切蠟的方法和步驟

『壹』 石蠟切片的製作方法

腸道的石蠟切片的製作
（1）
取材：用鋒利的刀切取羅非魚的一小段前腸（據胃5cm左右位置的前腸），組織塊的規格為
3～5mm×3～5mm×10～15mm。
（2）
固定：採用Bouin氏固定液裝瓶固定，固定液用量一般為組織塊體積的10～20倍。
（3）
沖洗：固定12～24h後，將材料自固定液中取出後，在70%酒精中換洗幾次，可在酒精中加幾滴氨水至洗去黃色為止。
（4）
脫水：70%酒精（1h）→80%酒精（1h）→90%酒精（1h）→95%酒精（1h）→無水乙醇Ⅰ（1h）→無水乙醇Ⅱ（1h）
（5）
透明：無水乙醇與二甲苯溶液（1:1）（1h）→二甲苯Ⅰ（1h）→二甲苯Ⅱ
（1h）
（6）
浸蠟：浸蠟的全過程應在恆溫設備中進行，將恆溫箱調至58℃。
二甲苯與石蠟混合液（1:1）（1h）→石蠟Ⅰ（1h）→石蠟Ⅱ（1h）
浸蠟必須徹底，否則組織內殘留透明劑會造成切片過程的困難和影響切片
的質量。
（7）
包埋：在小紙盒內注入溶化的石蠟，將已浸蠟的組織塊置入其內，使蠟塊迅速冷卻硬固，組織塊在蠟塊中可長期保存。
（8）
切片：包埋後的組織塊經修整後，用切片機切成5~7μm的石蠟帶。
（9）
粘片：將組織石蠟帶在50攝氏度的溫水中展片，然後用經1%HCl溶液處理干凈的載玻片撈片，組織帶即可粘在載玻片上。
（10）
烤片：將粘好的載玻片置於35℃左右的溫箱中烤乾，待2~3小時後，即可取下編號。
（11）
蘇木精—伊紅染色：將烤乾的片進行染色。
①脫蠟：將烤乾的切片放入二甲苯(I)10min→二甲苯(Ⅱ)10rain。
②復水：將脫蠟後的切片移入100％酒精5min→95％酒精5min→85％酒精5min→70％酒精5min→蒸餾水5min
③HE染色顯示腸道黏膜上皮內淋巴細胞：將蒸餾水洗滌後的切片移入Harris蘇木精液中，10min，使細胞核著色；用自來水洗去切片上殘余染液；用1％的鹽酸酒精分色3秒；用自來水浸洗3h，顯微鏡下觀察，直到胞核藍化為止；然後切片入曙紅溶液中染色5min，使細胞質著色。經95％酒精與100％酒精脫水，二甲苯透明後，中性樹膠封片。
④奧新蘭一沙黃染色顯示腸道內肥大細胞：切片常規脫蠟下行至蒸餾水→奧新蘭一沙黃液染色15～20min→蒸餾水速洗，鏡檢→95％和100％酒精分色脫水1—2min→二甲苯透明→中性樹膠封片。
⑤阿利新蘭醋酸染色顯示腸道內杯狀細胞：切片經脫蠟下行入蒸餾水→阿利新蘭醋酸染色10min→蒸餾水洗→1％高碘酸水液氧化5min→蒸餾水略洗一Schiff試劑染色（37℃恆溫箱）30min→普通水洗3次→蒸餾水2min→Ehrlich蘇木精染色5min→95％酒精和100％酒精脫水→二甲苯透明，中性樹膠封片。
切片經脫蠟下行入水：二甲苯(30
min)一二甲苯(10
min)一無水乙醇(5
min)一無水乙醇(5
min)一
95％
乙醇(5
min)一85％乙醇(5
min)一70％
乙醇(5
min)一流水沖洗(20
min)。人Ehrlich蘇木精染
色12
min，蒸餾水速洗。鹽酸酒精分色，鏡檢控制時間。入伊紅染色2
min，蒸餾水略洗。鹽酸酒精分色，鏡檢控制時間。經95％酒精與無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。
阿利新蘭—番紅復合染色液的方法稱Scaba法
阿利新蘭—番紅分別染色的方法稱Spicer法

