qpcr檢測DNA方法步驟

『壹』 pcr的技術的主要步驟及pcr引物設計的一般原則有哪些

PCR的技術的主要步驟及PCR引物設計的一般原則分述如下：

PCR的技術的主要步驟：

1、DNA變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。

2、退火：（60℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。

3、延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

每一循環經過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。現在有些PCR因為擴增區很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內復制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度。

2、引物設計的基本原則

1、引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。

2、引物鹼基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。

3、引物內部不應出現互補序列。

4、兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免3 ′端的互補重疊。

5、引物與非特異擴增區的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續8個鹼基在待擴增區以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。

6、引物3『端的鹼基，特別是最末及倒數第二個鹼基，應嚴格要求配對，最佳選擇是G和C。

7、引物的5 ′端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質、地高辛標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

(1)qpcr檢測DNA方法步驟擴展閱讀

PCR技術的基本原理 類似於DNA的 天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

PCR是一種體外DNA 擴增技術，是在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴於DNA聚合酶的酶促合反應，將待擴增的DNA片段與其兩側互補的寡核苷酸鏈引物經「高溫變性——低溫退火——引物延伸」三步反應的多次循環，使DNA片段在數量上呈指數增加，從而在短時間內獲得我們所需的大量的特定基因片段。

在環境檢測中，靶核酸序列往往存在於—個復雜的混合物如細胞提取液中，且含量很低，對於探測這種復雜群體中的特異微生物或某個基因，雜交就顯得不敏感。使用PCR技術可將靶序列放大幾個數量級，再用探針雜交探測對被擴增序列作定性或定量研究分析微生物群體結構。PCR技術常與其他技術結合起來使用， 如RT-PCR、競爭PCR、巢式PCR、RAPf)、ARDRA等。

第一代PCR就是常見的定性PCR技術，它採用普通PCR儀來對靶基因進行擴增，採用瓊脂糖凝膠電泳來對產物進行分析。第二代PCR就是熒光定量PCR技術（Real-Time PCR，qPCR），它通過在反應體系中加入能指示反應進程的熒光試劑來實時監測擴增產物的積累，藉助熒光曲線的Cq值來定量起始靶基因的濃度。

第三代PCR技術--數字PCR（Digital PCR，dPCR，Dig-PCR），是一種全新的對核酸進行檢測和定量的方法。它採用直接計數目標分子而不再依賴任何校準物或外標，即可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數目。

PCR晶元技術PCR儀器發展的趨勢之一變得更加微型化，PCR晶元就是在這種趨勢下誕生的。PCR晶元就是在微型的載體上進行PCR反應，是微型化的PCR儀。晶元PCR不僅節省了大量反應試劑因此降低了實驗成本，還有助於提高反應速度。

『貳』 簡述RT-qPCR的原理,簡要說明其操作步驟及在臨床科研中的應用

摘要 提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，採用0ligo (dT)或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCR 使測的靈敏性提高了幾個數量級，使- - 些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術主要用於:分析基因的轉錄產物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統。

『叄』 如何通過qpcr看一個基因的表達豐度

一般來講，進行real-time qPCR MasterMix都是2×的濃縮液，只需要加入模板和引物就可以。由於real-time qPCR靈敏度高，所以每個樣品至少要做3個平行孔，以防在後面的數據分析中，由於Ct相差較多或者SD太大，無法進行統計分析。通常來講，反應體系的引 物終濃度為100-400mM；模板如果是總RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情況下是1ul或者1ul的10倍稀釋液，要根據目的基因 的表達豐度進行調整。當然這些都是經驗值，在操作過程中，還需要根據所用MasterMix，模板和引物的不同進行優化，達到一個最佳反應體系。在反應體 系配置過程中，有下面幾點需要注意：

