組織培養的步驟和方法

1. 簡述植物組織培養的步驟

植物組織培養方法 1 MS培養基的配製包括以下步驟。
培養基母液的配製和保存 MS培養基含有近30種營養成分，為了避免每次配製培養基都要對這幾十種成分進行稱量，可將培養基中的各種成分，按原量的20倍或200倍分別稱量，配成濃縮液，這種濃縮液叫做培養基母液。這樣每次使用時，取其總量的1/20（50 mL）或1/200（5 mL），加水稀釋，製成培養液。現將制備培養基母液所需的各類物質的量列出，供配製時使用。
大量元素(母液Ⅰ) mg／L
NH4NO3 33 000
KNO3 38 000
CaCl2·2H2O 8 800
MgSO4·7H2O 7 400
KH2PO4 3 400
微量元素(母液Ⅱ)
KI 166
H3BO3 1 240
MnSO4·4H2O 4 460
ZnSO4·7H2O 1 720
Na2MoO4·2H2O 50
CuSO4·5H2O 5
CoCl2·6H2O 5
鐵鹽(母液Ⅲ)
FeSO4·7H2O 5 560
Na2-EDTA·2H2O 7 460
有機成分(母液Ⅳ)
ⅣA
肌醇 20 000
ⅣB
煙酸 100
鹽酸吡哆醇(維生素B6) 100
鹽酸硫胺素(維生素B1) 100
甘氨酸 400
以上各種營養成分的用量，除了母液Ⅰ為20倍濃縮液外，其餘的均為200倍濃縮液。
上述幾種母液都要單獨配成1 L的貯備液。其中，母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配製方法是：每種母液中的幾種成分稱量完畢後，分別用少量的蒸餾水徹底溶解，然後再將它們混溶，最後定容到1 L。
母液Ⅲ的配製方法是：將稱好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分別放到450 mL蒸餾水中，邊加熱邊不斷攪拌使它們溶解，然後將兩種溶液混合，並將pH調至5.5，最後定容到1 L，保存在棕色玻璃瓶中。
各種母液配完後，分別用玻璃瓶貯存，並且貼上標簽，註明母液號、配製倍數、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。
MS培養基中還需要加入2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）、6-苄基嘌呤（6BA）等植物生長調節物質，並且分別配成母液（0.1 mg/mL）。其配製方法是：分別稱取這3種物質各10 mg，將2，4-D和NAA用少量（1 mL）無水乙醇預溶，將6BA用少量（1 mL）的物質的量濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液溶解，溶解過程需要水浴加熱，最後分別定容至100 mL，即得質量濃度為0.1 mg/mL的母液。
配製培養液 用量筒或移液管從各種母液中分別取出所需的用量：母液Ⅰ為50 mL，母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB各5 mL。再取2，4-D 5 mL、NAA 1 mL，與各種母液一起放入燒杯中。
配製培養液時應注意：①在使用提前配製的母液時，應在量取各種母液之前，輕輕搖動盛放母液的瓶子，如果發現瓶中有沉澱、懸浮物或被微生物污染，應立即淘汰這種母液，重新進行配製；②用量筒或移液管量取培養基母液之前，必須用所量取的母液將量筒或移液管潤洗2次；③量取母液時，最好將各種母液按將要量取的順序寫在紙上，量取1種，劃掉1種，以免出錯。
溶化瓊脂 用粗天平分別稱取瓊脂9 g、蒸糖30 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸餾水750 mL，用電爐加熱，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀。然後再將配好的混合培養液加入到煮沸的瓊脂中，最後加蒸餾水定容至1 000 mL，攪拌均勻。
調pH 用滴管吸取物質的量濃度為1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培養基中，邊滴邊攪拌，並隨時用精密的pH試紙（5.4～7.0）測培養基的pH，一直到培養基的pH為5.8為止（培養基的pH必須嚴格控制在5.8）。
2 BA為細胞分裂素 NAA 是萘乙酸，為生長素的一種
3 適於百合根的激素暫時沒找到
以下是葉片和胚的激素：對麝香百合 (LiliumlongiflorumThunb)葉片進行離體培養 ,可成功獲得無菌苗。試驗結果表明 :培養基MS +BA 0 1mg/L +NAA 1 0mg/L適於初代培養 ,有助於根和芽的分化 ;MS +BA 0 5mg/L +NAA1 5mg/L適於增殖培養 ,利於愈傷組織的產生 ,並促進芽的分化 ;生根培養基為 1/ 2MS +NAA 1 0mg/L +多效唑 10 0mg/L ;當試管苗根長 1cm時移栽易成活
在含有1 mg/ L IAA,1 m g/ L GA3,6 0 0 m g/ L CH的 MS培養基上培養 ,蔗糖含量為 6 %～ 8%時 ,百合幼胚胚性生長最好 ,培養 30 d後可以得到正常胚 .在含有 0 .1 m g/ L NAA,1 m g/ L BA的 MS培養基上可以形成淡綠色的愈傷組織 ,將這些愈傷組織轉移到 1 / 2 MS無激素的培養基上培養可以形成大量的不定芽 ,不定芽生根移栽後 ,其成活率可達90 %以上

2. 植物組織培養的步驟有哪些

准備無菌培養基，培養基里要有無機鹽，水，糖類，生長素，細胞分裂素，95%的氧氣和5%的二氧化碳
1.把植物的莖尖細胞放到培養基里
2經過脫分化到再分化，到再分化時就要放到陽光充足處，然後就讓這棵小樹苗沐浴在傑科的陽光下慢慢成長了。
唉~~~~甘都唔記得。。。。。。。。。。。。。

