培養基配製方法在中國葯典的哪裡

『壹』 培養基灌裝的基本介紹

新建成的無菌生產線只有連續三次成功地通過培養基灌裝後，才能投入生產使用。
無菌生產工藝是制葯領域難度最大的工藝之一。由於許多葯品無法最終滅菌, 它們在進行配製、灌裝等暴露作業時就必須盡可能避免被微生物污染。而影響產品是否無菌的因素相當多, 諸如生產區的設計及其設備布局、生產時的環境狀況、所有與生產相關的設備及物料的污染狀況、人員操作和衛生狀況等, 每一個環節對最終產品的質量都舉足輕重。為了確保無菌生產工藝系統無菌的可靠性和適應性, 需通過一定的驗證方法來對其進行驗證。多數廠家採用培養基灌裝試驗來證明其無菌工藝的可靠性。2010版GMP附錄1《無菌葯品》第四十七條明確規定：「培養基灌裝容器的數量應當足以保證評價的有效性。批量較小的產品，培養基灌裝的數量應當至少等於產品的批量。培養基模擬灌裝試驗的目標是零污染，應當遵循以下要求：(一）灌裝數量少於5 0 0 0支時，不得檢出污染品。(二）灌裝數量在5 0 0 0至10000支時：1 .有1 支污染，需調查，可考慮重復試驗；2 .有2 支污染，需調查後，進行再驗證。(三）灌裝數量超過10000支時：1 .有1 支污染，需調查；2 .有2 支污染，需調查後，進行再驗證。(四）發生任何微生物污染時，均應當進行調查。」1培養基灌裝試驗的前提條件首先, 所有的相關設備及其工藝均應事先通過確認或驗證, 如潔凈生產區環境須通過靜態驗證(空氣的懸浮粒子、浮游菌、沉降菌及表面微生物均應符合相應的規定) , 操作人員的衛生及其操作行為均須經過嚴格的培訓, 生產主要設備(如灌裝機、凍干機等) 以及與生產相關的其它輔助工藝(如淋洗、濕熱滅菌、乾熱滅菌去熱源、除菌過濾等) , 均須通過確認或驗證。2培養基灌裝試驗2. 1培養基的選擇為了盡可能地檢出無菌生產工藝系統中可能會給實際產品造成污染的微生物, 所選用的培養基應盡可能適應廣譜微生物的生長, 包括細菌、黴菌和酵母菌等。驗證試驗前, 可用下述方法來鑒別驗證用培養基的可行性。首先嚴格按照培養基生產商的要求進行配製和滅菌, 然後將無菌培養基分裝至一定數量的無菌小瓶或試管內。同時, 制備好三種微生物[ 枯草芽孢桿菌(B acillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(S tap hy lococcus au reus) 和白色念珠菌(Cand id a a l2bicans) ]的懸浮液, 菌液濃度控制為100～ 1000 個菌/ml。將上述准備好的無菌培養基分成三等份, 且每份至少兩瓶(支) , 分別加入上述菌懸液各0.1 m l。將接有枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的培養基於30～ 35℃下培養, 接有白色念珠菌的培養基於20～25℃下培養。如果在7 d 內, 每種微生物培養基均至少有50% 長菌, 則認為該培養基可用於無菌工藝驗證試驗。實踐證明, 營養肉湯培養基或大豆胰蛋白腖液體培養基( soybean2casein digest medium ) 均適用於培養基灌裝試驗。2. 2培養基灌裝試驗的頻率新建的或生產工藝進行過重大更改後的無菌工藝生產線, 必須經至少連續三批合格的培養基灌裝試驗後方可證明被驗證工藝的可靠性。常規生產條件下的再驗證頻率, 每年至少兩次,每次至少灌裝一批。由於不同時間的氣候狀態不同, 務必考慮對實際生產操作的每個班次進行培養基灌裝試驗。如果因培養基灌裝試驗不合格而重新灌裝時, 灌裝時間(班次) 要與初始灌裝的時間(班次) 相同。2. 3灌裝體積和灌裝數量一般來說, 每隻容器的灌裝體積不得少於其容積的三分之一 , 這樣才能保證有足夠數量的培養基與容器的內表面充分接觸並且易於觀察到微生物的生長狀況。確定培養基的灌裝數量時須考慮以下兩個主要因素。一是應符合統計學要求, 即在95% 的置信限至少能檢出千分之一的污染率; 二是被驗證工藝的日常實際生產批量。因為實際生產批量與無菌工藝操作所持續的時間和灌裝速度密切相關, 而培養基灌裝的持續時間應足以涵蓋實際生產條件下的全部操作, 並且培養基的灌裝數量應能反映出在等於或小於實際生產的灌裝速度下產品及容器所暴露時間「最差狀況」。