1. MasterMix不要反復凍融，如果經常使用，最好溶解後放在4度。

2. 更多的配製Mix進行，減少加樣誤差。最好能在冰上操作。

3. 每管或每孔都要換新槍頭！不要連續用同一個槍頭加樣！

4. 所有成分加完後，離心去除氣泡。

5. 每個樣品至少3個平行孔。

參比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（現在已經是ABI的注冊商標了！）或者其他染料，只要不影響檢測PCR產物的熒光值就可以。參比染料的作用是標准化熒光定量 反應中的非PCR震盪，校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差，提供一個穩定的基線。現在很多公司已經把ROXTM配製在MasterMix或者 Premixture里。如果反應曲線良好或已經優化好反應體系，也可以不加ROXTM染料校正。

通常來講，real-time qPCR的反應程序不需要像常規的PCR那樣，要變性、退火、延伸3步。由於其產物長度在80-150bp 之間，所以只需要變性和退火就可以了。SYBR@Green等染料法，最好在PCR擴增程序結束後，加一個溶解程序，來形成溶解曲線，判斷PCR產物的特 異性擴增。而溶解程序，儀器都有默認設置，或稍有不同，但都是一個在產物進行溶解時候，進行熒光信號的收集。

3. 儀器設置

所有儀器的操作都基本一致。設置的時候包括反應板設置（plate setup）和程序設置（program setup）。我們以 ABI StepOne為例，詳細看一下反應設置：

A. 首先是實驗目的選擇：定量還是其他。我們命名為「BioTeke」，進行「定量」實驗。

B. 實驗方法的選擇：我們選用的比較Ct的SYBR Green方法， Fast程序，以cDNA為模板進行。

C. 目的基因的設置：有幾個目的基因和目的基因的名稱。

D. 樣品的設置：包括哪個是實驗組，哪個是對照組。以及負對照的設置和生物重復的設置。

E. 對照組和內參基因的設置：這個是為後面的定量做准備

F. 反應程序的設置：PCR反應程序的設置要根據不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分鍾就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10 分鍾）。循環反應是95℃15秒，60℃15秒的40個循環。溶解曲線程序採用儀器默認設置就可以。或者是儀器說明書上建議的程序。

G. 反應體系的設置：

A-G這五個步驟簡單設置好，可以保存，修改反應程序或者立刻進行反應。

需要注意一點ABI儀器需要加ROX參比染料，默認的是ROX。有些公司是把ROX或者其他染料配製在MasteMix裡面；也有的是單獨分開。要根據不 同公司的MasterMix進行這一個步驟的選擇。BioTeke的MasterMix里沒有參比染料，所以選擇「none」。

設置好之後，就可以把配置好的PCR管放進儀器，點擊RUN！

五、Real-time qPCR數據分析

1. Real-time qPCR常見參數

基線（baseline）

通常是3-15個循環的熒光信號

同一次反應中針對不同的基因需單獨設置基線

閾值（threshold）

自動設置是3-15個循環的熒光信號的標准偏差的10倍

手動設置：置於指數擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強。

同一次反應中針對不同的基因可單獨設置閾值，但對於同一個基因擴增一定要用同一個閾值。

Ct值:與起始濃度的對數成線性關系。

分析定量時候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導致定量的不準確。

Rn（Normalized reporter）是熒光報告基團的熒光發射強度與參比染料的熒光發射強度的比值。

△Rn：△Rn是Rn扣除基線後得到的標准化結果（△Rn=Rn-基線）。

2.影響Ct值的關鍵因素

模板濃度

模板濃度是決定Ct的最主要因素。控制在一個合適范圍內，使Ct在15-35之間。

反應液成分的影響

任何分子的熒光發射都受環境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度。

PCR反應的效率

PCR反應的效率也會影響Ct值。在PCR擴增效率低的條件下進行連續梯度稀釋擴增，與PCR擴增效率高的條件下相比，可能會所產生斜率不同的標准曲線。PCR效率取決於實驗、反應混合液性能和樣品質量。一般說來，反應效率在90-110%之間都是可以接受的。