3. 組織培養的一般過程是怎樣的

植物細胞組織培養
一．實驗目的
植物細胞和組織培養的技術性強,要求無菌操作,通過本實驗可初步掌握常規的組織培養技術,加深對無菌操作的了解.
二．實驗原理
植物的全能性：植物體的任何一個細胞都具有生長分化成為一個完整植株的能力,稱為植物的全能性.
植物組織培養就是利用植物的全能性進行離體無菌植物培養的一門技術.植物組織培養按其原始意義,就是指愈傷組織培養.但發展至今,其范圍日益擴大,已包括植物和它的離體器官、組織、細胞和原生質體的離體無菌培養.因此,擁有幾種不同水平的培養技術,即整體的、器官的、組織的、細胞的和原生質的培養技術.它們的涵義是：
1．植株培養.指以具備完整植株形態的材料（如幼苗和較大的植株）外植體的無菌培養.
2． 胚胎培養.指以從胚珠中分離出來的成熟或未成熟胚為外植體的離體無菌培養.
3． 器官培養.指以植物的根,莖,葉,花,果等器官為外植體的離體無菌培養,如根的根尖和切段,莖的莖尖,莖節和切段,葉的葉原基,葉片,葉柄,葉鞘和子葉,花器的花瓣,雄蕊（花葯,花絲）,胚珠,子房,果實等的離體無菌培養.
4． 組織培養.指以分離出植物各部位的組織（如分生組織,形成層,木質部,韌皮部,表皮,皮層,胚乳組織,薄壁組織,髓部等）,或已誘導的愈傷組織為外植體的離體無菌培養.這是狹義的組織培養.
5． 細胞培養.指以單個的游離細胞（如用果酸酶從組織中分離的體細胞,或花粉細胞,卵細胞）為接種體的離體無菌培養.
6． 原生質體培養.指以除去細胞壁的原生質體為外植體的離體無菌培養.
本實驗選擇煙草和豌豆為材料,煙草（Nicotiana）屬茄科植物,是重要的工業原料,也是植物組織培養的四大典型實驗植物（煙草、矮牽牛、胡蘿卜、芸苔）中重要的一種,它的研究的最為廣泛,也始終領先於其他的植物材料,目前,66個煙草品種中,再生成植株的有16個種,通過花葯培養再生成花粉植株的有12個種,通過原生質體培養再生成植株的有20個種,通過煙草的種內和種間原生質體融合再生成雜種的植物分別為3個和12個種.豌豆（Pisum sativum）屬豆科植物,是糧食、飼料和重要的蔬菜作物,也是遺傳學家和植物生理學家感興趣和樂於採用的實驗植物,豌豆的根、莖、子葉、下胚軸、上胚軸、花芽等外植體,皆可形成愈傷組織,其中莖尖、幼胚、幼葉等器官可成功的再生成植株.莖尖培養可包括小至十幾微米的莖尖分生組織（生長點）和大至幾十毫米的莖尖或更大的芽培養.在實踐應用上,常採用生長點的培養使患病植物去病毒,以達到挽救優良品種,提高產量和質量之目的.
三．實驗材料
儀器設備
1．酒精燈、100ml三角燒瓶,9厘米培養皿；
2．鑷子、剪刀、解剖針；
3．雙筒解剖顯微鏡；
4．光照培養箱或溫室；
材料和試劑
1．材料 煙草無菌苗、豌豆幼苗.
2．試劑
（1）MS培養基,植物激素：NAA、6-BA等；
（2）飽和漂白粉液（次氯酸鈉）；
（3）70%酒精、100%酒精、酒精棉球；
（4）無菌水
四．實驗步驟
1．煙草無菌苗的快速切繁—繼代培養：（要求完全無菌操作）
每組一瓶煙草無菌苗,請細心操作,以免污染.
（1） 在實驗台上,點著酒精燈,將雙手用酒精棉球擦拭消毒,打開生長好無菌煙草苗的三角瓶,三角瓶的瓶口使用前後需在酒精燈外焰上燒過滅菌.
（2） 用滅菌的鑷子輕輕捏出1株幼苗,用滅菌的剪刀將無菌苗剪成0.5-1厘米的小段,要求每段至少包含一個生長點,直接剪入盛有MS培養基的三角瓶中,每一個切段必須直接接觸培養基,三角瓶口重新燒過滅菌,並重新封好口.
（3） 在光照培養箱中15~25℃,16小時光照條件下培養4周,可長成完整植株,能用於田間移栽.
2．豌豆苗的莖尖培養
⑴ 取發芽6天的豌豆幼苗10株,簡取1厘米左右的莖尖,浸入70%的酒精中1分鍾,再浸入飽和次氯酸鈉溶液中消毒15分鍾,（此步以後要求無菌）用無菌水中沖洗5次,在滅菌的濾紙上吸干水分,放入滅菌的培養皿中.
⑵ 在雙目解剖鏡下,用滅菌的解剖針剝去幼葉露出生長錐,用滅菌的解剖針挑取帶著兩至三個葉原基的生長錐.
⑶ 將挑好的莖尖移到MS+10.7μmol/L萘乙酸(NAA)+4.4μmol/L 6-苄基腺嘌呤（6-BA）的培養基上誘導愈傷組織形成,用封口膜將培養皿封好.
[4]在恆溫培養箱中,26℃下,培養六周,形成愈傷組織,經繼代後,可用於生根培養.
第46批a7 2014-12-06

