1000，則按∆／100%鍵，直到F值為1500。

C）再按 SD鍵，表示當前的 F值為 1500，然後自動回到 C狀態，假如所

測的 A值為 0．234，則此時顯示 C值為 0351。

方法二

a）按A／τ／C／F鍵切換到F狀態。

b）如果當前的 F值為 1000，則按∆／100%鍵，直到F值為 1500、再按 A／τ／C／F鍵切換到C狀態，假如所測的A值為0.224，則此時顯示C值為0351。

『伍』 分光光度計如何測量樣品急急急急急急

分光光度計要測量的樣品必須是均一的溶液，不能有沉澱，如果有沉澱的話就要搖勻。之於為什麼這樣做和可以做哪些測量、如何測量，下面詳述:
分光光度計就是利用分光光度法對物質進行定量定性分析的儀器。
而分光光度法則是通過測定被測物質在特定波長處或一定波長范圍內光的吸收度，對該物質進行定性和定量分析。 常用的波長范圍為：(1)200～400nm的紫外光區,(2)400～760nm的可見光區,(3)2.5～25μm（按波數計為4000cm<-1>～400cm<-1>）的紅外光區。所用儀器為紫外分光光度計、可見光分光光度計（或比色計）、紅外分光光度計或原子吸收分光光度計。為保證測量的精密度和准確度，所有儀器應按照國家計量檢定規程或本附錄規定，定期進行校正檢定。 單色光輻射穿過被測物質溶液時，被該物質吸收的量與該物質的濃度和液層的厚度（光路長度）成正比，其關系如下式： 1 A=log — =ECL T 式中 A 為吸收度； T 為透光率； E 為吸收系數，採用的表示方法是(E1％ 1cm),即吸收度換算成溶液濃度為1％(g/ml)，液層厚度為1cm的數值； C 為100ml溶液中所含被測物質的重量，g(按乾燥品或無水物計算）； L 為液層厚度 ，cm。 物質對光的選擇性吸收波長，以及相應的吸收系數是該物質的物理常數。當已知某純物質在一定條件下的吸收系數後,可用同樣條件將該供試品配成溶液，測定其吸收度,即可由上式計算出供試品中該物質的含量。在可見光區，除某些物質對光有吸收外，很多物質本身並沒有吸收,但可在一定條件下加入顯色試劑或經過處理使其顯色後再測定,故又稱比色分析。由於顯色時影響呈色深淺的因素較多，且常使用單色光純度較差的儀器，故測定時應用標准品或對照品同時操作。
分光光度計已經成為現代分子生物實驗室常規儀器。常用於核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。
分光光度計的簡單原理
分光光度計計採用一個可以產生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產生特定波長的光源，光源透過測試的樣品後，部分光源被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
核酸的定量
核酸的定量是分光光度計使用頻率最高的功能。可以定量溶於緩沖液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長260 nm。每種核酸的分子構成不一，因此其換算系數不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應的系數。如：1OD 的吸光值分別相當於50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測試後的吸光值經過上述系數的換算，從而得出相應的樣品濃度。測試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾後測試空白液和樣品液。然而，實驗並非一帆風順。讀數不穩定可能是實驗者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現出的吸光值漂移越大。
事實上，分光光度計的設計原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內變化，即儀器有一定的准確度和精確度。如Eppendorf Biophotometer的准確度≤1.0%（1A）。這樣多次測試的結果在均值1.0%左右之間變動，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測試時，離子濃度太高，也會導致讀數漂移，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液，如TE，可大大穩定讀數。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由於樣品中不可避免存在一些細小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了最大程度減少顆粒對測試結果的影響，要求核酸吸光值至少大於0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范圍內，顆粒的干擾相對較小，結果穩定。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計的測試范圍）。最後是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現負值；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數和樣品濃度單位選擇一致；不能採用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達到比色杯要求的最小體積等多個操作事項。
除了核酸濃度，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用於評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品，比值大於1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低於1.8 或者2.0，表示存在蛋白質或者酚類物質的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大於2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0。
蛋白質的直接定量（UV法）