3. 如何評估實時定量PCR反應的效果

PCR擴增效率：為了正確地評估PCR擴增效率，至少需要做3次平行重復，至少做5個數量級倍數(5logs)連續梯度稀釋模板濃度。

常見問題

1. 無Ct值出現

檢測熒光信號的步驟有誤: 一般SG法採用72℃延伸時採集，Taqman法則一般在退火結束時或延伸結束採集信號。

引物或探針降解: 可通過PAGE電泳檢測其完整性。

模板量不足: 對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。

模板降解: 避免樣品制備中雜質的引入及反復凍融的情況。

2. Ct值出現過晚（Ct>38）

擴增效率低: 反應條件不夠優化。設計更好的引物或探針；改用三步法進行反應；適當降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。

PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足。

PCR產物太長: 一般採用80-150bp的產物長度。

3. 標准曲線線性關系不佳

加樣存在誤差: 使得標准品不呈梯度。

標准品出現降解: 應避免標准品反復凍融，或重新制備並稀釋標准品。

引物或探針不佳: 重新設計更好的引物和探針。

模板中存在抑制物，或模板濃度過高

4. 負對照有信號

引物設計不夠優化：應避免引物二聚體和發夾結構的出現。

引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，並注意上下游引物的濃度配比。

鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。

模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設計避免非特異擴增。

5. 溶解曲線不止一個主峰

引物設計不夠優化：應避免引物二聚體和發夾結構的出現。

引物濃度不佳：適當降低引物的濃度，並注意上下游引物的濃度配比。

鎂離子濃度過高：適當降低鎂離子濃度，或選擇更合適的 mix 試劑盒。

模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設計避免非特異擴增。

6. 擴增效率低

反應試劑中部分成分特別是熒光染料降解。

反應條件不夠優化：可適當降低退火溫度或改為三步擴增法。

反應體系中有PCR反應抑制物：一般是加入模板時所引入，應先把模板適度稀釋，再加入反應體系中，減少抑制物的影響。

7. 同一試劑在不同儀器上產生不同的曲線，如何判斷？

判斷標准：擴增效率，靈敏度，特異性

如果擴增效率在90%-110%，都是特異性擴增，都可以把數據用於分析。

8. 擴增曲線的異常？比如「S」型曲線？

參比染料設定不正確(MasterMix不加參比染料時，選NONE)

模板的濃度太高或者降解

熒光染料的降解

熒光定量PCR問題匯總

1. 定量PCR儀的開關機順序是怎樣的？

按照正確的開關機順序操作，有助於延長儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。

開機順序：先開電腦，待電腦完全啟動後再開啟定量PCR儀主機，等主機面板上的綠燈亮後即可打開定量PCR的收集軟體，進行實驗。

關機順序：確認實驗已經結束後，首先關閉信號收集軟體，然後關掉定量PCR儀主機的電源，最後關閉電腦。

2. 哪些種類的反應管和蓋子適合定量PCR實驗使用？有何需要注意的地方？

定量PCR實驗可以使用以下耗材：96孔光學反應板配合光學膜，0.2 ml光學八聯反應管配合光學膜，0.2 ml光學八聯反應管配合平蓋的光學八聯管蓋。ABI公司生產的定量PCR耗材的具體使用方法和貨號見下表：

3. 為什麼要定期對電腦進行磁碟碎片整理？怎樣整理？

當運行實時定量PCR儀及使用軟體分析實驗結果時，計算機會刪除並創建若干文件，計算機硬碟的空閑空間會被分割成越來越多的小塊。當硬碟驅動器上文件以 分解的碎片存儲時，程序需要更長的時間才能存取文件，因為必須多次尋找文件碎片以存取不同的片斷。碎片整理實用程序將一個文件分解開的多個碎片合並在一 起，並存儲到硬碟的同一個位置，從而清除文件碎片，進而優化系統性能。