4. 組織培養的具體方法是什麼

一、培養基配製 配製培養基有兩種方法可以選擇，一是購買培養基中所有化學葯品，按照需要自己配製；二是購買商品的混合好的培養基基本成分粉劑，如MS、B5等。 自己配製可以節約費用，但浪費時間、人力、且有時由於葯品的質量問題，給實驗帶來麻煩。就目前國內的情況看，大部分還是自己配製。為了方便起見，現以MS培養基為例介紹配置培養基的主要過程。 1．配製幾種母液 1．配製MS大量元素母液 一般將大量元素分別配製成100倍的母液，使用時再分別稀釋100倍。 分別稱取 NH4NO3 165g KH2PO4 17g KNO3 190g CaCl2·2H2O 44g MgSO4·7H2O 37g 各自配成1L的母液。倒入1L試劑瓶中，存放於冰箱中。 2．配製MS微量元素母液 一般將微量元素配製成100倍母液。 依次稱取 KI 0.083g Na2MoO4·2H2O 0.025g H3BO3 0.62g CuSO4·5H2O 0.0025g MnSO4·H2O 1.69g CoCl2·6H2O 0.0025g ZnSO4·7H2O 0.86g 配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放於冰箱中。 CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O 由於稱取量很小，如果天平精確度沒有達到萬分之一，可先配成調整液。 分別稱取 CuSO4·5H2O 0.05g CoCl2·6H2O 0.05g 各自配成100ml的調整液，然後取5ml就還有0.0025g的量。 3．配製MS有機母液 一般配製成100倍MS有機母液。 依次稱取 肌醇 10g 鹽酸硫胺素（VB1） 0.01g 煙酸 0.05g 甘氨酸 0.2g 鹽酸吡哆醇（VB6） 0.05g 配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放於冰箱中。 4．配製MS鐵鹽母液 一般配製成100倍MS鐵鹽母液。 依次稱取 EDTA二鈉3.73g FeSO4·7H2O2.78g 配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放於冰箱中。 所以MS母液有5種大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有機母液和MS鐵鹽母液，共8種母液。 激素母液的配製 各種生長素和細胞分裂素要單獨配製，不能混合在一起，生長素類一般要先用少量95%的酒精或1當量的NaOH溶解，細胞分裂素一般要先用1當量的鹽酸溶解，然後再加蒸餾水定容。一般取100mg配成100ml母液。 2．配製培養基 以配置1L MS培養基為例，按順序進行如下操作： 1．先在燒杯中放入一些蒸餾水。 2．分別取上面八種母液10ml倒入。 3．一般稱取30g蔗糖倒入，攪拌溶解。 4．加蒸餾水用量筒定溶至1L。 5．按設計好的方案添加各種激素，由於激素的用量很小，而且激素對組培植物的生長至關重要。所以有條件的話最好用微量可調移液器吸取，減少誤差。 6．用精密試紙或酸度計調整PH至5.7-5.8。（有條件的話使用酸度計，比較精確） 可配1當量的HCL和1當量的NaOH用來調溶液PH值。 1當量HCL配製：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。 1當量NaOH配製：稱取NaOH 4g 配成100ml溶液。 7．稱取5g左右瓊脂粉（質量好的瓊脂粉),倒入上面配好的溶液中，放在電爐上加熱至沸騰，直到瓊脂粉熔化。 8．稍微冷卻後，分裝入培養容器中。無蓋的培養容器要用封口膜或牛皮紙封口，用橡皮筋或繩子扎緊。 9．放入消毒滅菌鍋滅菌，滅菌20分鍾左右。 10．滅菌後從滅菌鍋中取出培養基，平放在實驗台上令其冷卻凝固。 二、滅菌 滅菌是組織培養重要的工作之一。初學者要清楚有菌和無菌的范疇。有菌的范疇是：凡是暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，至少它的表面都是有菌的。依此觀點，無菌室等未處理的地方、超凈台的表面、簡單煮沸的培養基、我們使用的刀、剪在未處理之前、我們身體的整個外表及與外界相連的內表，如整個消化道、呼吸道，即我們呼出的氣體、培養容器無論洗得多干凈等等都是有菌的。 這里所指的菌，包括細菌、真菌、放線菌、藻類及其他微生物。菌的特點是：極小，肉眼看不見。無處不在，無時不有，無孔不入。在自然條件下忍耐力強，生活條件要求簡單，繁殖力極強，條件適宜時便可大量滋生。 無菌的范疇是：經高溫灼燒或一定時間蒸煮過後的物體，經其他物理或化學的滅菌方法處理後的物體（當然這些方法必須已經證明是有效的），高層大氣、岩石內部、健康的動、植物的不與外部接觸的組織內部，強酸強鹼，化學元素滅菌劑等表面和內部都是無菌的。從以上可以看出：在地球表面無菌世界要比有菌世界小的多。 滅菌是指用物理或化學的方法，殺死物體表面和孔隙內的一切微生物或生物體，即把所有生命的物質全部殺死。與此相關的一個概念是消毒，它指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發生危害作用，顯然經過消毒，許多細菌芽孢、黴菌厚垣孢子等不會完全殺死，即由於在消毒後的環境里和物品上還有活著的微生物，所以通過嚴格滅菌的操作空間（接種、超凈台等）和使用的器皿，以及操作者的衣著和手都不帶任何活著的微生物。在這樣的條件下進行的操作，就叫做無菌操作。 植物組織培養對無菌條件的要求是非常嚴格的，甚至超過微生物的培養要求，這是因為培養基含有豐富的營養，稍不小心就引起雜菌污染。要達到徹底滅菌的目的，必須根據不同的對象採取不同的切實有效的方法滅菌，才能保證培養時不受雜菌的影響，使試管苗能正常生長。 常用的滅菌方法可分為物理的和化學的兩類，即：物理方法如乾熱（烘燒和灼燒）、濕熱（常壓或高壓蒸煮）、射線處理（紫外線、超聲波、微波）、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施；化學方法是使用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇水、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學葯品處理。這些方法和葯劑要根據工作中的不同材料不同目的適當選用。 1．培養基用濕熱滅菌 培養基在制備後的24小時內完成滅菌工序。高壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內溫度也隨之增加。在0.1MPa的壓力下，鍋內溫度達121℃。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。 注意完全排除鍋內空氣，使鍋內全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關閉放氣閥，通電後，待壓力上升到0.05MPa時，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零後，再關閉放氣閥。 關閥再通電後，壓力表上升達到0.1MPa時，開始計時，維持壓力0.1-0.15MPa，20分鍾。 按容器大小不同，保壓時間有所不同，見表。該表所列數字是徹底滅菌很保險的數字，如果容器體積較大，但是放置的數量很少，也可以減少時間。