這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉換為樣品濃度。蛋白質測定過程非常簡單，先測試空白液，然後直接測試蛋白質。由於緩沖液中存在一些雜質，一般要消除320nm 的「背景」信息，設定此功能「開」。與測試核酸類似，要求A280的吸光值至少大於0.1A，最佳的線性范圍在1.0-1.5 之間。實驗中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時，發現讀數「漂移」。這是一個正常的現象。事實上，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%，表明結果非常穩定。漂移的原因是因為Warburg 公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數，只要吸光值有少許改變，濃度就會被放大，從而顯得結果很不穩定。蛋白質直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質。紫外直接定量法相對於比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。
比色法蛋白質定量
蛋白質通常是多種蛋白質的化合物，比色法測定的基礎是蛋白質構成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團或者染料反應，產生有色物質。有色物質的濃度與蛋白質反應的氨基酸數目直接相關，從而反應蛋白質濃度。
比色方法一般有BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。
Lowry 法：以最早期的Biuret 反應為基礎，並有所改進。蛋白質與Cu2 反應，產生藍色的反應物。但是與Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高。缺點是需要順序加入幾種不同的反應試劑；反應需要的時間較長；容易受到非蛋白物質的影響；含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物質的蛋白不適合此種方法。
BCA（Bicinchoninine acid assay）法：這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在鹼性溶液里與Cu2 反應產生Cu ，後者與BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關系極強，反應後形成的化合物非常穩定。相對於Lowry法，操作簡單，敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質之間以及去污劑的干擾。
Bradford 法：這種方法的原理是蛋白質與考馬斯亮蘭結合反應，產生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特點是，敏感度好，是Lowry 和BCA 兩種測試方法的2 倍；操作更簡單，速度更快；只需要一種反應試劑；化合物可以穩定1小時，方便結果；而且與一系列干擾Lowry，BCA 反應的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對於去污劑依然是敏感的。最主要的缺點是不同的標准品會導致同一樣品的結果差異較大，無可比性。
某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結果並不一致，感到迷惑，究竟該相信哪種方法？由於各種方法反應的基團以及顯色基團不一，所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性。例如：Keller等測試人奶中的蛋白，結果Lowry，BCA 測出的濃度明顯高於Bradford，差異顯著。即使是測定同一樣品，同一種比色法選擇的標准樣品不一致，測試後的濃度也不一致。如用Lowry測試細胞勻漿中的蛋白質，以BSA作標准品，濃度1.34mg/ml，以a球蛋白作標准品，濃度2.64mg/ml。因此，在選擇比色法之前，最好是參照要測試的樣本的化學構成，尋找化學構成類似的標准蛋白作標准品。另外，比色法定量蛋白質，經常出現的問題是樣品的吸光值太低，導致測出的樣品濃度與實際的濃度差距較大。關鍵問題是，反應後1011分光光度計的重要配件—— 比色杯的顏色是有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應測試時間，所有的樣品（包括標准樣品），都必須在此時間內測試。時間過長，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。除此，反應溫度、溶液PH值等都是影響實驗的重要原因。此外，非常重要的是，最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質的比色杯，因為反應後的顏色會讓石英或者玻璃著色，導致樣品吸光值不準確。
細菌細胞密度（OD 600）
實驗室確定細菌生長密度和生長期，多根據經驗和目測推斷細菌的生長密度。在遇到要求較高的實驗，需要採用分光光度計准確測定細菌細胞密度。OD600是追蹤液體培養物中微生物生長的標准方法。以未加菌液的培養液作為空白液，之後定量培養後的含菌培養液。為了保證正確操作，必須針對每種微生物和每台儀器用顯微鏡進行細胞計數，做出校正曲線。實驗中偶爾會出現菌液的OD值出現負值，原因是採用了顯色的培養基，即細菌培養一段時間後，與培養基反應，發生變色反應。另外，需要注意的是，測試的樣品不能離心，保持細菌懸浮狀態。
分光光度計的重要配件—— 比色杯
比色杯按照材質大致分為石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根據不同的測量體積，有比色杯和毛細比色杯等。一般測試核酸和紫外定量蛋白，均採用石英杯或者玻璃杯，但是不適合比色法測定。因為反應中的染料（如考馬斯亮蘭）能讓石英和玻璃著色，所以必須採用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不適合用於在紫外范圍內測試樣品。
由於另外測試的樣品量不同，所以一般分光光度計廠家提供不同容積的比色杯以滿足用戶不同的需求。目前市場已經存在一種既可用於核酸、紫外蛋白質定量，亦可用於蛋白比色法測定的塑料杯，樣品用量僅需50μl，比色杯單個無菌包裝，可以回收樣品。如Eppendorf UVette®塑料比色杯，是目前比色杯市場上一個革新。隨著生命科學以及相關學科發展，對此類科學的實驗研究提出更高的要求，分光光度計將是分子生物學實驗室不可缺少的儀器，也成為微生物、食品、制葯等相關實驗室的必備設備之一。
隨著科技的發展，現在比色杯已經不是使用分光光度計時的必備物品。目前國外Nanodrop公司（現已被Thermo Fisher公司收購）生產的ND1000分光光度計與舊式分光光度計相比，已經可以做到無需稀釋樣品，無需使用比色杯，每次測量僅需1-2μl樣品即可完成測量。