因此, 當某無菌生產線的實際生產批量大於5000 瓶時, 則培養基的灌裝批量不得少於5000 瓶,當無菌生產線的實際生產批量最多不超過5000 瓶時, 則按日常最大批量灌裝即可。2. 4無菌培養基的制備對於產品溶液與培養基溶液配製方法相似的無菌生產線來說, 用培養基替代產品組分完全模擬實際生產時的配液操作進行培養基配製(按培養基生產商的要求)、除菌過濾、並將除菌後的培養基溶液接入一無菌接收罐。對於那些產品溶液配製方法與培養基溶液配製方法不同或是生產粉針劑的無菌生產線來說, 可按照下述方法配製無菌培養基。在潔凈區內, 將事先稱量好的培養基加入一無菌的潔凈配製罐內, 按照培養基生產商的要求配製培養基溶液。在無菌環境下,用無菌管路將配製罐通過一已滅過菌的裝有0. 22μm濾膜(或濾芯) 的過濾器與一無菌的儲罐(儲罐頂部的通氣口應配有0. 2 μm 的疏水性過濾器) 連接起來, 通過加壓或減壓將培養基溶液經除菌過濾後轉移至無菌儲罐內。過濾結束後, 檢查除菌過濾器的完好性, 如果檢查結果合格, 則無菌培養基制備完成。2. 5無菌灌封模擬實際灌裝作業進行培養基灌裝。灌裝容器及膠塞應盡可能與常規生產時一致。灌裝時, 最好能模擬實際生產時的最差狀況, 如設備維修、操作人員的更換等, 以掌握在實際生產條件下產品污染的真實資料。對粉針劑生產線而言, 為了驗證實際生產狀態下的粉末灌裝, 可用適當的無菌粉末模擬灌裝, 再向瓶內注入無菌培養基。用於驗證試驗的粉末要求流動性好、易溶於培養基並且沒有抑菌作用, 如乳糖或甘露醇等; 粉末滅菌可採用輻射滅菌法或環氧乙烷滅菌法; 灌裝時, 每瓶內的粉末量不宜過多, 否則會對培養基溶液的促菌生長造成不良影響, 實踐證明,每5 m l 液體培養基內乳糖含量不宜超過0. 3 g。對水針劑而言, 灌裝培養基後可直接壓塞。對凍干劑而言, 灌裝後, 只進行半壓塞, 模擬實際操作將半壓塞瓶轉移至凍干機內。培養基的冷凍溫度不得低於3℃, 因為溫度過低會使一些微生物死亡或受到損傷, 造成污染水平降低的假象, 就不能如實反映無菌工藝的實際無菌水平。模擬凍干時, 適當進行部分真空和充氮保護模擬(請注意, 真空度不宜過高,否則會引起培養基暴沸; 充氮過量會抑制需氧性微生物的生長)。凍干結束後, 在腔室內全壓塞, 然後卸出並轉移至壓蓋間壓蓋。將壓完蓋的培養基上下顛倒幾次以使培養基與膠塞及整個容器內壁充分接觸。從壓塞至最終的培養檢查, 應將盛裝培養基瓶的托盤容器做好標記, 以便對所出現的偏差進行追溯。2. 6培養和計數將壓好蓋的培養基先置於20-25℃培養至少7天，然後在30！35繼續培養7天。培養期間, 可定期對灌裝培養基進行目檢, 記下每次檢出的污染瓶數及出現污染菌的相應托盤編號。檢查時將每瓶培養基在有白色光源的黑色背景下仔細目測。透明、澄清、無混濁的培養基判為無微生物生長; 如培養基混濁或有懸浮的菌絲或菌落, 則需作進一步的微生物生長檢查, 以確定培養基是否真正染菌。對已確定有微生物生長的培養基瓶進行仔細檢查, 看其中是否有破損, 有破損的培養基瓶不得納入最終的結果評價。每批灌裝培養基的污染率可按下式計算:
污染率% = 污染的培養基瓶數×100/(灌裝總瓶數- 破損瓶數)2. 7污染菌的鑒別將培養基瓶中的污染菌在適當的培養基(如大豆胰蛋白腖瓊脂、營養瓊脂等) 上劃線和分離培養。挑取單個菌落進行形態學觀察、革蘭氏染色等初步鑒別。如果需要對培養基灌裝結果作進一步調查, 那麼將污染菌鑒別到種, 這對偏差調查將起到非常關鍵的作用。尋找污染菌與其它資料(如環境監控資料) 間的相關性是無菌工藝偏差調查的有效手段。2. 8培養基靈敏度檢查從每批灌裝好的培養基中隨機抽取適量培養基, 按照中國葯典(或美國葯典) 無菌檢查法中的培養基靈敏度檢查法, 分別向培養基中接入下列試驗菌懸液, 每個菌株至少接種兩瓶灌裝培養基, 每瓶接種量為10～ 100 個菌。表1培養基靈敏度試驗用微生物 微生物名稱 菌株編號 培養溫度（℃） 金黃色葡萄球菌1 CMCC（B） 2603 30-35 藤黃微球菌2 CMCC(B) 28001 30-35 白色念珠菌 CMCC(F) 98001 20-25 黑麴黴菌 ATCC 16404 20-25 1可用枯草芽孢桿菌(B acillus subtilis)A TCC 6633 替代;2可用銅綠假單胞菌(P seud om onas aerug inosa)A TCC 9027 替代。將接有上述微生物的培養基置於相應溫度下培養, 每種菌株在7 d 內應至少有一瓶出現明顯生長,否則可復試一次。如果靈敏度檢查結果不合格, 該批培養基灌裝試驗無效, 須重新試驗。