5. 組織培養怎麼做，求步驟，求方法

要根據培養目的適當選取材料，選擇原則：易於誘導、帶菌少。要選取植物組織內部無菌的材料。這一方
面要從健壯的植株上取材料，不要取有傷口的或有病蟲的材料。另一方面要在晴天，最好是中午或下午取
材料，決不要在雨天、陰天或露水未乾時取材料。因為健壯的植株和晴天光合呼吸旺盛的組織，有自身消
毒作用，這種組織一般是無菌的。培養材料的消毒

從外界或室內選取的植物材料，
都不同程度地帶有各種微生物。
這些污染源一旦帶人培養基，
便會造成
培養基污染。因此，植物材料必須經嚴格的表面滅菌處理，再經無菌操作手續接到培養基上。

第一步，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細洗干凈，如用適當的刷子等刷洗。把材
料切割成適當大小，即滅菌容器能放人為宜。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鍾至數小時，沖洗時間視材料
清潔程度而宜。易漂浮或細小的材料，可裝入紗布袋內沖洗。流水沖洗在污染嚴重時特別有用。洗時可加
入洗衣粉清洗，然後再用自來水沖凈洗衣粉水。洗衣粉可除去輕度附著在植物表面的污物，除去脂質性的
物質，便於滅菌液的直接接觸。當然，最理想的清洗物質是表面活性物質
—
吐溫。

第二步是對材料的表面浸潤滅菌。要在超凈台或接種箱內完成，准備好消毒的燒杯、玻璃棒、
70%
酒
精、消毒液、無菌水、手錶等。用
70%
酒精浸
10
～
30s
。由於酒精具有使植物材料表面被浸濕的作用，
加之
70%
酒精穿透力強，也很易殺傷植物細胞，所以浸潤時間不能過長。有一些特殊的材料，如果實、花
蕾、包有苞片、苞葉等的孕穗，多層鱗片的休眠芽等等，以及主要取用內部的材料，則可只用
70%
酒精處
理稍長的時間。處理完的材料在無菌條件下，待酒精蒸發後再剝除外層，取用內部材料。

第三步是用滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類較多，可根據情況選取
1
—
2
種使用見表。第四步是用無菌
水涮洗，涮洗要每次
3min
左右，視採用的消毒液種類，涮洗
3-l0
次左右。無菌水涮洗作用是免除消毒劑
殺傷植物細胞的副作用注意：①酒精滲透性強，幼嫩材料易在酒精中失綠，所以浸泡時間要短，防止酒精
殺死植物細胞。②老熟材料，特別是種子等可以在酒精中浸泡時間長一些，如種子可以浸泡
5
分鍾。③升
汞的滲透力弱，一般浸泡
10
分鍾左右，對植物材料的殺傷力不大。④漂白粉容易導致植物材料失綠，所
以對於幼嫩材料要慎用。⑤在消毒液中加入濃度為
0.08
—
0.12%
的吐溫
20
或
80
（一種濕潤劑），可以
降低植物材料表面的張力，
達到更好的消毒效果。
滅菌劑

使用濃度
(%)
持續時間
（
min
）

去除的難易

效
果

次氯酸鈣

9~10 5~30
易

很好

次氯酸鈉

2 5~30
易

很好

氯化汞

0.1~1 5~8
較難

最好

抗菌素

4~50mg/L 30~60
中

較好

制備外植體

將已消毒的材料，用無菌刀、剪、鑷等，在無菌的環境下，剝去芽的鱗片、嫩枝的外皮和種皮胚乳等，
葉片則不需剝皮。在操作中嚴禁用手觸動材料。

接種和培養

（一）接種

在無菌壞境下，將切好的外植體立即接在培養基上，每瓶接種
1
－
2
個，以防止交叉污染。（二）封口

接種後，瓶、管用無菌葯棉或蓋封口，培養皿用無菌膠帶封口。

（三）溫度

培養基大多應保持在
25
℃左右，但要因花卉種類及材料部位的不同而區別對待。

增殖

外植體的增殖是組培的關鍵階段，
在新梢等形成後為了擴大繁殖系數，
需要繼代培養。
把材料分株或切
段轉入增殖培養基中，增殖培養基一般在分化培養基上加以改良，以利於增殖率的提高。增殖
1
個月左右
後，可視情況進行再增殖。