碎片整理的方法如下：

· 在Windows桌面上，選擇開始(start)，我的電腦(My computer)。

· 在(我的電腦)窗口中，用滑鼠右鍵單擊硬碟驅動器，並選擇(屬性)property。

· 在(屬性)對話框中選擇工具(Tools)選項卡，單擊開始整理(Defragment now)。

· 單擊碎片整理(Defragment)。

· 當顯示「碎片整理完畢」對話框時，單擊（確定）。

· 在「本地磁碟屬性」對話框中，單擊（確定）。

· 為計算機機中剩餘的驅動器重復如上步驟。

4. 何時執行windows service pack更新？

不要執行該操作。除非美國應用生物系統公司代表通知您更新操作系統，否則請不要更新控制定量PCR 儀的計算機的操作系統。新版本的Microsoft Windows操作系統有可能與SDS 軟體存在沖突，並導致儀器不能正常運行。如果您希望安裝service pack（更新包）以更新操作系統，應查看隨SDS 軟體提供的版本說明，避免兼容性問題。

5. 應該備份哪些數據？

應該定期備份您的實驗數據，備份頻率推薦每周一次，用光碟刻錄。同時您也應該備份定量PCR儀的各種純熒光光譜校正文件、背景文件和安裝驗證實驗數據，這些文件所在的目錄是C:/Appliedbiosystems/SDS Document。下圖是校正文件的樣本。

6.怎麼樣的實驗室環境才能保證儀器設備正常運行？

良好的實驗室環境有助於延長儀器的使用壽命，減少儀器出故障的頻率。推薦做到以下幾個方面：

電源：推薦配備合適的UPS或穩壓器。

通風：儀器的通風應該沒有阻擋。

溫度：推薦實驗室配備空調，溫度應該控制在10-30°C之間。

濕度：20-80%；對於潮濕的省份，推薦實驗室配備除濕機。

空間：易於操作，安全。

7. 怎樣判斷定量pcr儀的樣本加熱塊是否被污染？怎樣清除污染？

一個辦法是運行背景校正反應板，當一個或多個反應孔連續顯示出不正常的高信號，則表明該孔可能被熒光污染物。

另外一種辦法是在不放任何物品到樣本塊上的前提下，執行ROI的校正，當某個孔的信號明顯高出其他孔時，則表明該孔被污染。

清除樣本加熱塊污染的步驟如下：

用移液器吸取少量乙醇並滴入每個污染的反應孔中。

吹打數次。

將廢液吸入廢液杯中。

重復以上步驟：乙醇三次，去離子水三次。

確認反應孔中的殘留液體蒸發完。

8. 什麼是背景校正？多長時間執行一次背景校正？

背景校正程序測量定量PCR儀所使用的反應管和水的空白熒光強度。在運行校正程序期間，定量PCR儀在10分鍾內連續讀取背景校正板的熒光強度，信號收 集的溫度為60°C。隨後，SDS軟體計算所收集到的熒光強度的平均值，提取結果並保存到校正文件中。軟體在今後的分析中將自動調用此校正文件，從實驗數 據中扣除背景信號。

因為背景熒光的信號強度隨著許多外界因素（比如外來的污染、反應板/反應管的生產廠商不同、水的純度等）而變化，所以推薦定期進行背景校正，一般每三個月到半年校正一次。

9. 什麼是純熒光校正？多長時間校正一次？

純熒光校正是測定各種純熒光染料標准品的波長和信號強度，通俗地說是讓儀器「認識」各種熒光染料。軟體收集並儲存各種純熒光染料標准品的熒光信息。以後 每次定量實驗運行過程中，SDS軟體收集樣品的原始光譜信號，並將此原始光譜與純熒光文件中的數據進行比較，精確扣除不同染料的信號重疊部分，從而確定樣 品中的熒光染料種類和信號強度。

推薦每半年進行一次純熒光校正。在運行光譜校正之前，請先進行背景校正和ROI校正。

10.96孔板怎樣封膜？

當使用96孔板做實驗的時候，推薦使用光學膜代替蓋子來密封反應孔。正確的封膜方法是：先沿著96孔板的縱向壓膜，然後橫向，最後沿著板的邊緣按壓使之密封。

11.使用單管或8連管做實驗時，在樣品加熱塊上應該怎樣安排放置？

使用單管或8連管做實驗，並且樣本數量不多的時候，建議在樣品加熱塊(TRAY)上對稱地安放樣品，最好是縱向放置，並且優先放在第6列或第7列，然後 逐漸向兩邊放置。這樣做的好處是熱蓋壓下來的時候不至於發生傾斜，各個反應管的受力和受熱都比較均勻，提高孔與孔之間的數據精密性.