『陸』 分光光度計的原理是什麼

在分光光度計中,將不同波長的光連續地照射到一定濃度的樣品溶液時,便可得到與眾不同波長相對應的吸收強度.如以波長(λ)為橫坐標,吸收強度(A)為縱坐標,就可繪出該物質的吸收光譜曲線.利用該曲線進行物質定性、定量的分析方法,稱為分光光度法,也稱為吸收光譜法.用紫外光源測定無色物質的方法,稱為紫外分光光度法;用可見光光源測定有色物質的方法,稱為可見光光度法.它們與比色法一樣,都以Beer-Lambert定律為基礎.
近年來,紫外及可見光分光光度分析已得到廣泛的應用,它不僅可以用於物質的鑒定及結構分析,而且還可以用於某些物質含量的測定.
分光光譜技術可用於:
通過測定某種物質吸收或發射光譜來確定該物質的組成.
通過測量適當波長的信號強度確定某種單獨存在或與其他物質混合存在的一種物質的含量.
通過測量某一種底物消失或產物出現的量同時間的關系,追蹤反應過程.
一、紫外及可見光分光光度法這是一種只在可見光及紫外光光譜應用范圍內測量物質吸收輻射線的技術,應用十分廣泛.其中分光光度計可用於精確測量特定波長的吸收值,而比色計則是一種較簡單的測量儀器,其原理是利用慮光片來測量較寬波段(如可見光中的綠光、紅光或藍光范圍)的吸收值.
光吸收法則:
溶液對光的吸收有兩個基本法則:
透過溶液的光的吸收值同吸收溶質的分子數目(即溶質濃度[C])呈指數相關.
透過溶液的光的吸收值同透過吸收溶液的路徑長度l成指數相關.
這兩條法則包括在比爾-朗伯關系式中.通常以入射光(Io)和出射光(I)的光密度來表示:
ε其中ε對於吸收物質及波長是一個常數,稱為吸光系數或吸收系數,[C]的單位為mol/L或g/L,l的單位為ml.這一公式非常有用,因為大多數分光光度計設計為直接測量log10(Io/I)的值(A)或消光值(E)(舊教材中可能使用以廢除的術語:光密度).對於遵循比爾-朗伯關系的物質,A與C呈線性關系.吸收值常用下標表示其波長,如A550表示550nm處的吸收值.透過溶液的光的比例稱為透光率(T),可由出射光和入射光的比值求得.
吸收值(A)(absorbance)--由公式得出:
透光率(T)(transmittance)--通常以百分數表示:T=(I/Io)×(一)比色計比色計用於測定顏色明顯,並且是溶液主要組分的待測物,如血液中的血紅細胞,也可以在待測物之中加入一種試劑,使其形成有色產物(一種生色團),如用茚三酮法測定氨基酸含量.定量分析某種物質要做標准曲線,標准曲線是在測定待測樣品的同時測定已知含量的物質來製成的,而不是使用比爾-朗伯關系.
光源通常為鎢絲燈泡,通過一個凸透鏡聚焦後產生一束平行光,平行光穿過裝有溶液的玻璃樣品或小池,然後透過一個有色濾光片到達光電管檢測儀,檢測儀產生一個同落在光電管上的光密度成正比的電勢,來自於光電管的信號被放大然後傳遞到電流計或數字讀數器.
比色計的使用:
①接通電源使儀器穩定,使用前至少要讓燈預熱5min;② 選擇一種同底物顏色互補的濾光器;③調零(用空白對照調零);④調整靈敏度;⑤分析樣品及標准溶液;⑥由於不同比色杯的吸光特性、杯壁厚度不同,因此為了提高精確度,同一試驗應用同一比色杯,且在比色槽中擺放的方位相同;⑦每次測樣前清洗比色杯;⑧經常重復測定同一溶液檢驗比色計的可重復性;⑨用標准溶液繪制標准曲線.
由於大多數過濾器過濾出來的光的波帶很寬,因而比色計既不能用於確定某種復合物,也無法分辨在混合液中吸收特性非常相近的兩種物質.比色計所用光電管的變化系數為0.5%左右,因而不適合要求具有高度精確性的工作.使用這種最簡單的儀器,由於儀表上對數測量刻度單位的隨意性,即使是把表上的靈敏度/刻度調節到零控點,在一個儀器上獲得的值不可直接同另一台儀器上測得的值相比較,同一儀器的不同設置之間也不可直接比較.比色計對於特定波長的量化工作是不合適的.