根的誘導

繼代培養形成的不定芽和側芽等一般沒有根，
必須轉到生根培養基上進行生根培養。
1
個月後即可獲得
鍵壯根系。

組培苗的煉苗移栽

試管苗從無菌到光、溫、濕穩定的環境進入自然環境，必須進行煉苗。一般移植前，
先將培養容器打開，於室內自然光照下放
3
天，然後取出小苗，用自來水把根繫上的營養基沖洗干凈，再
栽入已准備好的基質中，基質使用前最好消毒。移栽前要適當遮蔭，加強水分管理，保持較高的空氣濕度
（相對濕度
98
％左右），但基質不宜過濕，以防爛苗。

組織培養中的清洗、消毒滅菌技術

日期：
2010
年
4
月
1
日

來源：互聯網

作者：植物組培網

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1
、
清洗

植物組織培養用的各種玻璃器皿，
特別是培養瓶和盛培養基的器皿，
一定要嚴格清洗，
以防油污、
重金屬離子、酸、鹼等有害物質殘留在瓶內，影響培養物的生長。使用過的玻璃器皿應及時清洗，先將污
物如培養基、培養物倒掉，再浸入水中，然後洗滌。玻璃器皿的洗滌，可根據器皿的污染程度和性質，采
用不同的方法，通常有鹼洗法和酸洗法。凡有微生物污染的器皿，必須先進行高壓消毒和煮沸，以殺死菌
體，否則會產生孢子飛揚，污染環境，給組織培養帶來嚴重困難。器皿洗凈後，應烘乾或晾乾，放在規定
的地方，便於取用。

常用的滅菌方法可分為物理的和化學的兩類，即：物理方法如乾熱
(
烘燒和灼燒
)
、濕熱
(
常壓或高壓蒸
煮
)
、射線處理
(
紫外線、超聲波、微波
)
、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施；化學方法是使用升汞、甲
醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學葯品處理。這些方法和葯劑要
根據工作中的不同材料不同目的適當選用濕熱滅菌（培養基）培養基在制備後的
24h
內完成滅菌工序。高
壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內，其中的蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋
內溫度也隨之增加。在
o
．
1MPa
的壓力下，鍋內溫度達
121
℃。在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細
菌及其高度耐熱的芽孢。注意完全排除鍋內空氣，使鍋內全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有
幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關閉放氣閥，
通電後，待壓力上升到
O
．
05MPa
時，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零後，再關閉放氣閥。三
次放氣後，關閥再通電，壓力表上升達
0
．
1-0
．
15Mpa
時，維持
15-20min
。
•
對高壓滅菌後不變質的
物品，如無菌水、栽培介質、接種用具，可以延長滅菌時間或提高壓力。而培養基要嚴格遵守保壓時間，
既要保壓徹底，又要防止培養基中的成分變質或效力降低，不能隨意延長時間。對於一些布製品，如實驗
服、口罩等也可用高壓滅菌。洗凈晾乾後用耐高壓塑料袋裝好，高壓滅菌
20-30min
。高壓滅菌前後的培
養基，其
pH
值下降
0.2-0.3
單位。高壓後培養基
pH
值的變化方向和幅度取決於多種因素。在高壓滅菌
前用鹼調高
pH
值至預定值的則相反。培養基中成分單一時和培養基中含有高或較高濃度物質時，高壓滅
菌後的
pH
值變化幅度較大，甚至可大於
2
個
pH
值單位。環境
pH
值的變化大於
0.5
單位就有可能產生
明顯的生理影響。
高壓滅菌通常會使培養基中的蔗糖水解為單糖，
從而改變培養基的滲透壓。
在
8%-20%
蔗糖范圍內，高壓滅菌後的培養基約升高
0
．
43
倍。培養基中的鐵在高壓滅菌時會催化蔗糖水解，可使
15%-25%
的蔗糖水解為葡萄糖和果糖。培養基值小於
5.5
，其水解量更多，培養基中添加
0.1%
活性炭
時，高壓下蔗糖水解大大增強，添加
1%
活性炭，蔗糖水解率可達
5%
。

灼燒滅菌（用於無菌操作的器械

）
•
在無菌操作時，把鑷子、剪子、解剖刀等浸入
95%
的酒精中，使
用之前取出在酒精燈火焰卜灼燒火菌。冷卻後，立即使用。操作中可採用
250
或
500ml
的廣口瓶，放入
95%
的酒精，以便插入工具。

乾熱滅菌（玻璃器皿及耐熱用具）乾熱滅菌是利用烘箱加熱到
160-180~C
的溫度來殺死微生物。由
於在乾熱條件下，
細菌的營養細胞的抗熱性大為提高，
接近芽抱的抗熱水平，
通常採用
170
℃持續
90min
來滅菌。乾熱滅菌的物品要預先洗凈並乾燥，工具等要妥為包紮，以免滅菌後取用時重新污染。包紮可用
耐高溫的塑料。滅菌時應漸進升溫，達到頂定溫度後記錄時間。烘箱內放置的物品的數量不宜過多，以免
妨礙熱對流和穿透，到指定時間斷電後，待充分冷涼，才能打開烘箱，以免因驟冷而使器皿破裂。乾熱滅
菌能源消耗太大，浪費時間。

過濾滅菌（不耐熱的物質

）一些生長調節劑，如赤黴素、玉米素、脫落酸和某些維生素是不耐熱的，
不能用高壓滅菌處理，
通常採用過濾滅菌方法。
可用無菌的孔徑
0.20-0.45um
的硝酸纖維素膜過濾菌類，
當溶液通過濾膜後，細菌的細胞和真菌的孢子等因大於濾膜直徑而被阻，在需要過濾滅菌的液體量大時，
常使用抽濾裝置；液量小時，可用注射器。使用前對其高壓滅菌，將濾膜裝在注射器的靠針管處，將待過
濾的液體裝入注射器，推壓注射器活塞桿，溶液壓出濾膜，從針管壓出的溶液就是無菌溶液。