2. 9環境控制無菌生產區的環境確認和驗證是無菌生產工藝驗證的前提條件。而培養基灌裝時的環境監控資料對整個工藝驗證的評價和偏差分析將起到非常關鍵性的作用。培養基灌裝時的環境監控項目及取樣數量均不得少於常規生產時的監控項目和取樣數量。將日常的環境監控資料匯總, 並與培養基灌裝時的環境監控資料以及培養基灌裝結果相結合進行趨勢分析, 不僅能對企業所執行的清潔、消毒方案以及人員衛生規范作出客觀評估, 而且可以為合理制定適合於本企業內部的環境控制標准(警戒標准和糾偏標准) 提供依據。
2. 10合格標准和污染概率培養基灌裝結果的評價是無菌生產工藝驗證中的一個焦點。由於對合格標準的理解存在差異, 同一個數據往往會導致不同的結論。美國葯典(U SP 24)對無菌葯品的污染率作如下規定:
最終滅菌葯品的無菌保證水平(SAL ) 不得低於10- 6, 即污染率不得超過百萬分之一;無菌灌裝葯品的無菌保證水平(SAL ) 不得低於10- 3, 即污染率不得超過千分之一。
實踐證明, 對設計合理並且生產操作環境得到良好控制的無菌生產線而言, 其產品污染率維持在千分之一以內並不難。企業須通過培養基灌裝試驗來證明其無菌生產線所生產的無菌產品的污染概率始終維持在這一水平下。值得注意的是, 驗證結果表明無菌保證水平達到10- 3, 並不表示葯政部門允許上市產品每1000 瓶中可以有1 瓶是污染品。相反, 這只不過是通過驗證數據計算出的可接受的污染概率的理論值。
3偏差調查及糾偏措施驗證試驗結果不合格是無菌工藝驗證中的最大難題。這需要進行大量的偏差調查並採取有效的糾偏措施。根據實際經驗, 在此列出了一套出現偏差後的調查方法及糾偏措施。3. 1偏差調查1) 檢查所有與培養基灌裝用物品相關滅菌設備的驗證資料和滅菌記錄;2) 檢查培養基灌裝時的環境監控資料, 包括空氣懸浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物以及操作人員的衛生監測資料;3) 將培養基中污染菌和環境監測時所監測到的微生物逐一鑒定到種, 並比較各個污染菌彼此間的相關性;4) 檢查相關產品無菌試驗結果呈陽性的歷史資料, 看其污染菌與培養基驗證試驗中的污染菌是否一致;5) 檢查以往的培養基灌裝資料, 看其中的污染菌是否重復出現;6) 檢查培養基灌封用容器及膠塞的完好性;7) 檢查培養基灌裝時無菌潔凈區的壓差記錄,是否符合常規;8) 檢查培養基灌裝時的維修和清潔記錄;9) 檢查培養基灌裝時的批生產記錄和設備運行記錄等。3. 2糾偏措施務必要仔細回顧和分析所有的培養基灌裝資料及其相關資料, 以准確找出本次偏差的真正原因。盡管環境監測時能監測到微生物, 但多數情況下, 也很難發現其與實際偏差有直接的相關性。一旦出現偏差並完成其調查後, 須立即實施糾偏計劃。以下列出了一些在實施糾偏計劃時的基本操作程序。1) 增加培養基的灌裝數量和環境監測數據以查明污染源;2) 加強無菌生產環境的清潔和消毒措施;3) 增加灌裝前靜態下的環境監測數據以檢查無菌環境條件的可靠性;4) 用培養基中的污染菌對消毒劑進行挑戰性試驗, 以檢查污染菌是否對消毒劑有耐受性;5) 分別於灌裝前、灌裝時及灌裝後, 增加對操作人員的衛生監控(手套表面微生物和操作服表面微生物) ;6) 增加培養基的灌裝批次, 以檢查所出現的偏差是否具有偶然性。4小結我國目前已經建立無菌生產工藝的無菌保證標准和驗證標准, 隨著與國際接軌的需要, 我們須了解和掌握國外的先進技術、標准和經驗, 才能加快提高我國葯品在國際市場上的競爭力, 增加葯品出口。本文重點介紹的培養基灌裝試驗只是無菌生產工藝驗證中的一種方法, 反映了該領域在當今國際上的先進水平和要求。但是, 由於無菌工藝本身的多樣性和復雜性, 很難對其中的每個細節面面俱到, 文中僅對培養基灌裝試驗中常見的共性問題進行了闡述。
參考資料：1、2010版《葯品生產質量管理規范》附錄1《無菌葯品》
2、 無菌生產工藝驗證——培養基灌裝試驗