(二)紫外光/可見光分光光度計紫外光/可見光分光光度計基本裝置中採用高強度的鎢燈作為光源,能夠在可見光范圍(400~700nm)調節.氘燈用於紫外分光光度測量(200~400nm);使用氘燈時要用石英杯,因為紫外線不能透過玻璃.
分光光度計之所以優於比色計就在於使用了一個衍射光柵將光源的復色光轉換為單色平行光束.實際上從這種單色一種產生的光不是某個波長的光,而是一段窄的帶寬上的光,帶寬是分光光度計的一個重要特性,這是由於它決定了吸收測量中所用的波長--普通分光光度計的帶寬為5~10nm,用於研究的儀器的帶寬小於因為光柵夾縫的寬度影響著帶寬,帶寬隨光柵夾縫的寬度的減少而降低,要獲得特定波長下的精確數據,盡可能使用最小的縫寬度.然而,減少了縫寬也會減少到達監測器的光度,降低了信/噪比.縫寬可減少的程度取決於檢測/放大系統的靈敏度及穩定性於離散光的存在.
大多數UV/可見光分光光度計使用的比色杯的光穿過路徑為10nm.一次性塑料杯適合於對水和乙醇溶液在可見光范圍內的測量.玻璃比色杯的生產要求更加嚴格的標准,因而在精確研究中要使用玻璃比色杯,尤其當溶液的吸收值很低時(<0.1),即使盛對照液與待測樣品液的比色杯在光學性質上有稍許不同,也會導致結果偏差.玻璃和塑料會吸收UV光,因此在測波長小於300nm的吸收值時要使用石英杯.
進行測量之前,比色杯要保證干凈,無劃痕,外表面乾燥,盛液到適當高度,並放在了比色槽中的正確位置.生物樣品中蛋白質和核酸可能會在玻璃/石英杯的內表面沉積,因而要用棉球沾上丙酮擦去比色杯內的沉澱或用1mol/L硝酸浸泡過夜.腐蝕性及毒性溶液必須使用有蓋子的比色杯,以防止濺出,破壞儀器.
基本分光光度計使用的光電管類似於比色計中所使用的光電管.許多情況下,當波長高於和低於550~600nm時必須使用不同的光電管,這是因為它們在可見光波長內的靈敏度不同,更精彩的儀器中所使用的是具有比光電管更高的靈敏度和穩定性的檢測器.數字顯示由於不易產生視覺錯誤和誤讀范圍的錯誤,正逐漸代替指針讀數.一些儀器可以直接給出所測定物質的濃度.
.紫外光/可見光分光光度計的類型:
基本分光光度計只產生單束光.這種儀器首先用空白對照調到零吸收值,然後取出空白液,加入待測液,測定待測液的吸收值.也有一種雙束分光光度計,有單色光源產生的光束被分為兩束,一束穿過待測液,另一束穿過空白液.吸收值由一個電子線路通過對比透過待測液及空白液的出射光進行測定.雙光束分光光度計減少了由於光源輸出的不穩定或檢測系統靈敏度的變化而導致的測量錯誤,這時由於待測液與對照液是同時進行測量的.記錄式分光光度計是一種雙束測定儀,用於記錄已知波段下吸收值隨時間的變化(如用於酶分析).
.分光光度計的定量分析:
假如已知一種物質在某一波長下的吸光率(通常是該物質的最大吸收值,這時靈敏度最高),這種物質純溶液的濃度可用比爾-朗伯關系式算出.摩爾吸光系數是指物質在1mol/L的濃度下,比色杯厚度為1cm時的吸收值.該值可以從光譜數據表中查到,也可以用實驗方法通過測量一系列已知濃度的物質的吸收值來繪制一條標准曲線.這樣,在所要求的濃度范圍內,便可確定吸收值與濃度之間存在的線性關系,該直線的斜率即為摩爾吸光系數.
比吸光率是指物質質量溶液濃度為10g/L時,比色杯厚度為1cm時測定的吸光值.該值對於未知分子質量的物質如蛋白質核酸的測定很有用,這種情況下溶液中物質的含量以其質量表示而不用摩爾濃度表示.使用公式Log10(Io/I)=εl[C]時,比吸光率要除以10才可以得到一個以g/L為單位的濃度值.
這種簡單的方法不能用於測定混合樣品.在這種情況下,也許可以通過測量幾個波長下的吸光度來估算每種成分的含量,如可用此方法在核酸存在下進行蛋白質含量的估算.
分光光度計的使用方法:
(1)接通電源;(2)使用前預熱15min;(3)選擇波長;(4)選擇檢測器;(5)如果可能的話,選擇正確的縫寬;(6)插入適當的空白對照;(7)調解到0%的透過率;(8)將吸光值調到零;(9)分析樣品;(10)每測量10個樣品後,用空白對照校驗零刻度;(11)檢測儀器的可重復性.