紫外線和熏蒸滅菌（空間）
•(1)
紫外線滅菌

在接種室、超凈台上或接種箱里用紫外燈滅菌。紫外線滅
菌是利用輻射因子滅菌，細菌吸收紫外線後，蛋白質和核酸發生結構變化，引起細菌的染色體變異，造成
死亡。紫外線的波長為
200
—
300nm
，其中以
260nm
的殺菌能力最強，但是由於紫外線的穿透物質的
能力很弱，所以只適於空氣和物體表面的滅菌，而且要求距照射物以不超過
1.2m
為宜。

(2)
熏蒸滅菌

用加熱焚燒、
氧化等方法，
使化學葯劑變為氣體狀態擴散到空氣中，
以殺死空氣和物體表
面的微生物。這種方法簡便，只需要把消毒的空間關閉緊密即可。常用熏蒸劑是甲醛，熏蒸時，房間關閉
緊密，按
5
—
8ml
／
m3
用量，將甲醛置於廣口容器中，加
5g/m3
高錳酸鉀氧化揮發。熏蒸時，房間可預
先噴濕以加強效果。冰醋酸也可進行加熱熏蒸，但效果不如甲醛。化學消毒劑的種類很多，它們使微生物
的蛋白質變性，或競爭其酶系統，或降低其表面張力，增加菌體細胞漿膜的通透性，使細胞破裂或溶解。
一般說來，溫度越高，作用時間越長，殺菌效果越好。另外，由於消毒劑必須溶解於水才能發揮作用，所
以要製成水溶狀態，如升汞與高錳酸鉀。還有消毒劑的濃度一般是濃度越大，殺菌能力越強，但石炭酸和
酒精例外

6. 組織培養的方法和程序有哪些

1.外植體的建立

（1）外植體的選取 組織培養的外植體，一般分為兩類：一類是帶芽的外植體，如莖尖、側芽、鱗芽、原球莖等，在組織培養過程中可直接誘導促進叢生芽的大量產生，其獲得再生植株的成功率較高，變異性也較小，易於保持材料的優良性狀。另一類主要為根、葉等營養器官及花葯、花瓣、花托、胚珠、果實等生殖器官。這類外植體大都需要一個脫分化過程，經過愈傷組織階段再分化出芽或產生胚狀體然後形成再生植株。

在快速繁殖上，最常用的外植體是莖尖。通常切塊在0.5厘米左右，太小，產生愈傷組織的能力較弱；太大，則在培養器皿中占空間太多。如果為培養無病毒苗而採用的外植體，通常僅取莖尖分生組織部分，其長度常在0.1毫米以下。

（2）外植體的消毒 由於外植體大都採用外界生長的植株，常帶有各種微生物，如帶入培養基，會迅速繁殖而形成污染，導致培養工作的失敗。因此，外植體消毒是必不可少的工作，消毒既要殺滅外植體上的病菌，又不能傷害材料而影響其生長。由於材料不同，栽培條件、季節等不同，不同外植體消毒應選用各自合適的消毒劑種類、消毒劑濃度、消毒時間及處理程序。

理想的消毒劑應有較強的殺菌能力，並應具有易去除而不易傷害外植體的特點。常用的有次氯酸鈉（0.5%～10%）和漂白粉（1%～10%）濾液，能分解產生具殺菌作用的氯氣，並自行散發到空氣中，只要濃度得當，一般不會傷害外植體。雙氧水（3%～10%）也易分解而不易傷害外植體。酒精（70%）具較強的滲透力和殺菌作用，且易揮發，但會殺死組織細胞，所以消毒時間不宜過長。常用酒精先消毒幾秒鍾，有利其他消毒劑滲入材料發揮殺菌作用。

消毒方法和程序因材料不同而異。通常先用酒精（70%）浸數秒，取出後置於10%次氯酸鈣飽和上清液浸10～20分鍾或2%～10%次氯酸鈉溶液浸6～15分鍾，取出後用無菌水沖洗3次。

2.外植體的增殖

外植體的增殖是組培的關鍵階段。接種後的培養容器在培養室中，一般每天光照16小時，1500～3000勒克斯，溫度在25℃左右進行分化培養。在新梢等形成後為了擴大繁殖系數，還需要進行繼代培養。把材料分株或切段轉入增殖培養基中，增殖培養基一般在分化培養基上加以改良，以利於增殖率的提高。增殖培養1個月左右後，可視情況進行再增殖，經一次又一次的繼代，即可增加植株數量。

繼代培養中由於外植體本身來自無菌環境，不需要消毒，操作較方便。但由於繼代培養中外植體分化能力會逐漸下降，所以繼代培養代數也不是無止境的。

3.根的誘導

繼代培養形成的不定芽和側芽等一般沒有根，必須轉移到生根培養基上進行生根培養。生根培養基較多用1/2MS培養基，因為降低無機鹽濃度有利於根分化。此外，生根培養基在激素種類和濃度上與增殖培養基有較大差異，主要如細胞分裂素、生長素等，一般細胞分裂素抑制生根而生長素促進生根。

一般在生根培養基中培養1個月左右即可獲得健壯根系。此外，生產中也有用具根原基試管苗，即只在生根培養基中培養7～10天，誘導根原基或小於1毫米的幼根後即用於移植。由於其基部切口已癒合而形成根原基，不易感染，且栽後能很快生根，具較高的成活率。