『貳』 培養基預培養葯典出處

培養基預培養葯典出處：改良馬丁培養基被哪個培養基替換葯典2015。

培養基的容積不易過大，否則容易滅菌不徹底。正常情況下培養基容積越大，滅菌時間是要適當延長，但不能時間過長。雖然書上說正常滅菌鍋滅菌條件是121°C，20分鍾。但這要根據實際的培養基容積和培養基成分（佔主要因素）來合理設定滅菌時間的。

培養基

由於配製的原料不同，使用要求不同，而貯存保管方面也稍有不同。一般培養基在受熱、吸潮後，易被細菌污染或分解變質，因此一般培養基必須防潮、避光、陰涼處保存。對一些需嚴格滅菌的培養基（如組織培養基），較長時間的貯存，必須放在3-6℃的冰箱內。由於液體培養基不易長期保管，均改製成粉末。

『叄』 培養基的配製

培養基的配製：

1、稱量和熬煮

按培養基配方逐一稱取去皮土豆。土豆切成小塊放入鍋中，加水1000ml，在加熱器上加熱至沸騰，維持20-30min，用可用2層紗布趁熱在量杯上過濾，濾渣棄取。

2、加熱溶解

把濾液放入鍋中，加入葡萄糖20g，瓊脂15～20g(提前搞碎)，然後放在石棉網上，小火加熱，並用玻棒不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，待瓊脂完全溶解後，再補充水分至所需量。

3、分裝

按實訓要求，將配製的培養基分裝入試管或500ml三角瓶內。分裝時可用三角漏斗以免使培養基沾在管口或瓶口上造成污染。

4、加棉塞

培養基分裝完畢後，在試管口或三角燒瓶口上塞上棉塞(或泡沫塑料塞或試管帽等)，以阻止外界微生物進入培養基內造成污染，並保證有良好的通氣性能。

5、包紮

加塞後，將全部試管用麻繩或橡皮筋捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道線繩或橡皮筋紮好，用記號筆註明培養基名稱、組別、配製日期。

培養基配製注意事項：

1、培養基經滅菌後，必須放在37C溫箱培養24h，無菌生長者方可使用。

2、PDA培養基一般不需要調pH。對於要調節pH的培養基，一般用pH試紙測定其pH。如果培養基偏酸或偏鹼時，可用lmol/LNaOH或lmol/LHCL溶液進行調節。

3、調節時應逐滴加入NaOH或HCl溶液，防止局部過酸或過鹼破壞培養基成分。

4、培養基在使用時也可以做成不含瓊脂的液體培養基，用於菌類的震盪培養。

5、培養基也可以加入氯黴素或土黴素，加入量為0.2g/L培養基，主要是為了抑制細菌的生長，減少干擾性。

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培養基，是指供給微生物、植物或動物（或組織）生長繁殖的，由不同營養物質組合配製而成的營養基質。