『柒』 求紫外分光光度計的校正步驟

紫外分光光度計的校正方法：分光光度法的最重要的一個物理化學量是吸光度。為了獲得准確的研究結果，准確測得樣品溶液的吸光度是非常重要的。一般，分析結果的不可靠性與偶然誤差和系統誤差有關。

偶然誤差影響測量的精密度，可通過足夠數量測量的統計處理來減少;系統誤差影響測量結果的准確度，可在大體相同實驗條件下，用比較一種物質的准確測量結果，使系統誤差統一起來。

而分光光度計的系統誤差(波長校正、分光光度計的慢散光、放大器的線性響應、暗電流和比色皿的光程)和操作誤差(溫度改變、儀器讀數、操作者的改變、使用物質的純度、稱量和濃度、pH)對測量吸光度的影響是可以檢查和校正的。

關於操作誤差，多數情況下，通過嚴格按操作程序測量、儀器調零、准確稱量等來控制或減少這種誤差的產生。關於儀器的系統誤差，可通過對分光光度計的定期校正來克服，若所需准確度很高的測量，則必須天天校正。

(7)實驗室分光度計使用步驟方法擴展閱讀

紫外分光光度計主要應用

1、鑒定物質

根據吸收光譜圖上的一些特徵吸收，特別是最大吸收波長λmax和摩爾吸收系數ε是檢定物質的常用物理參數。這在葯物分析上就有著很廣泛的應用。在國內外的葯典中，已將眾多的葯物紫外吸收光譜的最大吸收波長和吸收系數載入其中，為葯物分析提供了很好的手段。

2、與標准物及標准圖譜對照

將分析樣品和標准樣品以相同濃度配製在同一溶劑中，在同一條件下分別測定紫外可見吸收光譜。若兩者是同一物質，則兩者的光譜圖應完全一致。如果沒有標樣，也可以和現成的標 准譜圖對照進行比較。這種方法要求儀器准確，精密度高，且測定條件要相同。

3、比較最大吸收波長吸收系數的一致性

4、純度檢驗

5、推測化合物的分子結構

6、氫鍵強度的測定

實驗證明，不同的極性溶劑產生氫鍵的強度也不同，這可以利用紫外光譜來判斷化合物在不 同溶劑中氫鍵強度，以確定選擇哪一種溶劑 。