『貳』 石蠟切片製作過程是怎樣的

1.取材
確定所取材料的來源及部位，縱切還是橫切；
取材要迅速，防止阻止發生進一步變化，材料體積要適宜。
2.固定
（1） 固定液的選擇
最常用的固定液為FAA（萬用固定液）。
它的優點是材料固定時間不受限制，固定時間短則數小時，長則數月或數年。（可做材料保存液）
配方： 50％或70％酒精 90ml
冰醋酸 5 ml
福爾馬林 5 ml
(柔軟材料用50％酒精，堅硬材料用70％酒精配製)
（2）材料固定後的處理
沖洗或漂洗：組織固定後應充分水洗，除去留在組織內的固定液及其結晶沉澱，否則會影響以後的染色效果。
(材料固定後，若暫時不能進行下一步操作，可於70%的酒精溶液或直接與FAA固定液中，於冰箱中4℃存放。)
下圖為固定液浸泡的組織切塊。3.脫水
目的：水和透明劑不能互溶，只有脫去水分後，才能讓透明劑進入。
試劑：梯度酒精溶液
流程：70%---85%---95%--100%---
100% 每步1h-2h左右。
注意事項：保證脫水梯度和每一步脫水時間，水要完全脫凈，但也不能過度脫水（過久使組織變脆、收縮，這個時間大家可以根據自己的實驗來摸索一下，不必完全按照本操作來）。
下圖為自動組織脫水機，適於大量樣品組織脫水用。如果材料體積及樣品量較少可用小燒杯做容器來進行逐級脫水。04
4.透明
目的：純酒精不能與石蠟相溶，還需用能與酒精和石蠟相溶的媒浸液，替換出組織內的酒精。
(二甲苯是最常用的透明劑，可以很好地與石蠟互溶)
流程：二甲苯與酒精的等體積混合液1h---純二甲苯1h---純二甲苯1h。

05
5.浸蠟與包埋
目的：用石蠟取代透明劑，使石蠟浸入組織而起支持作用。
浸蠟程序:(恆溫)
（1）低溫浸蠟（36℃）：接上步，在有二甲苯和材料的燒杯中逐步加碎蠟至過飽和（石蠟不能溶解），過夜12-24h。
（2）高溫浸蠟（55-60℃，高於石蠟熔點3℃ ）：
將上步二甲苯與石蠟的混合液倒出，不要倒掉材料，將燒杯中加入純石蠟，共5-24h。純石蠟需要更換三次。
關於石蠟的選擇石蠟熔點：
對於較硬的材料，用熔點較高的石蠟進行包埋；
當切片較薄時（在8μm以下），選用熔點較高的石蠟包埋；
夏季宜採用熔點較高的石蠟（56,58℃）,冬季宜選用熔點較低的石蠟（52,54℃）。切片
傳統的切片方法是將包埋好的蠟塊用刀片修成規整的梯形，粘於小木塊上，上機切片。
新型的切片方法是將包埋框（見下圖）代替木塊的支撐作用，上機切片。
切片的厚度可以根據自己的實驗要求來確定，一般在8μm-20μm范圍內。
（下圖為傳統切片機與新型自動切片機）07
7.粘片與烤片
粘片：用粘片劑將蠟片牢附於載玻片上，防止在後續的操作中材料脫落。
在載玻片上塗抹粘片劑（甲液），再滴蒸餾水（乙液），放上蠟片，用濾紙吸取多餘的水分。
烤片：將載玻片放於40℃展片台中烤乾。
常用的粘片劑為郝伯特(Haupt) 配方：
甲液：明膠 1g 乙液：甲醛 4 ml
蒸餾水 100ml 蒸餾水 100ml
甘油 15 ml
苯酚 2g08
8.脫蠟與復水、染色
脫蠟目的：乾燥後的切片需脫蠟及復水才能在水溶性染液中進行染色。
復水目的：脫蠟後的材料，如果不經過復水，直接進入染色劑中，材料將會嚴重變形，甚至難以染色。
染色目的：使細胞組織內的不同結構呈現不同的顏色和足夠強的差異以便於觀察。
總體流程：二甲苯1/2 二甲苯+1/2純酒精100%酒精95％酒精85％酒精番紅（4h以上）95％酒精固綠（迅速）95％酒精（迅速）100%酒精1/2 二甲苯+1/2純酒精二甲苯二甲苯，以上各級約需5～10分鍾，已註明時間的除外。
染色劑：1%番紅（85%酒精配製）
0.5%固綠（95%酒精配製）09
9.切片脫水、透明和封固
接上步，在載玻片上滴加適量（1～2滴）中性樹膠，再將潔凈蓋玻片傾斜放下，進行封片。
切片放入42℃溫箱中乾燥過夜。鏡檢，將合格的切片貼上標簽。
封固劑選擇加拿大樹膠（Canada balsam）或中性樹膠
至此，植物組織的石蠟切片大功告成！