一般都含有碳水化合物、含氮物質、無機鹽（包括微量元素）、維生素和水等幾大類物質。培養基既是提供細胞營養和促使細胞增殖的基礎物質，也是細胞生長和繁殖的生存環境。

培養基種類很多，根據配製原料的來源可分為自然培養基、合成培養基、半合成培養基。

根據物理狀態可分為固體培養基、液體培養基、半固體培養基；根據培養功能可分為基礎培養基、選擇培養基、加富培養基、鑒別培養基等。

根據使用范圍可分為細菌培養基、放線菌培養基、酵母菌培養基、真菌培養基等。培養基配成後一般需測試並調節pH，還須進行滅菌，通常有高溫滅菌和過濾滅菌。

培養基由於富含營養物質，易被污染或變質。配好後不宜久置，最好現配現用。

『肆』 配製培養基的步驟

1、配製溶液

向容器內加入所需水量的一部分，按照培養基的配方，稱取各種原料，依次加入使其溶解，最後補足所需水分。對蛋白腖、肉膏等物質，需加熱溶解，加熱過程所蒸發的水分，應在全部原料溶解後加水補足。

配製固體培養基時，先將上述已配好的液體培養基煮沸，再將稱好的瓊脂加入，繼續加熱至完全融化。並不斷攪拌，以免瓊脂糊底燒焦。

2、調節pH值 

用pH試紙（或pH電位計、氫離子濃度比色計）測試培養基的pH值，如不符合需要，可用10%HCl或10%NaOH進行調節，直到調節到配方要求的pH值為止。

3、過濾

用濾紙、紗布或棉花趁熱將已配好的培養基過濾。用紗布過濾時，最好折疊成六層，用濾紙過濾時，可將濾紙折疊成瓦棱形，鋪在漏鬥上過濾。

4、分裝

已過濾的培養基應進行分裝。如果要製作斜面培養基，須將培養基分裝於試管中。如果要製作平板培養基或液體、半固體培養基，則須將培養基分裝於錐形瓶內。

分裝時，一手捏松彈簧夾，使培養基流出，另一隻手握住幾支試管或錐形瓶，依次接取培養基。分裝時，注意不要使培養基粘附管口或瓶口，以免浸濕棉塞引起雜菌污染。

裝入試管的培養基量，視試管和錐形瓶的大小及需要而定。一般製作斜面培養基時，每隻15×150毫米的試管，約裝3～4毫升（1/4～1/3試管高度），如製作深層培養基，每隻20×220毫米的試管約裝12～15毫升。每隻錐形瓶裝入的培養基，一般以其容積的一半為宜。

5、加棉塞 

分裝完畢後，需要用棉塞堵住管口或瓶口。堵棉塞的主要目的是過濾空氣，避免污染。棉塞應採用普通新鮮、乾燥的棉花製作，不要用脫脂棉，以免因脫脂棉吸水使棉塞無法使用。

製作棉塞時，要根據棉塞大小將棉花鋪展成適當厚度，揪取手掌心大小一塊，鋪在左手拇指與食指圈成的圓孔中，用右手食指插入棉花中部，同時左手食指與姆指稍稍緊握，就會形成1個長棒形的棉塞。

棉塞作成後，應迅速塞入管口或瓶口中，棉塞應緊貼內壁不留縫隙，以防空氣中微生物沿皺折侵入。棉塞不要過緊過松，塞好後，以手提棉塞、管、瓶不下落為合適。棉塞的2/3應在管內或瓶內，上端露出少許棉花便於拔取。塞好棉塞的試管和錐形瓶應蓋上厚紙用繩捆札，准備滅菌。

6、製作斜面培養基和平板培養基

培養基滅菌後，如製作斜面培養基和平板培養基，須趁培養基未凝固時進行。

(1)製作斜面培養基。在實驗台上放1支長0.5～1米左右的木條，厚度為1厘米左右。將試管頭部枕在木條上，使管內培養基自然傾斜，凝固後即成斜面培養基。

(2)製作平板培養基。將剛剛滅過菌的盛有培養基的錐形瓶和培養皿放在實驗台上，點燃酒精燈，右手托起錐形瓶瓶底，左手拔下棉塞，將瓶口在酒精燈上稍加灼燒，左手打開培養皿蓋，右手迅速將培養基倒入培養皿中，每皿約倒入10毫升，以鋪滿皿底為度。

鋪放培養基後放置15分鍾左右，待培養基凝固後，再5個培養皿一疊，倒置過來，平放在恆溫箱里，24小時後檢查，如培養基未長雜菌，即可用來培養微生物。