12. 絕對定量與相對定量有什麼區別？

絕對定量的目的是測定目的基因在樣本中的分子數目，即通常所說的拷貝數。相對定量的目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數。

舉例來說，如果研究項目中包括處理過的和未經處理的對照樣本，通常可以將未經處理的樣本指定為基準，規定其目的基因濃度為100%，將經處理的樣本的定量結果除以對照樣品的定量結果，就可以計算各個處理樣本的基因含量相對於未處理樣品的百分比。

絕對定量實驗必須使用已知拷貝數的絕對標准品，必須做標准曲線。相對定量可以做標准曲線，也可以不做標准曲線。

相對定量實驗有兩種方法：標准曲線法和CT值比較法。如果使用標准曲線法，可以使用絕對標准品，也可以使用相對標准品，而且相對標准品在實驗操作上更為 簡便易行。相對標准品是只知道樣品中DNA或RNA的稀釋比例而不需要知道其分子數目的標准品，典型的做法是將一個已知pg數的樣品做一系列梯度稀釋。

CT值比較法是利用CT值與起始DNA濃度的對數成反比的數學關系，來計算不同樣本之間的相對百分比，其計算公式是。

絕對定量的數據易於理解，但是絕對標准品的制備和測定其DNA含量比較困難。有許多商業性的標准品試劑盒供選購，可以解決這種困難。

相對定量的標准品容易在實驗室里自己制備，但是數據處理比較麻煩，對實驗數據的解釋有一定難度。

13. 定量PCR基因表達的實驗數據應該如何處理？

總的來說，有三個層次的校正是必須要做的。

首先，參比信號校正。試劑中必須包含固定濃度的ROX，這樣由於反應總體積的差異、所在孔的位置不同、試管壁的厚度差異、管蓋透光性能的差異等所引起的 熒光信號波動都能夠被扣除，使數據真正反映PCR進程。ROX校正能夠極大地改進定量的精確度，提高重復管之間的數據重現性。

其次，內對照校正。實驗中加入樣品基本上都是以體積為單位的，但是同樣體積的不同樣品很可能來自不同數目的細胞，所以將實驗結果校正到每個細胞的含量是 必要的。方法是在定量目的基因（如IL-2）的同時定量一個內對照基因（如18S RNA基因），然後IL-2/18S。內對照校正使不同樣品的實驗數據可以相互比較。

第三，計算相對於基準樣品(Calibrator)的相對基因含量。比如研究處理和未處理的、0小時和6小時的、正常和患病的之間的基因表達的差別，則需要計算處理/未處理、6小時/0小時、患病/正常。

14. 標准曲線法相對定量的數據應該怎麼處理？

假設實驗的目標是研究葯物處理後0、24、48小時IL-2基因在某種組織中的表達量的變化，所用的內對照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的測定結果都是總RNA的pg數，數據的處理方法見下表：

15.什麼是CT值比較法？數據怎麼處理？

CT值與起始DNA濃度的對數成反比：

如果(1)不同管之間的PCR反應效率相同；(2)這些PCR的反應效率接近100%，可以從上面的公式推出相對含量(X01/X02) = 2 -ΔΔCT。假設實驗的目標是研究葯物處理後0、24、48小時IL-2基因在某種組織中的表達量的變化，所用內對照是18S RNA基因。IL-2和18S RNA的測定結果都是CT值，而沒有通過標准曲線測定總RNA的pg數。