『叄』 石蠟切片法的詳細過程 和注意事項

中葯材石蠟切片製作方法：1、葯材先於水中浸潤；2、石蠟置於空燒杯中，置於加熱器上加熱至融化；3、將葯材擦乾表面水分，將其豎直置於一小容器內；4、將融化液體石蠟傾入容器中，注意要一次性加入；5、放置，待液體石蠟凝固；6、用切片機或徒手切片切制薄片
7、製片

『肆』 求助植物組織石蠟切片的正確方法

1、切片機應放置平穩，切片刀、蠟塊應安裝牢固，否則因震動而出現切片褶皺或厚薄不均。2、切片時要及時清潔刀口、除去蠟屑，否則易引起切片破碎。3、切片刀與蠟塊切面的傾斜角以5°-10°為宜，過大則切片上卷，不易連接成蠟帶；過小則切片皺起。4、切片時搖動旋轉輪速度不可過快，用力均勻、平穩。5、展片時的水溫在42-48℃之間，一般以45℃最宜；另外，還應及時清潔水中的蠟屑等雜物，防止污染切片。

『伍』 如何製作石蠟切片

1. 取材：切取一小段需要的組織，組織塊的規格為 3-5mm×3-5mm×10-15mm。
2. 固定：固定液用量一般為組織塊體積的10-20倍。
3. 沖洗：固定12-24小時後，將材料自固定液中取出後，在70%酒精中換洗幾次，可在酒精中加幾滴氨水至洗去黃色為止。
4. 脫水：70%酒精→80%酒精→90%酒精→95%酒精→無水乙醇Ⅰ（→無水乙醇Ⅱ
5. 透明：無水乙醇與二甲苯溶液（1:1）→二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ
6.浸蠟：浸蠟的全過程應在恆溫設備中進行，將恆溫箱調至58℃。
二甲苯與石蠟混合液（1:1）→石蠟Ⅰ→石蠟Ⅱ浸蠟必須徹底，否則組織內殘留透明劑會造成切片過程的困難和影響切片的質量。
7. 包埋：在盒內注入溶化的石蠟，將已浸蠟的組織塊置入其內，使蠟塊迅速冷卻硬固，組織塊在蠟塊中可長期保存。
8. 切片：包埋後的組織塊經修正後，用切片機切成5-7μm的石蠟帶。
9. 粘片：將組織石蠟帶在50攝氏度的溫水中展片，然後用經1%氯化氫溶液處理干凈的載玻片撈片，組織帶即可粘在載玻片上。
10. 烤片：將粘好的載玻片置於35℃左右的溫箱中烤乾，待2-3小時。
11. 蘇木精—伊紅染色：將烤乾的片進行染色。