4.組培苗的煉苗移栽

生根或形成根原基的試管苗從無菌，光、溫、濕穩定環境中進入自然環境，從異養過渡到自養過程，必須經過一個馴化鍛煉過程，即所謂煉苗。

一般移植前，先將培養容器打開蓋子，於室內自然光照下放3天，然後取出苗，用自來水將根繫上瓊脂沖洗干凈，再栽入已准備好的基質中。基質常用泥炭、珍珠岩、蛭石、礱糠灰等或適當加部分園土，使用前最好用高溫或葯物消毒。移栽前期要適當遮蔭，加強水分管理，保持較高的空氣濕度（相對濕度90%左右）。但注意基質不宜過濕，更不能積水，以防爛苗。此外，溫度對成活率影響也很大，以15～25℃最適宜，夏季溫度過高，水少小苗易萎蔫，水多又易腐爛，管理較困難，成活率下降。煉苗4～6周，新梢開始生長後，小苗即可轉入正常管理。

7. 植物組織培養一般的的流程

植物組織培養的流程：

第一步，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細洗干凈，如用適當的刷子等刷洗。把材料切割成適當大小，即滅菌容器能放入為宜。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鍾至數小時，沖洗時間視材料清潔程度而宜。易漂浮或細小的材料，可裝入紗布袋內沖洗。

第二步是對材料的表面浸潤滅菌。要在超凈台或接種箱內完成，准備好消毒的燒杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、無菌水、手錶等。用70%酒精浸10～30秒。由於酒精具有使植物材料表面被浸濕的作用，加之70%酒精穿透力強，也很易殺傷植物細胞，所以浸潤時間不能過長。

第三步是用滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類較多，可根據情況選取1～2種使用見表。第四步是用無菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，視採用的消毒液種類，涮洗3～10次左右。

(7)組織培養的步驟和方法擴展閱讀

組織培養技術是在人為創造的無菌條件下將生活的離體器官（如根、莖、葉、莖段、原生質體）、組織或細胞置於培養基內，並放在適宜的環境中，進行連續培養以獲得細胞、組織或個體的技術。

組織培養技術原理

植物組織培養的原理是細胞全能性。也就是說每個植物細胞里都含有一整套遺傳物質，只不過在特定條件下才會表達。

組織培養基於此原理就可以將已處於分化終端或正在分化的植物組織脫分化，誘導形成愈傷組織，再在愈傷組織上形成新的叢生芽。

組織培養技術的應用

（1）改良作物：增加遺傳變異性。

（2）繁殖植物：組織培養中從一個單細胞，一塊愈傷組織，一個芽（或其它器官）都可以獲得無性系。無性系就是用植物體細胞繁殖所獲得的後代。

（3）有用化合物：有用化合物包括葯物、橡膠、香精油、色素等。這些化合物許多都是高等植物的次生代謝物，有些化合物還不能大規模地人工合成，而靠植物產生這些化合物來源有限。因此，利用組織培養方法，培養植物的某些器官或愈傷組織，並篩選出高產、高合成能力、生長快的細胞株系，以進行工業化生產，是一條行之有效的途徑。

8. 組織培養的步驟

專家解答

組織培養繁殖法是利用細胞的全能性和組織的再生能力，切取草莓植株的部分組織或器官，在無菌條件下，接種到人工配置的培養基上，使之發育成完整的植株。草莓組織培養繁殖的優點是：

（1）植株健壯結果好任何植物在長期的無性繁殖過程中都容易感染病毒，受到病毒感染的植株生活力衰退，產量降低，品質變劣。而組織培養繁殖的整個過程是在無菌環境中進行的，對於做繁殖材料的莖尖也要進行脫毒處理，這樣所得的秧苗不含或少含病毒，比一般秧苗葉片大而厚，葉色濃綠；生長健壯且整齊一致；結果期延長3周，平均增產20%左右；果個大，品質優。

（2）繁殖速度快利用組織培養法繁殖草莓，一年內一個分生組織可獲得幾千株甚至幾萬株秧苗，這種繁殖方法對加速新品種推廣，特別是對抽生匍匐莖低的品種的繁殖更為有利。

（3）繁殖不受季節限制組織培養是在操作室和配套溫室中進行的，不受外界環境條件的影響，一年四季均可生產，在人工控制條件下，可進行工廠化育苗。

（4）節省土地，利於種質保存用組織培養法繁殖是在實驗室中進行的，對露地佔用少。所以，不僅節省土地，便於管理，而且對保存種質資源更加安全。

組織培養繁殖有以下幾個步驟：

（1）配製培養基常用的培養基是MS培養基、懷特培養基，其配方見表11。

①配製母液。將營養成分中大量元素擴大10倍，微量元素擴大100倍。把大量元素、微量元素、有機生長物質分別貼上標簽，放在3～5℃環境中待用。植物生長調節劑如6-苄基嘌呤、激動素用少量0.5摩爾/升的鹽酸溶解，萘乙酸用酒精溶解，溶解後加水稀釋。

②培養基配製。將所要用的瓊脂加熱溶解，加入蔗糖攪拌，配製成瓊脂-蔗糖液。然後按量把配製好的母液置入准備好的容器中，接著把瓊脂-蔗糖液也置入同一容器中，充分攪拌，定容到規定的體積。

③調整酸鹼度。瓊脂培養基加熱滅菌時，pH會降低0.1～0.3，所以在加熱前用0.1摩爾/升的鹽酸或氫氧化鈉液調整培養基的pH。

④高溫消毒。把培養基趁熱注入試管或三角瓶內，注入量為容器容積的1/3左右，塞上棉塞，縛緊，放入高壓蒸汽鍋內滅菌。蒸汽鍋壓力維持在78.5～98千帕，時間為10～20分鍾。