16. 每個反應管中可以加入多少種探針？

每個反應管中可以加入的探針數目，取決於儀器、軟體、試劑和實驗設計等幾個方面。

首先是儀器的硬體構成和軟體的解析能力。在軟體解析能力足夠的前提下，全波長檢測的定量PCR儀如激光管-CCD類型對於探針的數量實際上是沒有限制 的。如果信號的採集要通過濾色片，那麼探針的數量取決於濾色片的數目，增加探針需要增加或改變濾色片。改動儀器的結構通常很困難。以AB公司的儀器為 例，7900和7700是激光-全波長檢測的，7000、7300是4色濾色片的，7500是5色濾色片的。

其次是化學上的可能性。不同的熒光基團要組合到一起，在同一反應管內使用，必須其激發波長既相對靠近又不能靠得太近，既保證信號激發的效率又保證信號不 重疊干擾，能夠區分清楚。現已發現的熒光基團種類有限，滿足這樣條件的分子組合更少。目前的最佳組合只能達到每組4到5種熒光的水平。

第三是實驗方案的設計和選用的探針類型。定量PCR實驗必須使用ROX校正熒光，佔去一種熒光；TaqMan探針的淬滅基團(TAMRA)也要佔用一種 熒光，對於4色檢測的儀器來說，只剩下2種熒光可以標記探針，對於5色檢測的儀器還有3種熒光可以使用。如果將探針改用TaqMan MGB探針，由於它的淬滅基團是不發熒光的，比之TaqMan探針就可以多1種熒光用於標記探針。如果實驗要求不高，不做ROX校正（AB公司不推薦這樣 做），還可以再多一種熒光用於標記探針。

第四是研究應用本身的要求。如果研究SNP和基因突變，因為絕大多數人類基因是2態的，只存在兩種等位基因，2條探針已經足夠。如果研究基因表達，通常是兩兩比較居多，比如處理比未處理，正常比異常等，加上一個內對照，3色也就足夠了。

最後是成本控制方面的要求。多重定量的目的一是提高數據精確度，二是節省反應成本。同時測定的基因越多，成本也越低。但是加入4-5種探針，就要同時加 入8-10條引物。在引物設計的時候要考慮到盡量減少這些引物之間的競爭和抑制等多種干擾，平衡各對引物之間的PCR效率。雖然這是可以做到的，但是要花 費大量時間、人力和物力來篩選最佳引物組合、優化反應條件。如果實驗規模不大，在總體上可能反而不合算。

在實際應用中，不是單純追求加入的探針越多越好，而是追求總體效益的最優化。比較切合實際的是2到3重反應，引物和探針的設計不太困難，反應條件的優化也不太麻煩，同時降低了成本。

17. 等位基因鑒定實驗（比如SNP分型）是定性的研究，是否可以不進行ROX熒光校正？

不，等位基因鑒定實驗也要進行ROX熒光歸一，以保證實驗結果的精密可靠。

由於試劑加樣操作的誤差、離心管熱量傳遞的誤差、離心管蓋透光性能的誤差等偶然因素是不可避免的，必然導致熒光激發效率的差異，因此儀器收集到的原始信號必須進行歸一化校正，相互之間才可以比較並保證重現性。

這種校正是通過在反應緩沖液中添加ROX校正熒光來實現的。ROX在反應緩沖液中的濃度是固定的，因此其信號的高低變化只與上述物理方面變化的總體效應有關。將報告熒光的信號除以ROX熒光的信號，就能夠消除所有這些物理因素所引起的數據波動。

18. 內標法和外標法哪種數據更精密？

是同樣可靠的。內標的優點在於目標基因與管家基因的反應條件最接近一致，缺點在於目標基因與管家基因的引物和探針相互之間會發生競爭與抑制，導致它們的 PCR效率有差異。外標的優點在於目標基因與管家基因的引物和探針之間沒有發生競爭與抑制的機會，但是不同管之間的反應條件差異比同管的要大，也會導致它 們的PCR效率有差異。兩相比較，內標法與外標法的數據精確度是一樣的。

『肆』 qpcr原理及應用是什麼

一、原理

DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據鹼基互補配對原則復製成同樣的兩分子拷貝。

在實驗中發現，DNA在高溫時也可以發生變性解鏈，當溫度降低後又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，加入設計引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。