『陸』 簡述石蠟切片術的製作過程

石蠟切片的製作過程主要包括：取材，固定，脫水，透明，透蠟，包埋，切片，貼片，染色，透明，封藏等步驟。
1．取材
材料的好壞直接影響到切片的質量，無論取哪一種動植物材料，以下幾點是必須注意的。
（1）植物材料選擇時須盡可能不損傷植物體或所需要的部分；動物材料取用時常對動物施以麻醉，常用的麻醉劑有氯仿和乙醚，或將動物殺死後迅速取出所需要的組織。
（2）取材必須新鮮，這一點對於從事細胞生物學研究尤為重要，應該盡可能割取生活著的組織塊，並隨即投入固定液。
（3）切取材料時刀要銳利，避免因擠壓細胞使其受到損傷。
（4）切取的材料應該小而薄，便於固定劑迅速滲入內部。一般厚度不超過2mm，大小不超過5×5mm2。
2．固定
組織和細胞離開機體後，在一定時間內仍然延續著生命活動，會引起病理變化直至歸於死亡。為了使標本能反映它生前的正常狀態，必須盡早地用某些化學葯品迅速地殺死組織和細胞，阻抑上述變化，並將結構成分轉化為不溶性物質，防止某些結構的溶化和消失。這種處理就是固定。除了上述作用外，固定劑會使組織適當硬化以便於隨後的處理，還會改變細胞內部的折射系數並使某些部分易於染色。
固定劑的作用對象主要是蛋白質，至於其他成分如脂肪和糖，在一般製作時不加考慮，如要觀察這些物質，可用特殊的方法將其固定下來。
固定劑的作用表現在對材料體積的改變、硬化的程度、穿透的速度以及對染色的影響等方面。這些作用的好壞、大小，都依所固定的材料性質而定，同樣一種固定液對某一材料來說是良好的，但對另外一些組織可能就不很適用。良好的固定劑必須具備的特徵是：穿透組織的速度快。，能將細胞中的內含物凝固成不溶解物質，不使組織膨脹或收縮以保持原形，硬化組織的程度適中，增加細胞內含物的折光度，增加媒染和染色能力，具有保存劑作用。 固定劑有簡單固定劑和混合固定劑的劃分。
簡單固定劑即單一的固定劑，常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀和鋨酸。其中，苦味酸、升汞、鉻酸既能凝固細胞清蛋白，又能凝固核蛋白；乙醇只能凝固清蛋白，而醋酸只能凝固核蛋白；甲醛、餓酸和重鉻酸鉀對這兩種蛋白質都不凝固。

『柒』 石蠟切片的石蠟切片製作基本技術

染色後的切片尚不能在顯微鏡下觀察，需經梯度酒精脫水，在95%及純酒精中的時間可適當加長以保證脫水徹底；如染液為酒精配製，則應縮短在酒精中的時間，以免脫色。二甲苯透明後，迅速擦去材料周圍多餘液體，滴加適量（1～2滴）中性樹膠，再將潔凈蓋玻片傾斜放下，以免出現氣泡，封片後即製成永久性玻片標本，在光鏡下可長期反復觀察。注意有些染料需特定廠家生產的產品。根據各種染色方法、組織類別及切片厚度，掌握適宜的染色時間，才能達到較好的染色效果。
石蠟製片程序及環節繁多，需數日才能完成1個周期，但切片可長期保存，供教學、科研及病理診斷及復察，並可利用蠟塊作其他項目的回顧性研究。病理常規製片過程中已簡化了一些細的環節或縮短了部分處理時間以適應臨床需要（可縮短至2天）。雖然冰凍切片大大快於石蠟切片，但所顯示的形態結構卻不如前者，因此病理醫生最後還需要根據石蠟切片作出准確診斷。近些年來，在病理常規製片過程中採用了微波技術，從而大大縮短了製片過程，而且對形態結構並沒有影響。微波是一種波長很短、頻率卻很高的高頻電磁波[波長為1米 ～1毫米，頻率為300兆赫（MHz）～300千兆赫（GHz）]。組織經微波輻射後加速組織內部分子的高速運動，以使液體的運輸加快，增加彌散、滲透和交換效率，從而加速組織的固定、脫水、透明、包埋和染色各個環節。例如常規福爾馬林固定需數小時～1天，而且能引起組織收縮及某些抗原成分不同程度的受到破壞，微波固定僅需1～2分鍾，且可減少抗原的丟失和損害。選擇適當的檔次（功率）、輻射時間和溫度是極為重要的。目前微波技術的應用在國內尚處於起步階段，許多技術應用環節尚需進一步摸索。 石蠟切片不僅是經典的方法，又是最基本的方法，它與其他新的技術方法相結合，使傳統的老技術擴大了應用范圍，開辟了許多新領域，增加了許多新的研究、觀察內容。隨新的儀器及新的研究技術的不斷問世及使用，使組織學的觀察研究從簡單的形態結構深入到各種成分的定性觀察，又從定性轉向定量計測，使細胞組織的形態，功能及代謝三結合，從而達到定性可靠、定位準確及定量可測。