單位：毫克/升序號化合物MSWhite1硝酸鉀（KNO3）1900802硝酸銨（NH4NO3）1650-3四水硝酸鈣[Ca（NO3）2·4H2O]-3004硫酸鈉（Na2SO4）-2005七水硫酸鎂（MgSO4·7H2O）3707206七水磷酸二氫鈉（NaH2PO4·7H2O）-16.57磷酸二氫鉀（KH2PO4）170-8氯化鉀（KCl）-659一水氯化鉀（KCl·H2O）440-10四水硫酸錳（MnSO4·4H2O）22.37.011七水硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）8.63.0表11營養基配方序號化合物MSWhite12硫酸鐵[Fe2（SO4）3]-2.513五水硫酸銅（CuSO4·5H2O）0.0250.00114氧化鉬（MoO3）-0.00115硼酸（H3PO3）6.21.516碘化鉀（KI）0.830.7517六水氯化亞鈷（CoCl2·6H2O）0.025-18二水鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）0.25-19肌醇10010020煙酸0.50.321鹽酸硫胺素0.40.122鹽酸吡哆醇0.50.123甘氨酸2.0324蔗糖300002000025瓊脂100001000026pH5.85.6表11營養基配方（續）-1（2）選材與消毒選取健壯植株上充實、小葉尚未展開的匍匐莖先端3厘米左右的幼嫩組織作培養材料。將材料用潔凈流動的清水沖洗0.5～1個小時，然後用70%的酒精浸泡1分鍾，再用0.1%升汞水浸泡7分鍾，最後用無菌水沖洗2～3次。

（3）接種在無菌的超凈工作台上，用鑷子去掉莖尖組織的葉片，在解剖鏡下，用消過毒的刀片切取莖尖分生組織0.3～0.5毫米大小，放入備用的培養基上。

（4）初代培養將接過種的試管或三角瓶放置在溫度25～28℃，光照強度2000勒克斯，每天照射10小時的無菌條件下進行培養。10～15天接種物開始萌發，再經7～10天接種物產生很多小芽，形成芽叢；3個月後，無根苗長至3～4厘米。這時初代培養結束。

（5）繼代培養當初代培養的無根苗長到3～4厘米時，將其取出進行生根培養。把剩下沒達到3～4厘米的芽，按3～4個芽為一個芽叢重新分開，再重新植入同種培養基（初代培養基）上進行增殖培養，這種增殖培養稱繼代培養。1個月左右新的一批無根苗又繁殖出來，再用同種方法進行下一次繼代培養。

（6）生根培養將初代培養或繼代培養的高度已達到3～4厘米的無根苗，扦插到珍珠岩內進行生根培養。生根培養的苗床溫度保持在18～20℃，空氣濕度在80%以上，珍珠岩中要噴灑營養液和生根素。20天以後，當秧苗長出3～4條，長度達1.5～2.5厘米的根系時，可進行移栽鍛煉。目前國內比較常用的營養液配方見表12。

化合物名稱園試配方化合物用量毫克/升毫摩/升元素含量（毫克/升）大量元素總計（毫克/升）Ca（NO3）.7P41MgSO4.7H2O4932Mg48S64Na2Fe-EDTA20-Fe2.8H3BO32.86-B0.5MnSO4·4H2O2.13-Mn0.05ZnSO4·7H2O0.22-Zn0.05CuSO4·5H2O0.08-Cu0.02（NH4）6Mo7O24·4H2O0.02-Mo0.01N243P41K312Ca160Mg48S64表12營養液配方註：參引2001年張福墁主編《設施園藝學》。

（7）移栽當秧苗已長出3～4條1.5～2.5厘米長新根時，可移栽到室外進行土壤育苗。移栽後的前兩周應覆蓋薄膜與覆蓋遮陽網，保持土壤和空氣濕度，緩苗後撤除覆蓋物。

提示板

組織培養能培育優質的壯苗，但技術要求比較嚴謹，目前還只在科研院所進行。隨著科技的進步，大型繁育場將逐步得到推廣。無毒育苗將是草莓苗木繁育的主要手段。

9. 植物組織培養的流程

植物組織培養的流程：

第一步，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細洗干凈，如用適當的刷子等刷洗。把材料切割成適當大小，即滅菌容器能放入為宜。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鍾至數小時，沖洗時間視材料清潔程度而宜。易漂浮或細小的材料，可裝入紗布袋內沖洗。

流水沖洗在污染嚴重時特別有用。洗時可加入洗衣粉清洗，然後再用自來水沖凈洗衣粉水。洗衣粉可除去輕度附著在植物表面的污物，除去脂質性的物質，便於滅菌液的直接接觸。當然，最理想的清洗物質是表面活性物質—吐溫。

(9)組織培養的步驟和方法擴展閱讀

培養材料採集：

要根據培養目的適當選取材料，選擇原則：易於誘導、帶菌少。要選取植物組織內部無菌的材料。這一方面要從健壯的植株上取材料，不要取有傷口的或有病蟲的材料。另一方面要在晴天，最好是中午或下午取材料，決不要在雨天、陰天或露水未乾時取材料。因為健壯的植株和晴天光合作用、呼吸作用旺盛的組織，有自身消毒作用，這種組織一般是無菌的。

培養材料的消毒：

從外界或室內選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶入培養基，便會造成培養基污染。因此，植物材料必須經嚴格的表面滅菌處理，再經無菌操作手續接到培養基上。