但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術的應用和發展。

耐熱DNA聚合酶-Taq酶的發現對於PCR的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術得以大量應用，並逐步應用於臨床。

PCR技術的基本原理類似於DNA的天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：

1、 模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

2、 模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

3、 引物的延伸：DNA模板-引物結合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈；

重復循環變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的「半保留復制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鍾，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

二、應用

1、基因表達分析：例如結核分岔桿菌（Mycobacterium tuberculosis）是一種生長相當緩慢的細菌，傳統培養及鑒定一般需要花數周時間。

2015年時Watanabe Pinhata和Cergole-Novella以自己發展的real time PCR檢測mpt64，直接檢測病人痰液中的結核分岔桿菌，分析715個檢體657個病人，其檢測靈敏度（sensitivity）及特異性（specificity）分別為90.3%及98.6%。

整個實驗流程可以在5個小時內完成，此方法可以用於沒有套裝試劑（kit）可以使用的實驗室。

2、檢驗生物晶元的結果；

3、siRNA與miRNA診斷；

4、基因型鑒定；

5、飲食分析；

6、獸醫微生物檢測。

特點

1、熒光實時定量PCR的基本原理有兩個要點：首先是對PCR反應中的每一個循環的反應產物進行實時檢測並記錄下來；

其次，用於檢測PCR產物實時檢測的熒光染料標記在一段可以與單鏈PCR產物(模板)特異性雜交的探針上，並且處於淬滅狀態，只有當探針與模板特異性結合以後才有可能釋放出熒光信號。

2、每一輪循環中PCR的產出量都以熒光信號的形式被PCR儀的光學檢測系統記錄下來，在某一循環中熒光信號的強度達到預先設定的閾值時，此時的循環數稱為CT(Threshold Cycle)，Ct值與起始的模板量成反比，起始的核酸量越多，達到閾值的循環數就越少，換句話說CT值會越小。

如果要確定量的話，需要做出標准曲線，以Ct值為縱坐標，起始模板數為橫坐標作圖。在新的MIQE規范中Ct這個慣用的名詞被重新定義為Cq值(quantification cycle)。

『伍』 簡述PCR技術操作步驟

PCR即聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction）的縮寫，它是體外酶促合成特異DNA片段的方法。這一方法的要點是合成兩個分別互補於待擴增DNA片段兩端的小片段引物，在含有引物、待擴增DNA模板核苷酸底物和DNA多聚酶的反應體系中DNA復制反復進行，在短時間內可以取得大量擴增產物。其原理是寡聚核苷酸鏈引物在DNA聚合酶的作用下沿模板延伸，合成兩個與靶DNA兩側序列互補的引物，在體外進行靶DNA的重復合成。
主要的技術步驟是：
（1）DNA變性 加熱使靶DNA序列雙鏈解離成單鏈DNA。
（2）引物與靶DNA退火 適當降低溫度，使兩個引物分別結合成靶DNA兩條的3′末端向5′末端延伸。
（3）引物延伸 在DNA聚合酶的催化下，引物沿著靶DNA3′末端向5′末端延伸。新合成的DNA鏈在變性解離後，又可作為模板與引物雜交，並且在DNA聚合酶的催化下，引導合成新的靶DNA鏈。如此反復進行以上3個步驟，即可使靶DNA片段指數性擴增。

『陸』 PCR的反應包括三個主要步驟

PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：

1、模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

2、模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

3、延伸：DNA聚合酶由降溫時結合上的引物開始沿著DNA鏈合成互補鏈。此階段的溫度依賴於DNA聚合酶。該步驟時間依賴於聚合酶以及需要合成的DNA片段長度。

傳統的Taq估計合成1000bp大概需要1分鍾、較新的Tbr（來自於嗜熱菌Thermusbrockianus）約40秒、商業公司生產的融合型聚合酶僅需約10-15秒。有修正功能的則會比較慢。

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實例

優化聚合酶鏈式反應:

在實踐中，聚合酶鏈式反應可以因各種原因而失敗，部分原因是由於其對於污染的敏感性，導致擴增錯誤的DNA產物。正因為如此，人們已經開發了一些技術和步驟來優化聚合酶鏈式反應條件。將聚合酶鏈式反應前的混合物與潛在DNA污染物分開的實驗室方案和流程解決了外源DNA的污染問題。

這通常包括從用於分析的區域分理出聚合酶鏈式反應的設定區域或者說聚合酶鏈式反應產物的純化，一次性塑料製品的使用，及對反應裝置之間的工作檯面徹底清潔。引物的設計技術在改善聚合酶鏈式反應產物產率和避免雜產物的形成是很重要的。

替代緩沖成分和聚合酶的使用有助於較長或存在其他問題的DNA區域的擴增。在緩沖體系中加入試劑，如甲醯胺，或會增加聚合酶鏈式反應的特異性和產量。可以利用計算機模擬理論聚合酶鏈式反應結果（電子聚合酶鏈式反應），以協助在引物設計。

『柒』 pcr擴增的原理和步驟

實驗方法原理

①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至94℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做准備；

②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。

重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的「半保留復制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鍾， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

典型的PCR包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三個步驟，通過將這一套過程不斷循環，使DNA得以成百萬倍的擴增。

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PCR技術，即聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）是由美國PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年獲諾貝爾化學獎）建立的。

這項技術可在試管內的經數小時反應就將特定的DNA片段擴增數百萬倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術在分子生物學研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動了生命科學的研究進展。

它不僅是DNA分析最常用的技術，而且在DNA重組與表達、基因結構分析和功能檢測中具有重要的應用價值。

PCR可以被認為是與發生在細胞內的DNA復制過程相似的技術，其結果都是以原來的DNA為模板產生新的互補DNA片段。細胞中DNA的復制是一個非常復雜的過程。參與復制的有多種因素。PCR是在試管中進行的DNA復制反應，基本原理與細胞內DNA復制相似，但反應體系相對較簡單。

PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至94℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做准備；

②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。

重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的「半保留復制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鍾， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

『捌』 pcr實驗詳細步驟是怎麼樣的

1、模板的取材主要依據PCR的壙增對象，可以是病原體標本如病毒、也可以是病理生理標本如細胞等。

2、標本處理的基本要求是除去雜質，並部分純化標本中的核酸。多數樣品霓要經過SDS和蛋白 酶K處理。難以破碎的細菌，可用溶菌酶加EDTA處理。

3、引物最好在模板cDNA的保守區內設計，引物長度一般在15~30鹼基之間，引物長度常用的是18~27 bp，但不應大於38，因為過長會導致其延伸溫度大於74℃，不適於Taq DNA 聚合酶進行反應

4、引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃，GC含量過高或過低都不利於引發反應。上下游引物的Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度

5、引物3』端要避開密碼子的第3位，引物3′端不要終止於密碼子的第3位，引物3′端不能選擇A，最好選擇T，引物3′端錯配時，不同鹼基引發效率存在著很大的差異。

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PCR能快速特異擴增任何已知目的基因或DNA片段，並能輕易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因擴增達到納克、微克、毫克級的特異性DNA片段。因此，PCR技術一經問世就被迅速而廣泛地用於分子生物學的各個領域。

通過DNA基因追蹤系統，能迅速掌握患者體內的病毒含量，其精確度高達納米級別，精確檢測乙肝病毒在患者體內存在的數量、是否復制、是否傳染、傳染性有多強、是否必要服葯、肝功能有否異常改變。

能及時判斷病人最適合使用哪類抗病毒葯物、判斷葯物療效如何、給臨床治療提供了可靠的檢驗依據。

重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的「半保留復制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。

『玖』 qpcr rt-qpcr rt-pcr步驟有區別嗎1

QRT PCR一般指以RNA為模板，先逆轉成cDNA，再進行qPCR
而qPCR一般是泛指，既可以當它是qRTPCR，也可以指他是專門定量檢測DNA的
比如檢測細菌的16S，那不需要做RT，直接用qPCR檢測定量即可。