『捌』 切蠟不均勻怎麼避免

不均勻的原因及避免和解決的辦法：
1、刀口鋒利不一，局部產生差異。可移動刀片或改用新刀口。
2、切片刀未覆蓋整個蠟塊。需調整刀口位置至刀片能切到整個蠟塊。
3、蠟塊左右硬度不一致。盡量使用鋒利的新刀口，減輕干擾。
4、組織未居蠟塊正中央。可用刀片切去部分石蠟使組織居中，或重新包埋。
5、蠟塊冷凍過度。可適度升溫，用毛筆將蠟片攤開壓住，切2至3片即成帶。
6、石蠟過硬。可加軟蠟。
7、刀口太鈍。需換新刀口。
8、刀的傾角太大。需減小傾角。

『玖』 石蠟切片製作過程有哪些步驟

石蠟切片操作步驟：

1、取材

2、固定

3、脫水：30%--50%---70%（每步60分鍾）---85%---95%--100%---100%（每步30鍾）。

4、透明：轉入1/2二甲苯＋1/2無水酒精混合液20ml透明1h，純二甲苯20ml透明1h，再用純二甲苯20ml透明40min，並回收各液。

5、浸蠟：

（1）將材料分別放入25%、50%、75%的石蠟-二甲苯溶液中，每級30分鍾。該過程在高於石蠟熔點3℃的溫箱中進行；

（2）將材料放入溶解的純蠟中，時間為30分鍾，該過程再重復兩次。在高於石蠟熔點3℃的溫箱中進行。

6、包埋

（1）將溶解好的石蠟在加入預先折好的紙船中，石蠟溶解後應過濾後使用，以免含雜質影響切片；

（2）材料放入紙船，並擺好在蠟中的位置，如果包埋的組織塊較多，應進行編號；

（3）將紙船放置在冷水上加速冷卻過程。

7、切片

（1）修整：用刀片修成方形或長方形蠟塊；

（2）以少許熱蠟液，將蠟塊底部粘附於小木塊上，以少許石蠟融化在蠟塊邊緣，加強粘附的強度；

（3）木塊粘附於切片機上，調整切片機，使蠟塊切面與切片刀刃平行；

（4）切成連續的蠟帶，切片刀的銳利度、蠟塊的硬度都會影響切片質量，可用熱水或冷水適當改變石蠟的硬度，也可在冰箱中放置一段時間；

（5）分割蠟帶，分開的蠟片放在45℃溫水上，使蠟片展開。

8、粘片與烤片

（1）可用粘片劑防止蠟片滑脫，但粘附劑通常容易被染色而使切片背景有顏色，影響觀察，實驗表明，載玻片洗的足夠干凈，一般不會滑片；

（2）用載玻片撈取展開後的蠟片，調整蠟片的位置使位於載玻片中央，自然乾燥。

9、脫蠟與醇化

（1）將切片放入純二甲苯溶液中10分鍾，使石蠟完全溶解，共2次；

（2）溶去石蠟的切片依次放入75%、50%、25%二甲苯-乙醇溶液中，每級10分鍾；

（3）再將切片依次放入100%、95%、90%、80%、70%、60%、50%的乙醇溶液中進行醇化，每級10分鍾。

10、染色

（1）將切片放入番紅染液中30分鍾，番紅染色後，將切片依次放入50%、60%、70%、80%的乙醇溶液中分級洗脫，每級10分鍾；

（2）洗脫後的切片放入固綠染液中染色1分鍾；

11、脫水、透明與封片

（1）染色後的切片依次放入90%、90%、95%、100%乙醇溶液中分級洗脫，每級10分鍾；

（2）洗脫後的切片依次放入25%、50%、75%、100%、100%二甲苯溶液中透明，每級10分鍾，出現渾濁表示脫水不徹底，需重來；

（3）滴1-2滴中性樹膠，將潔凈的蓋玻片傾斜放下，封片，鏡檢，選擇好的貼上標簽，性切片製作完成。

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